Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây bán hạ roi – typhonium flagelliforme ( lodd) blume ( araceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bạch Tuyết Mai NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme (LODD) BLUME (ARACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bạch Tuyết Mai NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme (LODD) BLUME (ARACEAE) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến ThS Lê Quý Thƣởng toàn thể quý thầy, cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh nhƣ q thầy khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tƣ̣ nhiên đã giúp đỡ ta ̣o điề u kiê ̣n cho tơi hồn thành chƣơng trình học tập thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè, ngƣời đô ̣ng viên và tạo điề u kiê ̣n th ̣n lơ ̣i cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luâ ̣n văn Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Học viên cao học MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thuốc 1.2 Các hợp chất thứ cấp có thực vật 1.2.1Alkaloids 1.2.2Flavonoids 1.2.3Tannins 1.2.4 Glycoside 1.2.5Saponins 1.3 Khái quát họ Ráy ( Araceae ) 1.4 Giới thiệu chung Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme) 1.4.1Đặc điểm hình thái 1.4.2 Các hợp chất 1.4.3Phân loại Phân bố 1.4.4Hoạt tính sinh học Bán hạ roi 1.5 Khái quát phƣơng pháp tách chiết 12 1.5.1 Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật 12 1.5.2Phƣơng pháp tách chiết 13 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu 16 2.2 Hóa chất 16 2.3 Thiết bị thí nghiệm 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Định tính nhóm chất lồi Bán hạ roi 17 2.4.2 Phƣơng pháp chiết mẫu 21 2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 23 2.4.4 Phân lập chất từ dịch chiết Bán hạ roi 25 2.5 Phƣơng pháp thống kê 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết định tính nhóm chất Bán hạ roi 27 3.2 So sánh dịch chiết Bán hạ roi 28 3.2.1 Dịch chiết Bán hạ roi với EtOH 28 3.2.2 Dịch chiết Bán hạ roi với MetOH 29 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học Bán hạ roi 29 3.3.1 Kết thử hoạt tính DPPH 30 3.3.2 Kết thử độ độc tế bào 30 3.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân đoa ̣n dich ̣ chiế t từ bán hạ roi 32 3.4 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ Bán hạ roi 32 3.4.1 Chất TF1 33 3.4.2 Chất TF2 37 3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học chất phân lập đƣợc từ Bán hạ roi 41 3.5.1 Hoạt tính chống oxy hố chất phân lập đƣợc 41 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết 42 3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoa ̣n dich ̣ chiế t từ bán hạ roi 43 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh phƣơng pháp tiền tách chiết 13 Bảng 1.2 So sánh phƣơng pháp tách chiết truyền thống 14 Bảng 1.3 So sánh phƣơng pháp tách chiết đại 15 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất loài Bán hạ roi 27 Bảng 3.2 Khối lƣợng cặn chiết phân đoạn Bán hạ roi với EtOH 29 Bảng 3.3 Khối lƣợng cặn chiết phân đoạn Bán hạ roi với MetOH 29 Bảng 3.4 Giá trị EC50 