NGHIÊN cứu HOẠT TÍNH SINH học hạ ĐƯỜNG HUYẾT và CHOLESTEROL máu của một số NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH từ cây NOPAL (OPUNTIA SPP) được NHẬP vào VIỆT NAM TT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Tạ Thu Hằng NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ CHOLESTEROL MÁU CỦA MỘT SỐ NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH TỪ CÂY NOPAL OPUNT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Tạ Thu Hằng

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

VÀ CHOLESTEROL MÁU CỦA MỘT SỐ NHÓM HOẠT

CHẤT CHÍNH TỪ CÂY NOPAL (OPUNTIA SPP)

ĐƯỢC NHẬP VÀO VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62420116

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2017

Công trình được hoàn thành tại trường Đại học Khoa học tự nhiên -

Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học

1 PGS.TS Lê Tất Khương

2 PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Trường Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội

Phản biện 2: GS TS Đặng Thị Thu

Trường Đại học Bách khoa-Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại Học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại:

-Thư viện Quốc gia Việt Nam

-Trung tâm Thông tin-Thư viện, Trường Đại học Khoa học tự ĐHQG Hà Nội

nhiên-MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Xương rồng (XR) Nopal thuộc chi Opuntia ficus-indica (L.) Mill, là

một loài xương rồng mà từ lâu được trồng rộng rãi trên khắp vùng khô cằn và bán khô cằn của thế giới Nó có nguồn gốc từ Mêxicô XR Nopal ngoài việc

sử dụng như rau ăn hàng ngày và chế biến các loại thực phẩm, mỹ phẩm,

dược phẩm, chất đốt sinh học, xử lý nước thải…[Error! Reference source

not found.] theo truyền thống ở Mêxicô cây XR Nopal được sử dụng để điều

trị bệnh đái tháo đường Các nghiên cứu cho thấy loài Opuntia ficus-indica

có tác dụng hạ glucose huyết, giảm rối loạn lipid máu, làm tăng dịch chuyến protein vận chuyển (GLUT4) glucose ra màng tế bào, tăng khả năng hấp thu

glucose, giảm kích thước tế bào mô mỡ [Error! Reference source not

found.],[Error! Reference source not found.],[Error! Reference source not found.]

Tỷ lệ bệnh ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới kéo theo những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội Số người mắc bệnh ĐTĐ trên toàn thế giới tăng từ 171 triệu năm 2000 lên 194 triệu năm 2003, đã tăng vọt 246 triệu năm 2006 và được dự báo tăng lên 380-

399 triệu vào năm 2025 Việt Nam nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới Ước tính có khoảng 53.458 ca tử vong do bệnh tiểu đường vào năm 2015

Cây XR Nopal đã được Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng nhập nội

từ Mêxicô vào Việt Nam từ năm 2009, đã tiến hành trồng thử nghiệm thành công chống cát bay, cát nhảy ở vùng đất khô hạn của tỉnh Ninh Thuận Để tận dụng được nguồn nguyên liệu cây XR Nopal dùng làm nguồn dược liệu, các chất tách từ cây có thể dùng làm thuốchỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

là vấn đề có ý nghĩa vì vậy chúng tôi tiền hành đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính

sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt

chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu: Xác định nhóm hoạt chất hay hợp chất chính trong

cây xương rồng Nopal trồng tại Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết và hạ cholesterol

3 Nội dung nghiên cứu:

+ Xác định các thành phần dinh dưỡng chính, thành phần hóa học của cây Nopal nhập nội

+ Thử độc tố LD 50 Xác định tác dụng hạ glucose huyết và lựa chọn được phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ưu thế của cây Nopal trồng tại Việt Nam trên thực nghiệm

+ Đánh giá tác dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế gây hạ glucose, choleterol huyết của cao phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ưu thế của cây Nopal trồng tại Việt Nam

+ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số chất tinh khiết từ thân cây Nopal trồng tại Ninh Thuận Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của các chất

phân lập trên một mô hình thử nghiệm in vitro

4.Bố cục của Luận án

Luận án có 144 trang gồm 3 trang mở đầu, 36 trang tổng quan tài liệu,

23 trang đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu; 55 trang kết quả nghiên cứu và thảo luận, 3 trang kết luận và đề nghị, 1 trang các công trình khoa học công bố, 12 trang tài liệu tham khảo, 12 trang mục lục, chữ viết tắt, danh mục bảng, hình, trang phụ lục luận án có … bảng số liệu và … hình vẽ

5 Điểm mới của luận án:

- Xác định được đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu thân, rễ, tên khoa học của giống XR Nopal trồng tại Ninh Thuận-Việt Nam

- Xác định được thành phần dinh dưỡng, định tính các nhóm chất, phân lập, xác định cấu trúc và định tên được các hợp chất phân lập được trong cây XR Nopal giống Jalpa

- Xác định đươc 1 giống XR có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả nhất trong 03 giống thử nghiệm

- Xác định được phân đoạn Ethylacetat chứa nhiều flavonid, có tác dụng

hạ đường huyết, cholesterol và khả năng hoạt hóa enzym p-AMPK và p-ACC tốt nhất

- Xác định được 01 chất đặc trưng trong cây XR Jalpa có tác dụng hoạt hóa p-AMPK và p-ACC, ức chế FAS (tổng hợp acid béo), làm tăng sự hấp thu glucose trong tế bào, có tác dụng làm giảm đường huyết và chống béo phì

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Cây xương rồng Nopal và một số nghiên cứu về chi Opuntia

Loài Opuntia ficus-indica (L.) Mill thuộc chi Opuntia, họ Cactaceae,với khoảng 1.500 loài xương rồng, có nguồn gốc từ Mêxicô và lan rộng khắp Trung và Nam Mỹ, Úc, Nam Phi, bao gồm cả các khu vực Địa Trung Hải

[Error! Reference source not found.]

Chi Opuntia có chứa một lượng đáng kể các axit ascorbic, vitamin E,

carotenoid, chất xơ, axit amin và các hợp chất chống oxy hóa (phenol, flavonoids, betaxanthin và betacyanin), có lợi ích cho sức khỏe như: hạ

đường huyết và hạ mỡ máu, và chống oxy hóa [Error! Reference source not

found ]

1.2.Tác dụng hạ glucose, cholesterol huyết của chi Opuntia

Cây XR Opuntia ficus-indica chứa hàm lượng chất xơ, chất nhầy cao

Uống bột XR Nopal trưởng thành và XR Nopal non liều 50 mg / kg thể trọng

có tác dụng giảm glucose máu sau ăn trên chuột bị tiểu đường tương ứng là

46,0 và 23,6% (p <0,05) so với nhóm đối chứng[Error! Reference source

not found.]

Opuntia ficus-indica var.saboten (OFS) sử dụng với liều 1 g / kg và 2 g

/kg trọng lượng cơ thể có tác dụng hạ đường huyết OFS kích hoạt

phosphoryl hóa AMPK và MAPK p38 [Error! Reference source not

found.]

Quả của cây Opuntia ficus-indica có nhiều giá trị dinh dưỡng: ascorbic

acid, vitamin E, carotenoid, sợi, axit amin, và với lượng lớn glucose và fructose và các phenol, flavonoid, betaxanthin và betacyanins, có tác dụng hạ đường huyết và hạ lipid, có tác dụng hạ đường huyết và hạ lipid và chống

oxy hóa[Error! Reference source not found.]

Dịch chiết từ cây Opuntia humifusa có chứa hàm lượng chất chống oxy

hóa cao bao gồm vitamin C, flavonoids và polyphenols, uống với liều 150mg, 250mg, 500 mg / kg trọng lượng/ ngày trong 7 tuần điều trị có tác dụng giảm glucose, triglyceride máu, giảm đáng kể cholesterol tổng số và giảm LDL, tăng HDL ở những con chuột bị tiểu đường.[93]

Viên nang chứa cellulose vi tinh thể, 70% chất chiết tự nhiên từ nhánh

và quả của Opuntia ficus-indica thử nghiệm trên người có tác động hạ đường

huyết cấp tính và lâu dài, an toàn Uống liều 400 mg trong vòng 30 phút trước khi nạp 75 g glucose đã làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết sau

khi dùng[Error! Reference source not found.]

