Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây bán hạ roi – typhonium flagelliforme ( lodd) blume ( araceae)

Có khoảng 4.700 loài cây được sử dụng làm thuốc .Trong dân gian có rất nhiều thảo dược cũng như các sản phẩm thiên nhiên được sử dụng trực tiếp để làm thuốc chữa bệnh hoặc làm tiền chất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bạch Tuyết Mai

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT

CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme

(LODD) BLUME (ARACEAE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bạch Tuyết Mai

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT

CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme

(LODD) BLUME (ARACEAE)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2018

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, người thầy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn đến ThS Lê Quý Thưởng cùng toàn thể quý thầy,

cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh cũng như quý thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng đào tạo Sau đại học, Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã giúp đỡ và ta ̣o điều kiê ̣n cho tôi hoàn thành chương trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã đô ̣ng viên và tạo điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luâ ̣n văn

Hà Nội, ngày 18 tháng 1 năm 2018

Học viên cao học

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây thuốc 3

1.2 Các hợp chất thứ cấp có trong thực vật 3

1.2.1Alkaloids 3

1.2.2Flavonoids 4

1.2.3Tannins 4

1.2.4 Glycoside 6

1.2.5Saponins 6

1.3 Khái quát về họ Ráy ( Araceae ) 6

1.4 Giới thiệu chung về Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme) 7

1.4.1Đặc điểm hình thái 7

1.4.2 Các hợp chất 7

1.4.3Phân loại và Phân bố 8

1.4.4Hoạt tính sinh học của Bán hạ roi 9

1.5 Khái quát về phương pháp tách chiết 12

1.5.1 Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật 12

1.5.2Phương pháp tách chiết 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu 16

2.2 Hóa chất 16

2.3 Thiết bị thí nghiệm 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Định tính các nhóm chất của loài Bán hạ roi 17

2.4.2 Phương pháp chiết mẫu 21

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 23

2.4.4 Phân lập các chất từ dịch chiết cây Bán hạ roi 25

2.5 Phương pháp thống kê 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Bán hạ roi 27

3.2 So sánh các dịch chiết của Bán hạ roi 28

3.2.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH 28

3.2.2 Dịch chiết của Bán hạ roi với MetOH 29

3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của Bán hạ roi 29

3.3.1 Kết quả thử hoạt tính DPPH 30

3.3.2 Kết quả thử độ độc tế bào 30

3.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các p hân đoạn di ̣ch chiết từ bán hạ roi 32

3.4 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ Bán hạ roi 32

3.4.1 Chất TF1 33

3.4.2 Chất TF2 37

3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học các chất phân lập được từ cây Bán hạ roi 41

3.5.1 Hoạt tính chống oxy hoá của các chất phân lập được 41

3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn dịch chiết 42

3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định củ a các phân đoa ̣n di ̣ch chiết từ bán hạ roi 43

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 So sánh các phương pháp tiền tách chiết 13

Bảng 1.2 So sánh các phương pháp tách chiết truyền thống 14

Bảng 1.3 So sánh các phương pháp tách chiết hiện đại 15

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong loài Bán hạ roi 27

Bảng 3.2 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với EtOH 29

Bảng 3.3 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với MetOH 29

Bảng 3.4 Giá trị EC50 trong phép phân tích DPPH với dịch chiết của Bán hạ roi 30

Bảng 3.5 Giá trị of IC50 với dịch chiết của Bán hạ roi với các dòng tế bào ung thư 30 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định củ a các phân đoa ̣n di ̣ch chiết 32

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất TF1 và Stigmast-4-en-3-one 36

Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của TF2 và hợp chất tham khảo 39

Bảng 3.9 Kết quả thử hoa ̣t tính chống oxy hoá của các chất phân lập 42

Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào của các chất phân lập từ Bán hạ roi 42 Bảng 3.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định củ a các chất phân lập Bán hạ roi 43

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của nicotine 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của flavonoid 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của tannin 5

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của glycoside 6

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của cortisol 8

Hình 1.6 Bán hạ roi (T flagelliforme) 8

Hình 2.1 Mẫu bột Bán hạ roi 22

Hình 2.2 Quy trình ngâm chiết Bán hạ roi 23

Hình 2.3 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học 24

Hình 3.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH của trong dung môi n-hexane (1), EA (2) và MetOH (3) 28