phép phân tích DPPH với dịch chiết Bán hạ roi 30 Bảng 3.5 Giá trị of IC50 với dịch chiết Bán hạ roi với dòng tế bào ung thƣ 30 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoa ̣n dich ̣ chiế t 32 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR (CDCl3) hợp chất TF1 Stigmast-4-en3-one 36 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR TF2 hợp chất tham khảo 39 Bảng 3.9 Kế t quả thƣ̉ hoa ̣t tiń h chố ng oxy hoá của các ch ất phân lập 42 Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào chất phân lập từ Bán hạ roi 42 Bảng 3.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập Bán hạ roi 43 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nicotine Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo flavonoid Hình 1.3 Công thức cấu tạo tannin Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo glycoside Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo cortisol Hình 1.6 Bán hạ roi (T flagelliforme) Hình 2.1 Mẫu bột Bán hạ roi 22 Hình 2.2 Quy trình ngâm chiết Bán hạ roi 23 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan nồng độ DPPH mật độ quang học 24 Hình 3.1 Dịch chiết Bán hạ roi với EtOH dung môi n-hexane (1), EA (2) MetOH (3) 28 Hình 3.2 So sánh giá trị IC50 dịch chiết: n-hexane DCM với dòng tế bào ung thƣ 31 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết Bán hạ roi 33 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 34 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35 Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35 Hình 3.7 Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất TF1 35 Hình 3.8 Cơng thức cấu tạo TF1 37 Hình 3.9 Phổ H-NMR chất TF2 40 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR chất TF2 40 Hình 3.11 Phổ DEPT chất TF2 41 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất TF2 stigmasterol 41 BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ASE ATCC Ý nghĩa Kỹ thuật chiết nhanh với dung môi Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ DCM Dichloromethane Distortionless Enhancement by Polarisation DEPT DMEM DMSO DPPH EA EtOH FBS FT-IR Hep - G2 IUCN KB Lu MAE MetOH MTT NCI NCI-H23 NMR SFE UAE v/v w/v Transfer Môi trƣờng Dulbecco’s Modified Eagle Dimethyl sulfoxide 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Ethyl acetate Ethanol Huyết phơi bò Phổ hồng ngoại Ung thƣ gan Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên Tài nguyên Thiên nhiên Ung thƣ biểu mơ Ung thƣ phổi Kỹ thuật chiết lò vi sóng Methanol 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, diphenyltetrazolium bromide Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa kỳ Dòng tế bào ung thƣ phổi ngƣời Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Kỹ thuật chiết siêu tới hạn Kỹ thuật chiết sóng siêu âm Thể tích / Thể tích Khối lƣợng / Thể tích MỞ ĐẦU Cây trồng đóng vai trò quan trọng sống đặc biệt nghành Y, Dƣợc chúng khơng làm giảm nhiễm mà phƣơng thuốc để điều trị nhiều chứng bệnh khác nhằm nâng cao sức khỏe cho ngƣời dân phòng chống số bệnh hiểm nghèo Có khoảng 4.700 lồi đƣợc sử dụng làm thuốc Trong dân