Chuột ăn với chế độ giàu chất béo bổ sung chất chiết xuất Opuntia ficus-indica (OFI) giàu isorhamnetin glycosides, được bổ sung với liều thấp

(0.3%) và liều cao (0.6%) vào thức ăn thì có trọng lượng cơ thể, cholesterol toàn phần, LDL và HDL, nồng độ glucose và insulin thấp hơn so với chuột chỉ dùng chế độ giàu chất béo Chiết xuất OFI đã kích thích sự bài tiết insulin trong ống nghiệm, kết hợp với sự gia tăng vận chuyển glucose (GLUT2), tăng khả năng hấp thụ glucose, tạo thêm năng lượng [89]

Giống XR Milpa Alta thuộc OFI với hàm lượng chất xơ, nồng độ

polyphenol cao và khả năng chống oxy hoá đã làm tăng quá trình oxy hóa axit béo và tổng hợp VLDL, giảm stress oxy hoá, và cải thiện tín hiệu insulin gan ở chuột Zucker béo phì Những con chuột bị béo phì Zucker được cho ăn chế độ ăn kiêng có bổ sung 4% bột XR Nopal trong 7 tuần thì chỉ số triglicerid trong máu thấp hơn 50% so với nhóm đối chứng, ngoài ra khối u

gan, dấu hiệu sinh học của tổn thương tế bào gan giảm[Error! Reference

source not found.]

Lợn nái ăn thức ăn thương phẩm bổ sung thêm 2,0 ± 0,5 kg cây xương

rồng Opuntia ficus-indica có chỉ số glucose trong máu hạ tốt hơn, thời gian

cai sữa dài hơn nhóm ăn thức ăn thương phẩm không bổ sung cây xương rồng OFI Hiệu quả hạ đường huyết của cây xương rồng là do hàm lượng chất xơ cao, đặc biệt là pectin, gel pectin làm giảm sự hấp thụ carbohydrate Ngoài ra, chất xơ cao làm tăng hoạt tính enzyme vi khuẩn, ảnh hưởng hoạt tính của α-glucosidase và β-galactosidase, dẫn đến sự ức chế sự thủy phân

liên kết glycosidic[Error! Reference source not found.]

Dầu hạt của quả của cây Opuntia ficus-indica L MILL. có thành phần lipophilic chứa 83% axit béo chưa bão hòa (56% acid linoleic và 20% axit oleic) có tác dụng bảo vệ có thể ngăn ngừa chứng đái tháo đường ở chuột được gây ra bởi Alloxan và ức chế các tổn thương mô ở các tế bào tụy.[28]

1.3 Tác dụng sinh học khác của chi Opuntia:

Lorenzo và cộng sự (2017) đã nghiên cứu cho thấy toàn bộ chất nhầy

và các thành phần khối lượng phân tử thấp như acid lactic, D-mannitol, piscidic, eucomic và 2-hydroxy-4- (4’ -hydroxyphenyl) -butanoic axit trong

Opuntia ficus-indica có tác dụng trong việc chữa vết thương qua mô hình tế

bào in vitro được đơn giản hóa dựa trên một lớp vỏ keratin [Error!

Reference source not found.]

 Hoạt tính chống ung thư

Glycosid isorhamnetin tinh khiết chiết xuất từ O ficus-indica (giống

Jalpa) có tác dụng gây độc tế bào ung thư ruột kết ở người: HT-29 và Caco2 Những ảnh hưởng này liên quan đến quá trình gây chết tế bào (apoptosis) thông qua cascade, một enzyme dạng protease, đóng vai trò trung tâm trong

việc truyền tín hiệu gây chết tế bào [Error! Reference source not found.]

Betanin, chiết xuất từ quả O.ficus-indica, có thể ức chế sự phát triển

của dòng tế bào ung thư bạch cầu K562 mãn tính ở người thông qua con

đường tự do apoptotic [Error! Reference source not found.]

Flavonoids, trans Taxifolin, và dihydrokaempferol đã được phân lập

từ Opuntia humifusa có thể là những chất có tiềm năng để điều trị ung thư cổ

tử cung ở người [Error! Reference source not found.]

lipoprotein lipase [Error! Reference source not found.]

 Bảo vệ tế bào thần kinh

Các polysaccharides của Opuntia Milpa Alta (MAP) có tác dụng bảo

vệ thần kinh được đánh giá ở mức độ cơ học trong mô hình invitro của tổn

thương thiếu máu ở não chuột [Error! Reference source not found.]

 Giảm triệu chứng của bệnh táo bón

Chuột được tiêm dưới da Loperamide (2 mg / kg) để gây táo bón Cho

chuột uống nước chiết từ Opuntia humifusa với nồng độ 3% và 6% trong

thời gian 25 ngày, kết quả cho thấy độ dày của ruột già cũng tăng lên ở các nhóm phụ thuộc theo liều Những kết quả này cho thấy rằng chiết xuất của

Opuntia humifusa làm giảm các triệu chứng của táo bón do loperamide gây ra

[Error! Reference source not found.]

 Làm chậm sự phát triển tổn thương xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch

Các nghiên cứu in vivo trên chuột apoE-KO, tự phát triển các tổn thương xơ vữa động mạch trong điều kiện ăn kiêng cơ bản, chỉ ra rằng việc

bổ sung chế độ ăn uống có chứa bột thân cây O streptacantha hoặc indica (10 mg/kg trong 15 tuần) làm giảm đáng kể sự phát triển của tổn

O.ficus-thương xơ vữa động mạch [Error! Reference source not found.]

 Ngăn ngừa sự phát triển bất thường của chuyển hóa liên quan đến béo phì

Flavonoid kaempferol hoặc isorhamnetin chiết xuất từ Opuntia có thể

ngăn sự tích tụ lipid hoặc ức chế sự hình thành adipogenesis thông qua việc

giảm sự điều hòa gen có adipogenic [Error! Reference source not found.]

1.4 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ glucose huyết, hạ cholesterol từ các loài thực vật khác

Scoparia dulcis L thường được gọi là cây đậu ngọt giàu hàm lượng

saponin, khi sử dụng ở liều 20 và 30 mg / kg có tác dụng hạ đường huyết

trên mô thí nghiệm bệnh ĐTĐ ở chuột [Error! Reference source not

found.]

Mangifera indica kernel flour (MIKF) hay bột nhân hạt xoài tại

Nigeria là một nguồn giàu các chất flavonoid và axit phenolic, quan trọng về mặt dược lý Các chất chiết xuất methanolic của nó ức chế một số enzyme chủ chốt liên quan đến bệnh lý học và biến chứng của bệnh đái tháo đường

týp 2 in vitro [Error! Reference source not found.]

Theo Jang Sun-Hee và cộng sự nghiên cứu cho thấy nhân sâm có tác dụng chống bệnh đái tháo đường trong mô hình bệnh tiểu đường chuột gây

ra bởi streptozotocin, thông qua việc chuyển saponin thành các chất chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột làm giảm 62,5% mức đường huyết Ngoài ra, các chỉ số khác nhau glycosylated máu, nồng độ insulin trong huyết thanh

cũng được cải thiện đáng kể [Error! Reference source not found.]

Quế (Cinnamomum zeylanicum) Chiết xuất quế có thể là một loại

thuốc thay thế hữu ích trong chế độ hàng ngày của bệnh nhân đái tháo đường, cải thiện hiệu suất của bộ nhớ và giảm rối loạn chuyển hóa lipid

[Error! Reference source not found.]

Cây hồ lô bá (Trigonella foenum graecum) có tác dụng hạ đường

huyết tốt Sử dụng 10 % bột hạt hồ lô bá và 3% hành tây hàng ngày có sự

giảm đáng kể mức glucose trong máu lúc đói Củ cải đường, hành tây, bột hạt hồ lô bá tỷ lệ 43%, 35% và 54% có tác dụng giảm cholesterol máu, đặc

biệt là từ các triglyceride LDLc giảm một cách đáng kể [Error! Reference

source not found.]