Hình 3.2 So sánh giá trị IC50 của 2 dịch chiết: n-hexane và DCM với các dòng tế bào ung thư 31

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết cây Bán hạ roi 33

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 34

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35

Hình 3.7 Phổ 13 C-NMR và phổ DEPT của chất TF1 35

Hình 3.8 Công thức cấu tạo của TF1 37

Hình 3.9 Phổ H-NMR của chất TF2 40

Hình 3.10 Phổ 13 C-NMR của chất TF2 40

Hình 3.11 Phổ DEPT của chất TF2 41

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất TF2 là stigmasterol 41

BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation

Transfer

IUCN Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên

NCI-H23 Dòng tế bào ung thư phổi người

MỞ ĐẦU

Cây trồng đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống đặc biệt trong nghành Y, Dược vì chúng không chỉ làm giảm ô nhiễm mà còn là phương thuốc để điều trị nhiều chứng bệnh khác nhau nhằm nâng cao sức khỏe cho người dân và phòng chống một số bệnh hiểm nghèo Có khoảng 4.700 loài cây được sử dụng làm thuốc Trong dân gian có rất nhiều thảo dược cũng như các sản phẩm thiên nhiên được sử dụng trực tiếp để làm thuốc chữa bệnh hoặc làm tiền chất cho tổng hợp hóa dược.Mỗi một loài cây có thể trị một hoặc nhiều loại bệnh khác nhau dựa trên các hợp chất và hoạt tính sinh học của loài cây đó Ví dụ: Diếp cá dùng để trị ho, lô hội dùng để trị mụn, trinh nữ hoàng cung dùng để giảm thiểu ung thư buồng trứng và ung thư cổ tử cung, bán hạ roi được dùng để trị ho suyễn, khí nghịch do đàm thấp thủy ẩm, thấp trệ trung tiêu, nôn mửa bụng đầy, đinh nhọt, sưng tấy Ngoài ra, cây bán hạ còn có rất nhiều công dụng khác nhau.Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần các hoạt chất sinh học có trong cây bán hạ roi nói chung và chi

Typhoniumnói riêng nhằm sử dụng và điều trị bệnh là rất quan trọng góp phần cung

cấp thêm sản phẩm thuốc có lợi cho sức khỏe người dân

Bán hạ roi là cây thảo dược thuộc họ Ráy và được trồng rộng rãi ở Ấn Độ,

Úc, Sri Lanka, Indonesia và các nước châu Á khác có nhiệt độ trung bình [26] Gần đây, cho thấycác nhóm hợp chất thứ sinh như flavonoid, saponin, alkaloid và terpenoid của loài cây này đã được nghiên cứu, tìm hiểu [9] Một số các hợp chất hóa học của bán hạ roi cũng đã được tinh sạch và xác định cấu trúc [9] Các dịch chiết từ bán hạ roi được xác định có chứa các hợp chất có hoạt tính chống lại sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư [20] Một số nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết cây bán hạ roi còn có hoạt tính chống oxi hóa [10,16] Tại Việt Nam, trong nhiều bài thuốc dân gian lưu truyền bán hạ roi dùng để trị ho, long đờm Tuy nhiên đến nay, các nghiên cứu chuyên sâu về Bán hạ roi còn chưa nhiều, đặc biệt là các nghiên cứu về các hoạttính sinh học từ các hợp chất mới được tinh sạch Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào phân lập hợp chất từ cây bán hạ roi,

xác định các nhóm chất chính cũng nhƣ tinh sạch hợp chất vàđánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết từ bán hạ roi từ các hợp chất đƣợc tách

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây thuốc

Hiện nay cây thuốc có vai trò quan trọng do chúng chứa một lượng lớn các chất thực vật thứ sinh dùng để điều trị một số bệnh Hầu hết các chất thực vật thứ sinh như phenolic và flavonoid có tác động tích cực đến sức khỏe và phòng chống ung thư, chống oxi hóa, kháng khuẩn Hàm lượng các chất phenolic và flavonoid có liên quan đến hoạt tính chống oxi hóa mà được ứng dụng để ngăn ngừa các bệnh do tuổi tác gây ra đặc biệt là do stress oxi hóa [6]