gian có nhiều thảo dƣợc nhƣ sản phẩm thiên nhiên đƣợc sử dụng trực tiếp để làm thuốc chữa bệnh làm tiền chất cho tổng hợp hóa dƣợc.Mỗi lồi trị nhiều loại bệnh khác dựa hợp chất hoạt tính sinh học lồi Ví dụ: Diếp cá dùng để trị ho, lô hội dùng để trị mụn, trinh nữ hoàng cung dùng để giảm thiểu ung thƣ buồng trứng ung thƣ cổ tử cung, bán hạ roi đƣợc dùng để trị ho suyễn, khí nghịch đàm thấp thủy ẩm, thấp trệ trung tiêu, nôn mửa bụng đầy, đinh nhọt, sƣng tấy Ngoài ra, bán hạ có nhiều cơng dụng khác nhau.Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết xác định thành phần hoạt chất sinh học có bán hạ roi nói chung chi Typhoniumnói riêng nhằm sử dụng điều trị bệnh quan trọng góp phần cung cấp thêm sản phẩm thuốc có lợi cho sức khỏe ngƣời dân Bán hạ roi thảo dƣợc thuộc họ Ráy đƣợc trồng rộng rãi Ấn Độ, Úc, Sri Lanka, Indonesia nƣớc châu Á khác có nhiệt độ trung bình [26] Gần đây, cho thấycác nhóm hợp chất thứ sinh nhƣ flavonoid, saponin, alkaloid terpenoid loài đƣợc nghiên cứu, tìm hiểu [9] Một số hợp chất hóa học bán hạ roi đƣợc tinh xác định cấu trúc [9] Các dịch chiết từ bán hạ roi đƣợc xác định có chứa hợp chất có hoạt tính chống lại phát triển nhiều dòng tế bào ung thƣ [20] Một số nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết bán hạ roi có hoạt tính chống oxi hóa [10,16] Tại Việt Nam, nhiều thuốc dân gian lƣu truyền bán hạ roi dùng để trị ho, long đờm Tuy nhiên đến nay, nghiên cứu chuyên sâu Bán hạ roi chƣa nhiều, đặc biệt nghiên cứu hoạttính sinh học từ hợp chất đƣợc tinh Do đó, nghiên cứu chúng tơi tập trung vào phân lập hợp chất từ bán hạ roi, xác định nhóm chất nhƣ tinh hợp chất vàđánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết từ bán hạ roi từ hợp chất đƣợc tách − Phổ 13 C-NMR phổ DEPT chất TF1 (Hình 3.7)có tín hiệu 29 nguyên tử carbon, có nhóm CH3, 11 nhóm CH2, nhóm CH nguyên tử carbon bậc Hình 3.4Phổ 1H-NMR chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 34 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) Hình 3.7 Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất TF1 Phổ 1H- 13C-NMR chất TF1 hoàn toàn phù hợp với phổ stigmast4-en-3-one [14] (Bảng 3.7) Do đó, TF1 stigmast-4-en-3-one (Hình 3.8) 35 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất TF1 Stigmast-4-en-3-one STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 δC 35,7 34,0 199, 123, 171, 33,0 32,1 35,7 53,9 38,6 23,1 39,7 42,4 55,9 26,2 28,2 56,1 12,0 19,1 36,1 17,4 33,9 24,2 45,9 29,2 19,8 18,7 24,2 12,0 Chất TF1 δH(J=Hz) 2,26 (1H, ddd, J=2.4, 3.9, 14.5 Hz, H-2A) δC 34,8 32,8 Stigmast-4-en-3-one δH(J=Hz) 198,5 5,72 (1H,br.s, H-4) 122,7 5,72 (1H, s, H-4) 170,5 0,71 (3H, s, CH3-18) 1,18 (3H, s, CH3-19) 0,86 (3H, d, J=7,4 Hz, CH3-21) 0,82 (3H, d, J=6,7 Hz, CH3-26) 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27) 0,92 (3H, t, J=6,3 Hz, CH3 -29) 36 31,9 31,0 34,6 52,7 37,5 22,0 38,5 41,3 54,9 25,0 27,1 54,9 10,9 18,0 35,0 16,3 32,9 23,1 44,7 27,1 18,7 17,6 23,1 10,9 0,71(3H, s, H-18) 1,18(3H, s, H-19) 0,84 (3H, d, 7,4Hz, H-21) 0,82 (3H, d, 6,7Hz, H-26) 0,84 (3H, d, 7,0Hz, H-27) 