Các thành phần được xác định là biểu hiện tác dụng chống bệnh tiểu

đường của cây chóc máu S.reticulata Wight bao gồm salacinol, kotalanol,

ponocinol, salaprinol… Mangiferin, 16-acetate kotalagenin và oligomers

proanthocyanidin khác nhau cũng đã được phân lập [Error! Reference

source not found.]

Dịch chiết của cây chóc máu (S.reticulata Wight) đã làm tăng sự biểu

hiện hoạt hóa AMPKα (Activated protein kinase α) và AMPKα phosphoryl hóa trong các tế bào mỡ Những phát hiện này chứng minh rằng chiết xuất của S.reticulata Wight có tác dụng trị liệu về béo phì và rối loạn chuyển hoá

lipid [Error! Reference source not found.]

Dịch chiết từ lá dây thìa canh (Gymnema sylvestre) với liều 100, 250

và 500 mg / kg thể trọng được thử nghiệm trên mô hình chuột nuôi chế độ ăn nhiều chất béo được chứng minh hiệu quả hạ đường huyết do hoạt tính ức chế amylase và giảm đáng kể sự gia tăng trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid

huyết thanh, insulin và leptin huyết thanh, mô mỡ, viêm gan [Error!

Reference source not found.]

Selenium (Se) và Polysaccharide được phân lập từ lá sen, có tác dụng chống oxy hoá và đề kháng insulin Chuột cống mang thai trước khi sinh uống liều 50 và 100 mg / kg có tác dụng giảm cân, giảm mức glucose, lượng

insulin, giảm cholesterol trong máu [Error! Reference source not found.]

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của một số cây thuốc tại Việt Nam đang được rất nhiều các nhà khoa học trong nước quan tâm

Sử dụng hỗn hợp lá vối, lá ổi, lá sen (VOS) với liều lượng là 200 mg VOS/kg thể trọng và 400 mg VOS/kg thể trọng trên chuột ĐTĐ trong 8 tuần

liên tục [Error! Reference source not found.]

Tác giả Phùng Thanh Hương đã chứng minh cây bằng lăng nước có hoạt chất chính là polyphenol và acid corosolic có tác dụng ức chế men anpha-glucosidase kiểm soát glucose máu sau ăn vì vậy dịch chiết lá bằng

lăng nước có tác dụng hạ glucose máu trên chuột chuột ĐTĐ [Error!

Reference source not found.]

Ngoài ra còn có: nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây

chóc máu Nam Bộ Salacia cochinchinensis L Celastraceae [Error!

Reference source not found.], dây thìa canh (Gymnema sylvestre (ReTz.)

R.Br.ex Schult )[Error! Reference source not found.], dịch ép thân cây chuối tiêu Musa balbisiana Colla [Error! Reference source not found.],

dịch chiết vỏ quả hồng bì Clausena lansium (Lour.)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

-Thân cây xương rồng Nopal trưởng thành, nhánh 20-25cm (03 giống: Jalpa, TV, PTV-01) được thu hái tại Ninh Thuận ( Vườn giống gốc của Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng)

-Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương

-Tế bào 3T3-L1 (tế bào mô mỡ chuột) được cung cấp bởi ATCC (Rockwill, MD, Mỹ)

2.1.3.Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.1.3.1 Hóa chất

Streptozocin (STZ) bột pha tiêm của hãng Sigma, Glyclazid (Standa) (Pháp), Acarbose (Glucobay) (Đức), Metformin hydroclorid (Glucophage), (Đức)

Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM) Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và

365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện vết chất

Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nước cất, Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol…

Các dung môi dùng trong định lượng polyphenol toàn phần: (EtOH) Thuốc thử: Folin-Ciocalteau (Merck) Hóa chất Na2CO3 (Trung Quốc)

Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH, Acetonitril (ACN) của hãng Merck Acid phosphoric đặc d=1,685g/cm3 của hãng Merck