Trong dân gian, người ta dùng cây thuốc để trị các bệnh thông thường nhưcây diếp cá để trị ho, cây lô hội để trị mụn Hầu hết các loại thuốc sử dụng điều trị trong Đông y đều có nguồn gốc từ thực vật do chúng dễ kiếm và thân thiện với môi trường Hiện nay các nhà khoa học và các y bác sĩ có xu hướng áp dụng cây thuốc trong điều trị bệnh nhằm giảm thiểu các tác dụng phụ cũng như tránh hiện tượng kháng kháng sinh

1.2 Các hợp chất thứ sinh có trong thực vật

1.2.1 Alkaloid

Alkaloid là các bazơ hay hợp chất có chứa nitơ.Các alkaloid thường gặp là morphine, strychnine, quinine, ephedrine, và nicotine (Hình 1.1).Alkaloid được tìm thấy chủ yếu trong thực vật và phổ biến trong các thực vật có hoa.Cấu trúc hóa học của alkaloid rất đa dạng.Thông thường, một alkaloid chứa ít nhất 1 nguyên tử nitơ trong cấu trúc amin.Hầu hết alkaloid có một hoặc nhiều nguyên tử nitơ.Nó đóng vai trò là một phần của vòng tuần hoàn các chất trong tự nhiên [32]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chất nicotine

Alkaloid thường được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học.Ví dụ:Alkaloid chứa vòng tuần hoàn indole được gọi là indole alkaloid Ngoài ra, alkaloid có thể được phân loại theo các hệ thống sinh học, tại vị trí mà chúng có tác dụng Ví dụ,

các alkaloid thuốc phiện xảy ra trong cây thuốc phiện (Papaver

somniferum).Alkaloid thường được dùng để giảm đau và thuốc gây mê [32]

1.2.2 Flavonoid

Flavonoid (Hình 1.2) là một nhóm gồm khoảng 4000 hợp chất polyphenolic

có mặt trong tự nhiên, được tìm thấy phổ biến trong thực vật Dựa theo sự khác biệt các nhóm chức và vị trí của chúng trong khung 15 - carbon (aglycon), flavonoid được chia thành một số nhóm nhỏ bao gồm:Flavone, flavanone, flavonol, isoflavonoid, anthocyanidin, và chalcones [24]

Thông thường, các flavonoid có màu vàng, ngoài ra chúng còn có màu xanh, tím hoặc không màu

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của flavonoid [13]

1.2.3 Tannin

Tannin (thường được gọi là axit tannin) (Hình 1.3) là polyphenol tan trong nước mà tồn tại chủ yếu trong thực phẩm thực vật [12]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của tannin[13]

Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên Dựa vào cấu trúc ta có thể chia tannin thành 4 nhóm chính: gallotannin, ellagitannin, tannin phức hợp và tannin ngƣng tụ [11]

− Gallotannin là toàn bộ tannin mà ở đó các đơn vị galloyl hoặc dẫn xuất depsidic của chúng gắn các đơn vị polyol, catechin hoặc triterpenoid khác nhau

meta-− Ellagitannin là tannin mà có ít nhất 2 đơn vị galloyl có C–C liên kết với nhau và không chứa một đơn vị catechin liên kết glycosid

− Tannin phức hợp là tannin mà đơn vị catechin gắn với 1 liên kết glycoside của 1 gallotannin hoặc 1 đơn vị ellagitannin

− Tannin ngƣng tụ là toàn bộ proanthocyanidin oligomeric và polymeric đƣợc hình thành bằng sự liên kết C-4 của một catechin với C-8 hoặc C-6 của catechin đơn sắc kế tiếp

Trong y học, đặc biệt ở châu Á nhƣ ở Nhật Bản và Trung Quốc, các chất đƣợc chiết xuất từ thực vật có chứa tannin đƣợc sử dụng nhƣ chất làm se, chống tiêu chảy, thuốc lợi tiểu, chống lại các khối u dạ dày và tá tràng, chống sƣng tấy [11]

1.2.4 Glycoside

Glycoside (Hình 1.4) là một hợp chất hữu cơ được hình thành bởi sự ngưng

tụ của một phân tử đường với một phân tử hữu cơ, với điều kiện là phần hydroxy của acetal đường được tham gia vào sự ngưng tụ

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của glycoside[13]

1.2.5 Saponin

Saponin là một nhóm các hợp chất tự nhiên có tính chất hoạt tính bề mặt.Các hợp chất này cho thấy sự biến thiên về kiểu, cấu trúc và thành phần của chuỗi hydlycone và các chuỗi oligosaccharide.Saponin có tác dụng hạ cholesterol trong huyết tương ở người và đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính Hơn nữa, saponin còn cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh

mẽ để chống lại dòng tế bào ung thư[30]

1.3 Khái quát về họ Ráy ( Araceae )

Họ Ráy thuộc nhóm thực vật hạt kín và chúng là cây thân thảo 1 lá mầm Có

114 chi và khoảng 3.750 loài được biết đến trong họ Ráy [15] và ở Việt Nam, có khoảng 30 chi và 130 - 140 loài Họ Ráy được nghiên cứu ngày càng phổ biến và các nhà nghiên cứu đã phát hiện được các hợp chất thứ sinh có trong các cây thuộc

họ này như tannin, axit béo, cerebroside và glucoside [22]

Họ Ráy được trồng và sử dụng phổ biến ở các nước châu Á trong đó có Việt Nam do nhiều cây có hoạt tính sinh học cao.Trong dân gian, người dân sử dụng cây thuộc họ Ráy để làm lành vết thương, vết ngứa, giảm ho, kháng lại các chủng vi khuẩn có hại

1.4 Giới thiệu chung về Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme)

Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume (Araceae) hay Bán hạ roi được biết

đến là Rodent tuber (trong tiếng Anh) hoặc Keladi tikus (trong tiếng Malai) Đây là cây thảo dược được sử dụng như liệu pháp thay thế một số loại thuốc ở Malaysia để điều trị ung thư [8]

1.4.1 Đặc điểm hình thái

Bán hạ roi là cây thảo dược.Cây bán hạ roi có thể cao đến 30 cm với củ trắng

và dài; Lá có bẹ, cuống lá dài, phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau và khá đa dạng.Phiến lá có thể nguyên hay chia thùy Phần thân dài 15,37 ± 1,17 cm và chiều rộng rộng nhất là 1,44 ± 0,07 cm Thân được chia làm 4 phần: Phần giáp thấp 0,41

± 0,03 cm, phần trung gian 1,48 ± 0,14 cm, phần bẹ 0,34 ± 0,05cm và phần dưới cùng màu vàng chanh 12,92 ± 1,25 cm [16, 21]

Hoa tập hợp thành cụm bông mo thường màu trắng hoặc màu vàng Quả mọng hay đóng, hình trứng dài 6mm

Các hợp chất có trong cây

Trong hơn 1 thập kỉ trở lại đây, các nhà nghiên cứu và các nhà khoa học đã nghiên cứu phát hiện, phân biệt, tách và xác định được nhiều hợp chất khác nhau có

trong dịch chiết của T flagelliforme

Vì thuộc lớp Araceae, bán hạ roi chứa flavonoid mà có rất nhiều hoạt tính sinh học.Các hợp chất phytochemical có hoạt tính sinh học là alkaloid, flavonoid, saponin, sterol (Hình 1.5), cerebrocide, và glycoside [26] Dịch chiết hexane được báo cáo là chứa hydrocarbon no and axit aliphatic, trong khi dịch chiết ethyl acetate chứa axit amin béo thơm [9].Bán hạ roi cũng chứa các loại enzyme như peroxidase, laccase, tyrosinase, reductase và riboflavin reductase [16]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của cortisol

1.4.2 Phân loại và Phân bố

1.4.2.2 Phân bố

Bán hạ roi phân bố chủ yếu ở các nước châu Á có khí hậu vừa phải [26] Do

đó rất dễ dàng tìm thấy loài cây này

Bán hạ roi có nguồn gốc từ các nước Đông Nam Á như Malaysia, Singapore

và Trung Quốc, phía nam của Ấn Độ và Sri Lanka và phía bắc Úc [7, 17, 18] Nó phát triển trong vùng đất hoang có môi trường ẩm và râm và không tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời [7, 21, 25].Tại Việt Nam, bán hạ roi có thể tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam như Phú Thọ, các tỉnh miền Trung và miền Nam của Việt Nam (hình 1.6)

Bán hạ roi được trồng rộng rãi vì nó có hoạt tính sinh học cao

1.4 4 Hoạt tính sinh học của Bán hạ roi

Bán hạ roi có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao [26].Bán hạ roi

có nhiều tác dụng tốt đến sức khỏe Loài cây này được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á để trị nhiều loại bệnh như trị ho, giảm sưng, cầm máu, điều trị các vết thương [9] Đặc biệt, bán hạ roi được dùng để kìm hãm sự phát triển của nhiều dòng

tế bào ung thư Hơn thế nữa, loài cây này còn có khả năng kháng viêm, giảm đau và

an thần, kháng khuẩn và chống oxi hóa [9]

1.4.4.1 Kháng viêm, giảm đau và an thần

Bán hạ roi chứa steroid và flavonoid [28] nên loài cây này có hoạt tính này.Steroid kháng viêm hay corticosteroid được dùng để loại bỏ stress, giảm đau và làm lành vết thương Corticosteroid là hoocmon steroid được tạo ra trong tuyến thượng thận của động vật có xương sống.Có hai loại corticosteroid chính là glucocorticoid và mineralocorticoid Chúng đều tham gia vào các quá trình sinh lý trong cơ thể bao gồm phản ứng căng thẳng, miễn dịch, điều hòa viêm, chuyển hoá carbohydrate, protein dị hóa, lượng chất điện phân trong máu và hành vi[19] Corticosteroid ức chế sự hình thành axit arachidonic, do đó giải phóng các chất gây viêm như prostaglandin, leukotrien Chúng cũng ức chế sự tạo thành các chất trung gian viêm, ức chế sự giãn mạch và tăng tính thấm mao mạch ở vết thương

Flavonoid cũng có khả năng kháng viêm, giảm đau và an thần Flavonoid có thể phá vỡ cấu trúc vi khuẩn và vi rút để bảo vệ cơ thể Chúng kìm hãm hyaluronidase mà gây ra sự chảy máu dưới da nhằm giảm thiểu sự phát triển của loại bệnh này Flavonoid có khả năng giảm cholesterol trong máu, hạ huyết áp, do

đó ngăn chặn được các bệnh về tim mạch Flavonoid có tác dụng tích cực đối với bệnh Parkinson và có thể cải thiện trí nhớ ở người cao tuổi[13]

1.4.4.2 Chống oxi hóa

Chất chống oxi hoá là những chất có thể bảo vệ tế bào khỏi những tác động gây ra bởi các phân tử không ổn định gọi là các gốc tự do Chất chống oxi hoá tương tác và ổn định các gốc tự do từ đó có thể ngăn ngừa một số các gốc tự do có hại [10].Trong dân gian, bán hạ roi dùng để trị mụn nhọt, ghẻ lở và loại bỏ độc do côn trùng cắn, do đó loài cây này có khả năng chống oxi hóa

Bán hạ roi là chất chống oxi hóa vì nó chứa flavonoid, hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa cao.Flavonoid như flavonol và flavone chứa nhóm catechol có tính chống oxi hóa cao [9]

Bán hạ roi còn chứa các hợp chất giúp loại bỏ độc tính trong hệ tuần hoàn.Loài cây này có chứa protein ribosome inacting (RIP), chất chống oxi hóa và chống nhiễm khuẩn [31]

Vi khuẩn là các vi sinh vật prokaryote được tìm thấy ở mọi môi trường sống

mà chất hữu cơ có mặt Một số lượng lớn các vi khuẩn gây bệnh ở thực vật và động vật kể cả con người Vi khuẩn gây bệnh gây hại tế bào vật chủ bằng cách tấn công trực tiếp hoặc bởi 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố [22]

Họ Ráy có khả năng kìm hãm hầu hết các loại vi khuẩn gồm cả Gram dương

và Gram âm như: E.coli, B.subtilis, S.aureus, K pneumoniae, P aeruginosa [22]

Các nghiên cứu cho thấy bán hạ roicó khả năng kháng khuẩn

Cả lá và củ của bán hạ roi đều có hoạt tính kháng khuẩn.Dịch chiết hexane từ

củ bán hạ roi có khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn Gram âmP

Bán hạ roi có khả năng cao để trị một số dòng tế bào ung thư [28] Nhóm hợp chất được có nhiều khả năng trị ung thư được nghiên cứu là nhóm flavonoid vì flavonoid giúp ngăn quá trình oxi hóa của các gốc tự do Các hợp chất chống ung thư có thể tìm thấy ở các bộ phận khác nhau của cây bao gồm cả rễ, củ, thân và lá[26] Một số loại ung thư đã được nghiên cứu thử nghiệm với dịch chiết của bán

hạ roi là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư cổ tử cung, ung thư

vú, ung thư tuyến tiền liệt, tuyến tụy, ung thư gan, máu (bạch cầu), ung thư ruột [20,

23, 27,28, 29]

Với ung thư đại tràng, bán hạ roi tác động lên tế bào ung thư với COX-2 là mục tiêu Celecoxib, một chất ức chế COX - 2 có chọn lọc, đã được sử dụng như là kiểm soát dương tính Dixon và cộng sự đã cho rằng celecoxib là một chất tiềm năng để chống ung thư ruột kết [23].Với ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư buồng trứng, các chất trong nhóm flavonoid trong bán hạ roi có xu hướng làm tăng hàm lượng estrogen để giảm sự phát triển của khối u

1.4.4.5 Ứng dụng của Bán hạ roi

Do có tiềm năng sinh học cao, Bán hạ roi được áp dụng trong nhiều lĩnh vực Trong dân gian, Bán hạ roi ngoài việc sử dụng làm thuốc còn được sử dụng làm thức ăn và thức ăn cho lợn

Việc sử dụng Bán hạ roi làm dược liệu từ lâu đã được thực hiện bởi người Philippine và Trung Quốc Loài cây này đã được người Trung Quốc uống để điều trị thương tích và người Philippine đã sử dụng các chất flavour như một chất chống đông máu Toàn bộ cây bán hạ roi đã được dùng làm nước với mật ong để làm ngọt

và có thể làm thuốc để cai nghiện, kháng khuẩn, kháng virut và chống ung thư [21] Người dân còn sử dụng loài cây này để trị ho, long đờm

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy Bán hạ roi còn có thể được sử dụng như phương pháp điều trị bệnh Bán hạ roi do có hoạt tính ức chế tế bào ung thư do đó

nó có thể được áp dụng như phương pháp điều trị ung thư

Loài cây này cũng chữa được bệnh hen suyễn [16]

1.5 Khái quát về phương pháp tách chiết

Việc chiết xuất là cần thiết để cô lập và chiết xuất các thành phần của thực vật để áp dụng trong ngành công nghiệp y tế dựa trên tầm quan trọng của cây trồng đối với sức khoẻ.Có nhiều phương pháp tách chiết và mỗi loài cây, thảo dược có thể phù hợp với một hoặc nhiều phương pháp khác nhau (bảng 1.1)

1.5.1 Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật

Lựa chọn mẫu thực vật phù hợp trước khi tách chiết rất quan trọng Ta cần lựa chọn mẫu phù hợp nhất để đem lại các kết quả tốt nhất sau khi tách chiết

Các mẫu khô được ưu tiên hơn vì chúng chứa hàm lượng flavonoid cao hơn

so với mẫu tươi và thời gian bảo quản mẫu khô lâu hơn [6]

Sử dụng các mẫu này có thể làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa mẫu thực vật và các dung môi chiết xuất Các mẫu bột chứa các hạt nhỏ hơn các mẫu nghiền, dẫn đến sự tiếp xúc bề mặt tốt hơn.Trong khi đó việc nghiền mẫu chỉ làm mẫu nhỏ hơn,

do đó mẫu bột phổ biến hơn [6]

1.5.1.3 Phương pháp tiền tách chiết

Có 4 phương pháp tiền tách chiết: Sấy khô bằng khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đông khô(Bảng 1.1) [6]

Bảng 1.1 So sánh các phương pháp tiền tách chiết [6]

Cách sử

dụng

Sử dụng các loại khí riêng lẻ hoặc hỗn hợp

Sử dụng bức xạ điện từ

Sử dụng năng lượng nhiệt

Dựa vào hiện tượng thăng hoa

Thời gian 3 - 7 ngày, vài tháng

cho đến một năm

Ngắn hơn sấy bằng khí

Ngắn hơn sấy bằng khí

Qua đêm (12h)

Đặc điểm Không sử dụng nhiệt

độ cao

Có hiện tượng làm nóng đồng thời

Có thể sử dụng với nhiều loại nhiệt độ

Không làm mất hoạt tính

Ưu điểm Các hợp chất chịu

nhiệt được bảo toàn Nhanh

Không làm mất hoạt tính

Hàm lượng phenolic cao hơn

Hạn chế

Thời gian tiến hành lâu

Mẫu có thể bị nhiễm bẩn ở điều kiện nhiệt

độ không ổn định

Đôi khi gây ra

sự giảm thiểu lượng

phytochemicals

Đôi khi không có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động chống oxi hoá

Mẫu bị mất

do tỏa ra trong bình đông

Tốn kém

1.5.2 Phương pháp tách chiết

Có nhiều phương pháp tách chiết kể cả phương pháp truyền thống và hiện đại với mục đích là tách được hợp chất mong muốn Các phương pháp tách chiết truyền thống bao gồm: Ngâm, truyền, thấm và sắc; Chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.2)

Các phương pháp tách chiết hiện đại bao gồm: Chiết bằng lò vi sóng (MAE), chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE)(Bảng 1.3) ASE và SFE được sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả thấp Mỗi phương pháp phù hợp với mẫu chiết và dung môi chiết khác nhau Dung môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực, ví dụ: Nước, ethanol, methanol, n-hexane, ethyl acetate [6]

Bảng 1.2 So sánh các phương pháp tách chiết truyền thống [9]

- Ngâm là phương pháp lấy bột thực vật

ngâm với dung môi nhiệt độ phòng ít

nhất 3 ngày để giải phóng các chất

phytochemical hòa tan Sau đó, hỗn hợp

này được lọc qua màng lọc, nhiệt được

chuyển giao và các dung môi chiết sẽ xác

định loại hợp chất chiết xuất

- Truyền và sắc có quy trình tương tự như

quá trình ngâm, thời gian nhanh hơn

- Thẩm thấu có nguyên tắc tương tự 3

phương pháp trên

Dễ dàng

và đơn giản

Chất thải vẫn chứa dung môi

Dùng để tách chiết

P guajava

L, G

atriviridis, P oleracea, C.caudatus, M.oliefera

Mẫu mịn được đặt trong một túi xốp hoặc

"bao" được làm từ giấy lọc hoặc xenlulô

mạnh nằm trong buồng của thiết bị

Soxhlet Dung môi chiết xuất được đun

nóng trong bình đáy và bay hơi vào

buồng mẫu, ngưng tụ trong bình ngưng

và nhỏ giọt Khi lượng chất lỏng tiếp cận

cánh tay siphon, dung dịch trong bình

cạn và quá trình này tiếp tục

Chỉ cần một lượng nhỏ dung môi

Dễ cháy, tốn kém, gây

ô nhiễm

Dùng để tách

chiết A

indica (Neem), M oliefera, C asiatica

Bảng 1.3 So sánh các phương pháp tách chiết hiện đại [6]

phương pháp có lợi cho các

phân tử cực và dung môi có

hằng số điện môi cao

Thời gian tách chiết giảm Cải thiện sự phục hồi của chất phân tích

Hạn chế các hợp chất phenolic nhỏ

Dùng để chiết xuất triterpene từ

C.asiatica, D.hispida, A.paniculata

bào Như vậy tính chất của tế

bào thay đổi tế bào để giải

Sử dụng ít dung môi Chi phí thấp

Sóng siêu âm trên 20 kHz có thể có ảnh hưởng đến các phytochemical hoạt động thông qua sự hình thành của các gốc tự do

Dùng đểtách

chiếtW

somnifera, C.formosum

CHƯƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Bán hạ roi từ Phú Thọ và được phân loại bởi ThS Nguyễn Anh Đứcbộ môn Thực vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Các mẫu cây được sấy khô, nghiền thành bột và bảo quản ở nơi khô ráo Mẫu bột được ngâm trong ethanol và methanol ở nhiệt độ phòng

Ethanol được chọn là dung môi đầu tiên cho quá trình chiết Bán hạ roi (Hình 2.2).Ethanol là dung môi được sử dụng rộng rãi trong quá trình tách chiết các hợp chất phenol từ thực vật dựa trên tính hiệu quả cao của dung môi này Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với 2 nồng độ khác nhau của ethanol là 80% và 96% nhằm mục đích thu được polyphenol tổng số và từ đó phân tích xem hợp chất nào thể hiện

hoạt tính sinh học của Bán hạ roi

Máy cô quay được sử dụng để loại bỏ dung môi Sau đó cặn ethanol khô được ngâm lần lượt trong các dung môi n-hexane, ethyl acetate và cuối cùng là methanol.Cặn methanol khô được ngâm trong dung môi dichloromethane

Dung môi trong cao chiết được loại bỏ hoàn toàn nhờ công đoạn cô quay ở

50oC Sắc ký cột với các hệ dung môi khác nhau và các máy quang phổ được sử dụng để phân lập các hợp chất có trong cao chiết

2.2 Hóa chất

− Các hóa chất, dung môi sử dụng cho quá trình tách chiết như: ethanol, n hexane, ethylacetate, methanol và dichloromethane có nguồn gốc từ các hãng

-Merck (Đức), hay Sigma (Mỹ)

− Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) được sử dụng cho sắc ký cột (230-400 mesh ASTM)

2.3 Thiết bị thí nghiệm

− Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào

− Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ)

− Cân phân tích (Presica – Italy)

− Kính hiển vi ngược (Zeizz)

− Máy cô quay Stuart RE300DB (England)

− Máy quang phổ DEPT, FT-IR, NMR, vàGenios Tecan

− Máy ly tâm (Universal 320R)

− Sắc ký cột

− Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170)

− Tủ cấy sinh học an toàn cấp II

− Tủ hút LabTech LFH 2150 (LabTech – Hàn Quốc)

− Tủ lạnh (-25oC; -80oC)

− Tủ sấy (Memmert – Đức)

Và các trang thiết bị khác trong phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Định tính các nhóm chất của loài Bán hạ roi

Chúng tôi đã áp dụng các phương pháp theo tài liệu tham khảo[1]

Phản ứng định tính glycosid tim

Cân 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung tích 100ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform / ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml Gạn lớp dịch chiết cloroform trong ethanol vào một cốc có mỏ đã được sấy khô

Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Đem cô cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính

Phản ứng Liebermann – Burchardt

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất

hiện một vòng màu tím đỏ (phản ứng dương tính)

Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycoside Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng – phản ứng âm tính

Định tính saponin trong dược liệu

Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn Thêm 10ml nước Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt

Kết quả: Xuất hiện cột bọt không bền sau khi ngừng lắc 45 phút – phản ứng

âm tính

Định tính tanin

Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính

Phản ứng với protein

Ống nghiệm 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bông trắng – phản ứng âm tính

Phản ứng với ion kim loại nặng

Ống nghiệm 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5% Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen – phản ứng âm tính

Ống nghiệm 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10% Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông – phản ứng dương tính

Định tính đường khử

Cân khoảng 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Thêm 2ml dung dịch

thuốc thử Felling Đun cách thủy sôi vài phút

Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch – phản ứng dương tính

Định tính polysaccharid

Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi cách thủy vài phút Lọc lấy dịch Cho vào 3 ống nghiệm:

Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi vài phút Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh – phản ứng dương tính

Định tính axit hữu cơ

Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn Để nguội và lọc Thêm vào dịch lọc một ít bột

Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt) Để yên một vài phút Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ – phản ứng dương tính