0,92(3H, t, J=6,4Hz, H-29) Hình 3.8Cơng thức cấu tạo chất TF1 Stigmast-4-en-3-one làm hạ đƣờng huyết để điều trị tiểu đƣờng type II Trong nghiên cứu Abildgaard cộng (2003) [5], stigmast-4-en-3-one nguyên liệu quan trọng sản xuất hc mơn tổng hợp đƣợc sử dụng nhƣ chất làm mềm sản phẩm giấy 3.4.2 Chất TF2 Chất TF2 thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 155-157oC Trên phổ ESI-MS chất TF2 xuất pic ion 395,3 [M -H2O+H]+ phù hợp với cơng thức phân tử C29H48O Phổ 1H-NMR (hình 3.9) thấy xuất tín hiệu nhóm methyl bậc ba δH 0,84 (s), 1,03 (s); nhóm methyl bậc hai δH 0,91 (d, J = 6,5 Hz), 0,81 (d, J = 6,8 Hz), δH 0,86 (3H, d, J = 9,5 Hz) nhóm methyl bậc δH 0,84 (t, J = 8,5 Hz) Trên phổ xác nhận có mặt nhóm β-OH (δH 3,53, m, H-3) C-3 Trên phổ xác nhận có mặt liên đơi δH 5,32 (br s) liên kết đôi trans khác δH 5,15 (dd, 8,5, 15,0)/ 5,02 (dd, 8,5, 15,0) Phổ 13C-NMR phổ DEPT (hình 3.10 hình 3.11) TF2 xuất 29 tín hiệu cacbon, gồm có cacbon bậc bốn, 11 nhóm methine, nhóm methylen nhóm methyl đặc trƣng khung sterol Đặc biệt, tín hiệu hai cặp olefin 37 đƣợc xác nhận C-5 (δC 140,75)/C-6 (δC 121,73) C-22 (δC 138,33)/C-23(δC 129,27) Dựa vào phân tích (bảng 3.8 hình từ 3.9 đến hình 3.11) kết hợp so sánh số liệu phổ 13 C-NMR TF2 với số liệu đƣợc công bố stigmasterol thấy hoàn toàn phù hợp Nhƣ vậy, chất TF2 đƣợc khẳng định stigmasterol (hình 3.12) 38 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR TF2 hợp chất tham khảo # δC δC DEPT 37,21 37,25 CH2 31,62 31,66 CH2 71,81 71,81 CH 42,29 42,30 CH2 140,72 140,75 C 121,71 121,73 CH 31,87 31,90 CH2 31,87 31,90 CH 50,08 50,15 CH 10 36,48 36,51 C 11 21,07 21,09 CH2 12 39,64 39,77 CH2 13 42,29 42,30 C 14 56,83 56,87 CH 15 24,34 24,37 CH2 16 28,92 28,93 CH2 17 55,90 56,05 CH 18 12,03 11,99 CH3 0,84 (s) 19 19,38 19,41 CH3 1,03 (s) 20 40,50 40,51 CH 21 21,05 21,22 CH3 0,91 (d, 6,5) 22 138,32 138,33 CH 5,15 (dd, 8,5, 15,0) 23 129,22 129,27 CH 5,02 (dd, 8,5, 15,0) 24 51,21 51,24 CH 25 31,87 31,90 CH 26 21,20 21,22 CH3 27 25,40 25,41 CH2 28 18,95 19,04 CH3 0,81 (d, 6,8) 29 12,25 12,26 CH3 0,86 (d, 9,5) C 39 δH(J = Hz) 3,53 (m) 5,35 (br d, 3,5) 0,84 (t, 8,5) Hình 3.9 Phổ H-NMR chất TF2 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR chất TF2 40 Hình 3.11 Phổ DEPT chất TF2 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất TF2 stigmasterol 3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học chất phân lập đƣợc từ bán hạ roi 3.5.1 Hoạt tính chống oxy hoá chất phân lập đƣợc Kết thử nghiệm hoạt tính tới gốc tự DPPH chất phân lập từ bán hạ roi đƣợc trình bày Bảng 3.9 41 Bảng 3.9 Kế t quả thƣ̉ hoa ̣t tính chố ng oxy hoá của các chất phân lập chất thử Giá trị EC50 (µg/ml) ̣ DPPH TF1 >128 TF2 >128 Đối chứng dƣơng Quercetin 8,11 Kết bảng 3.9 cho thấy hai chất TF1 TF2 phân lập đƣợc từ Bán hạ roi khơng có hoạt tính oxy hóa hệ thử giá trị EC50tƣơng ứng hệ DPPH >128µg/ml 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào chất phân lập từ Bán hạ roi STT Tên chất Giá trị IC50 (µg/ml) với dòng tế bào MCF7 KB HepG2 Lu (ung thƣ vú) (ung thƣ biểu (ung thƣ (ung thƣ mô) gan) phổi) TF1