Môi trường DMEM và trypsin được cung cấp bởi Gibco, FBS, penicillin/streptomycin Kháng thể p-AMPK, p-ACC, FAS, kháng thể thứ cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell signaling); D-14C(U)-glucose; MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl-tetrazolium bromid] (Sigma); dexamethasone (Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthin, insulin (Sigma); Các nguyên vật liệu và hoá chất khác được cung cấp bởi công ty Sigma

2.1.3.2 Thiết bị thí nghiệm

Thiết bị phục vụ chiết xuất và nghiên cứu các thành phần hóa học:

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C;Tủ sấy Memmert IN260 (MEMMERT Đức); Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), BUCHI(Thuỵ Sỹ), Máy siêu

-âm Power sonic 405 (POWERSONIC - Hàn Quốc), Máy UV-vis 1800 dải đo 190nm-800nm (SHIMADZU -Nhật Bản); Máy đo độ nóng chảy Kofler micro-hotstage (Đức); Máy đo phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap (AGILENT -Anh); Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất chuẩn nội là TMS (BRUKER(Đức), Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp (SHIMADZU Nhật Bản);

Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học

Máy li tâm để bàn SIGMA 3K 30 (SIGMA-Đức); Máy đo pH (HORIBA F-51BW HORIBA -Nhật); Máy đo quang TriStar LB 941 Multimode Microplate Reader TRISTA (Đức); Hệ thống phát hiện và phân tích hình ảnh LICOR Odyssey® CLx LICOR (Mỹ), Máy đếm Tri-Carb 2000 (TRI- CARB -Mỹ)…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các nghiên cứu thực nghiệm được nghiên cứu tại khoa sinh-ĐHKHTN, khoa hóa thực vật, dược lý – Viện Dược liệu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật học:

2.2.1.1 Xác định tên khoa học

Theo phương pháp mô tả, so sánh hình thái, được đối chiếu bởi các khóa phân loại đến loài và thứ của chi Opuntia Mill.,thuộc họ xương rồng

Cactaceae trong các bộ Thực vật chí của Trung Quốc[Error! Reference

source not found.]

Việc thẩm định lại kết quả, xác định lại tên khoa học mẫu thu thập được tại phòng thực vật-Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2.2.1.2 Nghiên cứu giải phẫu

Theo phương pháp nghiên cứu giải phẫu thực vật, bao gồm các bộ phận thân, rễ Các tiêu bản giải phẫu được làm theo phương pháp nhuộm kép (đỏ

carmin xanh methylen)[Error! Reference source not found.,Error!

Reference source not found.] Quan sát dưới kính hiểm vi soi nổi và chụp

ảnh bằng máy kỹ thuật số

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học

2.2.2.1 Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của cây XR Nopal trồng tại Việt Nam

Vật chất khô (Phương pháp trọng lượng), Lipid (Phương pháp Soxlect), Protein (Sử dụng máy Gerhard theo phương pháp Kjeldahl); Xác định vitamin A, vitamin C bằng phương pháp HPLC; Xác định vitamin B1, B2, B6 bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Phân tích K, Na dựa trên tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6196-3:2000; Xác định Zn, Fe, dựa trên tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8126:2009; Xác định P theo phương pháp TCVN 1525:2000

2.2.2.2 Phương pháp chiết phân đoạn

Mẫu thu về được loại bỏ phần hư hỏng, rửa sạch, phơi trong bóng râm cho khô, sấy ở 60oC cho đến khi mẫu có khối lượng không đổi, nghiền mẫu thành bột và được chiết xuất bằng ethanol (EtOH) với phương pháp ngấm kiệt Sau đó dịch chiết toàn phần EtOH được phân đoạn bằng các dung môi

có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat [Error! Reference source not

found.]

2.2.2.3 Phương pháp định tính

Định tính bằng các phản ứng hóa học sử dụng thuốc thử đặc trưng của

mỗi nhóm chất [Error! Reference source not found.],[Error! Reference

source not found.]

2.2.2.4 Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần

Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần [Error! Reference

source not found.]: sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau, đo quang ở bước

sóng 760nm, so sánh với acid gallic, sử dụng kỹ thuật đường chuẩn

2.2.2.5 Phương pháp phân lập các hợp chất:

a Sắc ký lớp mỏng : Dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được

Phương pháp sắc ký lớp mỏng, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch Pha tĩnh là một lớp mỏng các

chất được hấp thụ trên silicagel.[Error! Reference source not found.]

Sau khi chạy sắc ký xong để phát hiện chất trên bản mỏng có thể dùng thuốc thử H2SO4 10% được phun đều trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên bếp điện đến khi hiện màu hoặc bằng đèn tử ngoại bước song 365nm và 254nm

b Sắc ký dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha: pha cố định và pha di động Pha di động hay pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột, pha cố định hay pha tĩnh được nhồi vào một cột thủy tinh Mẫu được đưa vào cột, các mẫu sẽ đi qua cột với các tốc độ khác nhau, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ ngấm sâu vào mạng lưới của chất nhồi, còn các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối lượng rất lớn sẽ không đi được vào các mao quản Kết quả là thứ tự các chất

ra khỏi cột theo khối lượng thứ tự giảm dần [Error! Reference source not

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ thường được xác định bằng

kỹ thuật phổ khối lượng Nguyên tắc chủ yếu của kỹ thuật này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới dạng bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ra để xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất còn dựa vào cơ chế phân mảnh của các ion bằng phổ MS

c Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic Resonance):Phổ 1H-NMR; Phổ 13C-NMR; Phổ DEPT Ngoài ra, người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại khác như: HMQC,

HOMOCOSY, HMBC[Error! Reference source not found., Error!

Reference source not found.]

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học

2.2.3.1 Xác định độc tính cấp

Tiến hành đánh giá độc tính cấp tính của DCTP của 03 giống XR Nopal thử nghiệm (Jalpa, Tai voi, PTV-01) trên chuột nhắt trắng theo đường uống, liều dùng là 3g, 6g, 9g, 12g,15g,18g,21g/ kg/ ngày cho mỗi giống XR

Nopal [Error! Reference source not found.], mỗi lô 10 con

Các chỉ tiêu theo dõi : Hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu.Theo dõi số lượng chuột chết ở mỗi lô trong vòng 72 giờ, xác định được LD50

2.2.3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết

a) Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng STZ

Chuột nhắt trắng sau khi mua về được để ổn định 3, tiêm màng bụng

STZ (pha citrate pH=4,5) với liều 150 mg/kg [Error! Reference source not

found.]

b) Phương pháp gây chuột ĐTĐ type 2

Nhóm 1: nhóm ăn thường (ND-normal diet) Chuột được nuôi bằng chế

độ ăn bình thường (thức ăn chuẩn do viện vệ sinh Dịch tễ cung cấp) Nhóm 2: nhóm nuôi béo (HFD-high fat diet) ăn thức ăn giàu chất béo trong vòng 8 tuần

Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 bằng cách tiêm màng bụng STZ 120 mg/kg (pha trong đệm citrate 0,01M, pH 4,3)

Sau khi tiến hành tiêm STZ với liều 120 mg/kg, các con chuột tiếp tục được nuôi bằng chế độ dinh dưỡng như ban đầu Đo nồng độ đường huyết lúc đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày Sau 14 ngày lấy máu định lượng đường huyết

c) Phương pháp định lượng glucose huyết

Định lượng đường huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxi hóa nhờ xúc tác của các enzyme trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy One Touch Profile Meter của hãng Johnson&Johnson

d) Phương pháp định lượng cholesterol toàn phần, triglyceride HDLc, LDLc

Định lượng cholesterol toàn phần theo phương pháp của Deeg và Zlegenhorn và định lượng triglycerid huyết thanh theo phương pháp của McGowan, định lượng HDL, LDL trên máy xét nghiệm sinh hóa máu bán tự động TC plus 80

e) Phương pháp thử tác dụng hạ glucose huyết

 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống Nopal trên chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ: