Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết và mỡ máu của dịch chiết cây trâm "Syzygium spp

Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết mỡ máu dịch chiết trâm "Syzygium spp" : \ Luận văn ThS Sinh học: 60 42 30 \ Đinh Hải Linh ; Nghd : GS.TS Đỗ Ngọc Liên MỤC LỤC Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ SINH THỰC VẬT 11 1.1.1 Đặc điểm chung phân loại 11 1.1.2 Terpen thực vật 11 1.1.3 Tannin 12 1.1.4 Hợp chất coumarin 12 1.1.5 Alkaloid thực vật 13 1.1.6 Flavonoid thực vật 14 1.1.6.1 Sinh tổng hợp flavonoid thực vật Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.1.6.2 Cấu tạo hóa học phân loại Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.1.6.3 Tính chât lý học, hóa học flavonoid.Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.1.6.4Tác dụng sinh dược học Flavonoid.Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2 BỆNH BÉO PHÌ 14 1.2.1 Vài nét bệnh béo phì 15 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh 1.2.2 Tác hại nguy bệnh béo phìLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.3 Các yếu tố gây tình trạng thừa cân béo phìLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.3.1 Yếu tố di truyền Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.3.2 Yếu tố nội tiết Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.3.3 Khẩu phần ăn thói quen ăn uống Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.3.4 Yếu tố kinh tế xã hội Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.4 Một số số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi chất lipid glucid Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.5 Rối loạn lipid máu thuốc điều trị Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.2.6 Bệnh lý phát sinh béo phì chiến lược điều trịLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.3 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 16 1.3.1 Định nghĩa 16 1.3.2 Dịch tễ học đái tháo đường Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.3.3 Phân loại đái tháo đường Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.3.4 Tác hại đái tháo đường ……………………………………………… 36 1.4 Streptozotocin Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 1.5 Trâm lý 17 1.5.1 Thực vật học 17 1.5.2 Một số nghiên cứu nước giới Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG 18 2.1.1 Thực vật 18 2.1.2 Động vật 18 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh 2.1.3 Hoá chất dụng cụ thí nghiệm 19 2.1.3.1 Hoá chất 19 2.1.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Tách chiết phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý 19 2.2.2 Định tính số nhóm hợp chất tự nhiên Trâm lý phương pháp hoá học 19 2.2.2.1 Định tính flavonoid Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 2.2.2.2 Định tính tanin Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 2.2.2.3 Định tính polyphenol khác Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 2.2.2.4 Định tính glycoside Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 2.2.2.5 Định tính alkaloid Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định 2.2.3 Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên sắc ký lớp mỏng 19 2.2.4 Định lượng hợp chất polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau 19 2.2.5 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý lên trọng lượng số số hoá sinh mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm 19 2.2.5.1 Mô hình nuôi chuột béo phì thực nghiệm 19 2.2.5.2 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý lên trọng lượng số số hoá sinh mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm 19 2.2.5.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý mô hình chuột gây đái tháo đường typ 19 2.2.5.4 Định lượng đường máu theo phương pháp enzyme quang học 20 2.2.5.5 Định lượng triglycerid huyết theo phương pháp enzym 20 2.2.5.6 Định lượng cholesterol toàn phần huyết theo phương pháp enzym đo màu 20 2.2.5.7 Sử lý số liệu theo thống kê sinh học 20 2.2.6.1 Phương pháp phân lập hợp chất 20 2.2.6.2 Quy trình phân lập hợp chất 20 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh 2.2.6.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 20 2.2.6.4 Sắc ký cột (CC) 50 2.2.6.5 Các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN 21 3.2 ĐỊNH TÍNH FLAVONOID BẰNG CÁC PHẢN ỨNG HOÁ HỌC ĐẶC TRƯNG 22 3.3 ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT POLYPHENOL TỔNG SỐ 22 3.4 TÌM HIỂU TÁC DỤNG CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT TỪ HẠT QUẢ TRÂM LÝ LÊN TRỌNG LƯỢNG VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ HOÁ SINH TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NUÔI BÉO PHÌ THỰC NGHIỆM 23 3.4.1 Kết nuôi chuột mô hình nuôi béo phì thực nghiệm 23 3.4.2 Tìm hiểu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý lên trọng lượng số số hoá sinh mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm 263 3.4.3 Kết gây mô hình chuột đái tháo đường typ 32 3.4.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý mô hình chuột đái tháo đường typ 76 3.5 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất………………………… 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 KẾT LUẬN 38 KIẾN NGHỊ 89 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh DANH MỤC BẢNG Bảng Tỷ lệ người béo phì (%) số nước giới 16 Bảng Phân loại rối loạn lipid máu theo Fredickson Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Bảng 3: Chi phí điều trị bệnh béo phì số nước giớiLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Bảng Thành phần thức ăn giàu lipit Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Bảng hiệu suất chiết qua cá phân đoạn dịch chiết Trâm lý 21 Bảng Đặc điểm băng vạch dịch chiết Trâm lý sắc ký đồ Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Bảng Thành phần số hợp chất tự nhiên dịch chiết EtOAc từ Trâm lý 22 Bảng Hàm lượng hợp chất polyphenol tổng số chế phẩm từ Trâm lý 22 Bảng Trọng lượng trung bình lô chuột thí nghiệm nuôi với chế độ thức ăn khác 23 Bảng 10 Một số số hoá sinh lô chuột gây béo phì thực nghiệm lô thường 25 Bảng 11 Trọng lượng chuột sau 03 tuần điều trị 26 Bảng 12 Nồng độ Glucose (mmol/l) chuột béo phì sau 03 tuần điều trị 27 Bảng 13 Nồng độ Cholesterol (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị 28 Bảng 14 Nồng độ Triglycerid (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị 29 Bảng 15 Nồng độ HDLC (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị 30 Bảng 16 Nồng độ LDLC (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị 72 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Bảng 17 Nồng độ Glucose huyết chuột béo phì sau 07 ngày tiêm STZ 32 Bảng 18 Nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột phép thử dung nạp Glucose theo thời gian 33 Bảng 19 Kết đo glucose huyết (mmol/l) chuột đái tháo đường typ trước sau điều trị 34 Bảng 20 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 1…………………… 86 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh DANH MỤC HÌNH Hình Một số hợp chất thuộc nhóm terpenLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Cấu trúc hoá học tannin Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Khung cấu trúc coumarin Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Một số loại alkaloid thực vật Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Khung carbon flavonoid Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Cấu trúc Streptoztocin Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình7 Cơ chế gây độc STZ lên tế bào ß tụy đảo chuột MIT-ty thể, XOD – xanthine oxidase ß Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình Quả hạt Trâm lý ……………… 18 Hình Mô hình chiết rút phân đoạn hợp chất tự nhiên từ Trâm lý Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình 10 Sơ đồ chiết tách phân đoạn Trâm lýLỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Hình 11 Sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết Trâm lý 21 Hình 12 Biểu đồ trọng lượng trung bình lô chuột thí nghiệm nuôi với chế độ thức ăn khác sau tuần nuôi 24 Hình 13 Hình ảnh chuột béo phì 24 Hình14 Hình ảnh chuột nuôi hai chế độ ăn khác 24 Hình 15 Biểu đồ số số hoá sinh lô chuột gây béo phì thực nghiệm lô thường 25 Hình 16 Biểu đồ trọng lượng lô chuột thí nghiệm sau 03 tuần cho uống phân đoạn dịch chiết 27 Hình 17 Biểu đồ Glucose huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị 28 Hình 18 Biểu đồ Cholesterol huyết chuột béo phì sau 03 tuần điều trị 29 Hình 19 Biểu đồ Triglycerid chuột sau tuần điều trị 30 Hình 20 Nồng độ HDLC huyết (mmol/l) chuột trước sau điều trị 31 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 21 Nồng độ LDLC chuột béo phì trước sau điều trị 72 Hình 22 Biểu đồ nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột béo phì gây đái tháo đường typ STZ sau ngày 33 Hình 23 Nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột phép thử dung nạp Glucose theo thời gian 34 Hình 24 Biểu đồ số đường huyết chuột trước sau tuần điều trị 35 Hình 25 Phổ proton hợp chất 1……………………… 80 Hình 26 Phổ cacbon hợp chất 1……………………… 81 Hình 27 Phổ cacbon hợp chất 1………………………… .82 Hình 28 Phổ DEPT hợp chất 1……………………………………………… 83 Hình 29 Phổ DEPT hợp chất 1……………………………………………… 84 Hình 30 Phổ DEPT hợp chất 1……………………………………………… 85 Hình 30 Cấu trúc hóa học hợp chất (Quercetin)Lỗi! Thẻ đánh dấu không xác định Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) béo phì tình trạng tích luỹ mỡ mức không bình thường vùng thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khoẻ Cùng với thừa cân- béo phì, bệnh mãn tính đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh tim mạch ung thư gia tăng nhanh chóng năm gần Bệnh thừa cân- béo phì tăng lên rõ rệt nhanh chóng nước phát triển mà nước phát triển Theo tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì ( Internation Obesity Tast Force – IOTF) nghiên cứu, giới có 64 triệu người thừa cân mắc bệnh béo phì [3,9, 15, 16] Các kết điều tra tiến hành gàn cho thấy, Mỹ nước có số dân béo phì nhiều giới với khoảng 60 triệu người bị béo phì Theo thống kê Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (1991), tỷ lệ người thừa cân béo phì số nước Châu Á sau: Thái Lan 3,58%, Philipin 4,27%, Malaysia 3,01%, Nam Triều Tiên 2,08%, Đài Loan 1,6%, HongKong 3% [3,9,15] Theo điều tra viện dinh dưỡng cho thấy tình trạng thừa cân, béo phì Việt Nam tăng nhanh, tỷ lệ béo phì người trưởng thành từ 25-64 tuổi, lên tới 16,8%[15, 9], điều kinh tế nông nghiệp đô thị hoá nước ta phát triển kéo theo vấn đề môi trường sinh thái lối sống ăn uống không khoa học, nên bệnh béo phì bệnh liên quan đái tháo đường tim mạch gia tăng mạnh năm gần Hiện chi phí điều trị bệnh béo phì tốn kém, ví dụ Hoa Kỳ năm 1997, chi phí cho điều trị bệnh béo phì 47,6 tỷ đô la [3, 9, 15, 16] Hơn loại thuốc tân dược dùng tên thị trường thường gây nhiều phản ứng, giá thành đắt Trong năm gần có nhiều công trình nghiên cứu hợp chất tự nhiên từ cỏ để chữa bệnh béo phì đái tháo đường, loại thuốc dược liệu từ cỏ thường gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng thuốc có hiệu kéo dài [1, 4, 7] Các nghiên cứu dịch chiết hợp chất tự nhiên Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh từ noni (Morinda citryfolia) có nhiều tác dụng tốt trao đổi lipid – glucid chống tổn thương oxy hoá cao Vấn đề khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có tác dụng chữa bệnh hướng không nước ta mà nước khác giới Trâm có tên khoa học Syzygium spp thuộc họ Myrtaceace, loại quen thuộc với người Việt Nam, có nhiều công dụng chữa bệnh Hiện Việt Nam, hướng nghiên cứu để điều trị bệnh béo phì biến chứng bệnh nan y khác có liên quan với béo phì chưa có nhiều công trình khoa học quan tâm Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, Trâm có tác dụng làm giảm cholesterol máu, gián tiếp ngăn ngừa béo phì xơ cứng mạch máu [19] Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học tác dụng dược lý loài thuốc có giá trị Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng cách hợp lý, hiệu hạt có tầm quan trọng đặc biệt Dựa thuốc dân gian chữa bệnh ĐTĐ định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết mỡ máu dịch chiết Trâm (Syzygium spp)” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực với mục tiêu sau: - Tìm hiểu thành phần hóa học Trâm - Tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết mỡ máu số phân đoạn dịch chiết Trâm mô hình chuột gây béo phì ĐTĐ thực nghiệm typ - Phân tích cấu trúc số chất có tác dụng hạ đường huyết mỡ máu dịch chiết Trâm mô hình chuột gây béo phì ĐTĐ thực nghiệm typ 10 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 16 Biểu đồ trọng lượng lô chuột thí nghiệm sau 03 tuần cho uống phân đoạn dịch chiết Nồng độ glucose huyết chuột béo phì sau 03 tuần điều trị Bảng 12 Nồng độ Glucose (mmol/l) chuột béo phì sau 03 tuần điều trị số Lô Chỉ Glucose (BT) Trước 6,3 điều trị Sau điều trị Lô Lô Lô Lô (B, EtOAc) 7,6 7,9 ± 0,14 ± 0,2 % thay đổi 0% Lô (B,KĐT) (B, Metf) (B, EtOH) (B, n-Hex) (B, Clor) ± 0,14 ± 0,2 6,3 Lô 7,59 7,64 7,7 7,58 7,68 ± 0,39 ± 0,08 ± 1,32 ± 0,87 ± 1,2 6,7 6,9 7,2 7,3 6,8 ± 0,13 ± 0,11 ± 0,95 ± 1,5 ± 0,92 ↓6.49% ↓3.69% ↓11.34% ↑3.95% ↓11.73% ↓9.69% 27 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 17 Biểu đồ Glucose huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị Nồng độ cholesterol huyết chuột béo phì sau 03 tuần điều trị Bảng 13 Nồng độ Cholesterol (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị số Chỉ Cholesterol Trước điều trị Sau điều trị % thay đổi Lô Lô Lô (BT) (B,KĐT) (B, Metf) Lô Lô Lô (B, (B, n-Hex) (B, Clor) (B, EtOH) Lô EtOAc) 2,48 4,11 4,00 3,92 4,27 4,24 4,18 ± 0,25 ± 0,32 ± 0,18 ± 0,21 ± 0,22 ± 0,17 ± 0,28 2,48 4,17 3,05 3,39 3,8 3,85 3,21 ± 0,25 ± 0,32 ± 0,13 ± 0,11 ± 0,95 ± 0,19 ± 0,54 ↑1% ↓23.75% ↓13.52% ↓11.01% ↓9.20% ↓23.21% 28 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 18 Biểu đồ Cholesterol huyết chuột béo phì sau 03 tuần điều trị Nồng độ triglycerid sau 03 tuần điều trị Bảng 14 Nồng độ Triglycerid (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị Chỉ số Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Triglycerid (BT) (B,KĐT) (B, Metf) (B, EtOH) (B, n-Hex) (B, Clor) (B, EtOAc) Trước 1,50 điều trị Sau điều trị 0,97 ± 0,07 ± 0,16 0,97 1,54 ± 0,07 ± 0,16 % thay đổi 0% ↑3% 1,52 1,51 1,50 1,48 1,47 ± 0,16 ± 0,05 ± 0,07 ± 0,03 ± 0,04 1,08 1,22 1,42 1,45 1,17 ± 0,09 ± 0,13 ± 0,08 ± 0,04 ± 0,05 ↓28.95% ↓19.21% ↓5.33% ↓2.03% ↓20.41% 29 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 19 Biểu đồ Triglycerid chuột sau tuần điều trị Bảng 15 Nồng độ HDLC (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị Chỉ số HDLC Trước Lô % thay đổi Lô Lô Lô Lô 1,13 1,17 1,11 1,12 1,19 1,09 ± 0,13 ± 0,09 ± 0,12 ± 0,07 ± 0,19 ± 0,08 1,13 1,72 1,45 1,38 1,32 1,52 ± 0,21 ± 0,15 ± 0,09 ± 0,14 ± 0,05 ± 0,16 ± 0,11 0% 0% ± 0,21 Sau điều 2,00 trị Lô (BT) (B,KĐT) (B, Metf) (B, EtOH) (B, n-Hex) (B, Clor) (B, EtOAc) 2,00 điều trị Lô ↑47.01% ↑30.63% 30 ↑23.21% ↑10.92% ↑39.45% Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 20 Nồng độ HDLC huyết (mmol/l) chuột trước sau điều trị Nồng độ LDLC chuột béo phì sau 03 tuần điều trị Bảng 16 Nồng độ LDLC (mmol/l) huyết chuột béo phì trước sau 03 tuần điều trị Chỉ số LDLC Trước Lô % thay đổi 1,86 ± 0,11 ± 0,15 Sau điều 0,64 trị Lô Lô Lô Lô Lô (BT) (B,KĐT) (B, Metf) (B, EtOH) (B, n-Hex) (B, Clor) (B, EtOAc) 0,64 điều trị Lô 1,87 ± 0,11 ± 0,14 0% 0.5% 1,83 1,87 1,88 1,91 1,80 ± 0,13 ± 0,17 ± 0,21 ± 0,14 ± 0,19 1,09 1,35 1,42 1,49 1,17 ± 0,09 ± 0,14 ± 0,05 ± 0,16 ± 0,11 ↓40.44% ↓27.81% ↓24.47% ↓21.99% ↓35.00% 31 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Hình 21 Nồng độ LDLC chuột béo phì trước sau điều trị 3.4.3 Kết gây mô hình chuột đái tháo đường typ Gây mô hình chuột đái tháo đường typ Chuột sau nuôi mô hình gây béo phì thực nghiệm gây đái tháo đường Type II cách tiêm vào ổ bụng STZ liều thấp (120mg/kg thể trọng) Bảng 17 Nồng độ Glucose huyết chuột béo phì sau 07 ngày tiêm STZ Mức độ tăng M0 (g) M3 (g) glucose huyết sau 07 ngày (%) 6,3 6,3 ± 0,14 ± 0,14 7,6 7,9 tiêm STZ ± 0,2 ± 0,2 Lô béo phì tiêm 7,58 19,75 ± 0,17 ± 0,29 Lô thường Lô béo phì không STZ 32 0% 3,95% 160,55% Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Mx: Nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột béo phì tuần tiêm STZ (coi tuần trước ngày tiêm STZ tuần 0) Hình 22 Biểu đồ nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột béo phì gây đái Kết thử dung nạp glucose đường uống Để khẳng định chắn kết xây dựng chuột đái tháo đường type 2, tiến hành phép thử dung nạp Glucose Bảng 18 Nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột phép thử dung nạp Glucose theo thời gian Lô chuột Nồng độ Glucose huyết Tỷ lệ % thay 0’ 30’ 90’ 120’ đổi Lô 6,0 7,3 8,2 6,2 3.33% Lô 6,2 7,8 9,2 7,5 12.90% 33 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh Lô 7,7 8,7 10,3 8,2 6.49% Lô 19,4 23,2 26,8 26,74 37.84% Hình 23 Nồng độ Glucose huyết (mmol/l) chuột phép thử dung nạp Glucose theo thời gian 3.4.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết từ Trâm lý mô hình chuột gây đái tháo đường typ Dựa vào kết thí nghiệm trên, ta thấy cao phân đoạn dịch chiết EtOAc EtOH Trâm lý có tác dụng hạ glucose huyết chuột béo phì tốt hai phân đoạn Cloroform n-hexan, vị tiến hành nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết chuột gây đái tháo đường typ cao phân đoạn dịch chiết EtOAc EtOH Bảng 19 Kết đo glucose huyết (mmol/l) chuột đái tháo đường typ trước sau điều trị Nồng độ glucose huyết (mmol/l) Lô Lô 34 Lô Lô Lô Lô Luận văn thạc sĩ M0 M3 Mức giảm (%) Đinh Hải Linh 6,3 7,74 19,75 19,62 19,54 19,83 ± 0,14 ± 0,09 ± 0,29 ± 0,18 ± 0,24 ± 0,33 6,25 7,88 19,82 11,95 15,62 13,38 ± 0,1 ± 0,15 ± 0,22 ± 0,31 ± 0,14 ± 0,12 ↑1% ↑2% ↑0% ↓39% ↓20% ↓33% Mx: Nồng độ glucose huyết chuột (coi tuần trước ngày điều trị tuần 0) Hình 24 Biểu đồ số đường huyết chuột trước sau tuần điều trị PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT Từ kết trên, nhận thấy phân đoạn ethylacetat có khả làm giảm trọng lượng chuột béo phì nồng độ glucose huyết chuột đái tháo đường typ tốt, gần tương đương với metformin Để hiểu rõ thành 35 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethylacetat, tiến hành phân lập xác định cấu trúc hóa học số hợp chất phân đoạn Cặn chiết ethylacetat (8g) phân lập từ cột sắc ký pha thường với hệ dung môi Clorofoc: methanol tỉ lệ (50:1, 10:1, 1:1,…), thu phân đoạn A, B, C, D Phân đoạn B tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải clorofoc: methanol tỉ lệ (8: 1,…) thu hợp chất có dạng bột màu vàng Phổ ESI-MS xuất tín hiệu m/z 303 [M+H]+ positive m/z 301 [M-H]- negative gợi ý cho số khối 302 với công thức cộng C15H10O7 Phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất flavonoid với vùng tín hiệu dH từ 6,18 ppm đến 7,64 ppm Sự xuất tín hiệu proton vòng thơm với hệ tương tác spin ABX dH 7,42 (1H, d, J = 2,0 Hz), dH 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz) dH 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz) cho thấy nhóm vào vòng B phải nằm vị trí C-3’ C-4’ Trên vòng A, giá trị dH 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) dH 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz) khẳng định vòng A bị vị trí Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 15 cacbon thuộc vùng cộng hưởng vòng thơm, phổ DEPT xác định có cacbon bậc (CH) cacbon bậc (C) Các giá trị dC 158,19 104,49 điển hình cho C-9 C-10 vòng A hợp chất flavonoid có nối đôi C-2/C-3 Bên cạnh giá trị độ chuyển dịch hóa học dC 99,22 94,40 cho thấy vòng A có thêm nhóm OH vị trí C-7 Phân tích kiện phổ thu so sánh với chất Quercetin tài liệu công bố [6] Hợp chất xác định Quercetin có tên gọi 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, hợp chất phổ biến tìm thấy nhiều loài thực vật thiên nhiên Bảng 20 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất C [1]b,aC* d, e C 146.8 147.96 d,f H mult (Jin Hz) - 36 Luận văn thạc sĩ a Đinh Hải Linh 135.6 137.19 - 175.7 177.27 - 160.6 162.45 - 98.1 99.22 6.18 d (2.0) 163.8 165.51 - 93.3 94.40 6.38 d (2.0) 156.1 158.19 - 10 103.0 104.49 - 1′ 121.9 124.13 - ′2 115.1 115.98 7.42 d (2.0) 3′ 145.0 146.17 - 4′ 147.6 148.72 - 5′ 115.5 116.20 6.88 d (8.5) 6′ 119.9 121.67 7.64 dd (2.0 8.5) Đo dung môi DMSO;b75 MHz;c300 MHz;.dĐo dung môi MeOD; e 125 MHz.f500 MHz; * tín hiệu bị che khuất, *dCa,b quercetin[6] Cấu trúc hóa học hợp chất thể hình 25 với công thức phân tử C15H10O7 Như vậy, phân đoạn ethylacetat Trâm lý, phân lập hợp chất Quercetin Theo nhiều tài liệu, Quercetin có tác dụng kích thích sửa chữa AND ngăn chặn phát triển tế bào ung thư, chống oxy hóa mạnh, làm bền thành mạch máu…Quercetin chứng minh có khả làm giảm cholesterol máu, giảm trọng lượng chuột béo phì thực nghiệm làm giảm glucose huyết chuột đái tháo đường type 37 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Các phân đoạn dịch chiết có hợp chất tự nhiên: flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid, chủ yếu flavonoid phân tích phản ứng hóa học đặc trưng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng silicagel: phân đoạn cao cồn tổng số (7 băng), phân đoạn n hexan (2 băng), phân đoạn chloroform (6 băng), phân đoạn ethylacetat (3 băng) Đã áp dụng thành công mô hình chuột béo phì đái tháo đường typ thực nghiệm thức ăn có hàm lượng Lipid cao tiêm STZ liều đơn, trọng lượng chuột báo phì tăng gấp 1,7 lần so với lô chuột ăn thức ăn thường, nồng độ glucose huyết chuột đái tháo đường typ tăng gấp 1,61 lần so với chuột béo phì không tiêm STZ liều đơn.Sau điều trị dịch chiết Trâm lý, nồng độ glucose huyết số mỡ máu chuột béo phì, chuột đái tháo đường typ giảm, cao phân đoạn dịch chiết ethylacetat cho kết điều trị tốt 3.Đã xác định cấu trúc hóa học hợp chất tự nhiên dịch chiết phân đoạn ethylacetat Quercetin KIẾN NGHỊ Tinh chế hàm lượng lớn Quercetin có dịch chiết phân đoạn ethylacetat để nghiên cứu khả làm giảm trọng lượng thê, số số sinh hóa chuột béo phì chuột đái tháo đường typ 2 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết ethylacetat chất tinh khiết Quercetin lên số emzyme chuột liên quan đến trình trao đổi lipid – glucid 38 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Trương Quốc Bảo, Hải Ngọc (1994), “tiêu khát”, Chữa bệnh nội khoa Y học cổ truyền, tr 211 – 215 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập I, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 1061 – 1063 Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý tảng– tăng glucose máu, NXB Y học, Hà Nội Bộ môn Y học Cổ truyền dân tộc – Trường Đại học Y Hà Nội (1999), “Đái tháo đường”, Y học cổ truyền, NXB Y học, tr 542 – 543 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Quốc Khang, Đào Kim Nhung (1997), thực tập sinh hoá, Đại học Tổng hợp Hà Nội Đỗ Hùng Cường, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Ngọc Liên (2009) “Tác dụng chống béo phì rối loạn trao đổi chất dịch chiết dọc (Garcinia multiflora) chuột béo phì thực nghiệm” Tạp chí Y học Việt Nam 2009/số Trang 56 – 62 Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 136 – 140 Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến, (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, NXB Y học, Hà Nội Trần Tử Dương (2002), Rối loạn lipid máu, giảng sau đại học – Cục Quân Y, tr 117 – 132 10 Nguyễn Công Khẩn (2007) “Thừa cân, béo phì số yếu tố liên quan người trưởng thành Việt Nam từ 25 – 64 tuổi” Chiến lược quốc gia dinh dưỡng giai đoạn 2001 – 2010 NXB Y học Hà Nội 11 Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi, Nguyễn Lân Dũng, (1989), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Khoa học Kinh tế, Hà Nội 12 Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Văn Phúc, Vũ Công Phong, Phùng Thanh Hương (2010) “Tác dụng dịch chiết cùi bưởi Citrus grandis (L.) Obeck đến số enzyme trao đổi lipid-saccarit số số lipid, glucose máu chuột béo phì đái tháo đường thực nghiệm” Tạp chí khoa học-Journal of science.VNU Tập 26, số 2010 13 Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Chử Lương Luân, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Trần Văn Ơn (2010) “Xác định cấu trúc Quercetin 3-Ob-D-Glucopyranoside Myricitrin tinh từ phân đoạn dịch chiết khế (Averrhoa carambola L.) có tác dụng hạ glucose huyết chuột đái tháo đường thực nghiệm” Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học Tự nhiên công nghệ Tập 26 (4) Trang 242 – 247 14 Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Ngọc Liên, Lê Minh Hà (2009) “Nghiên cứu số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết cùi bưởi Năm roi (Citrus grandis L.) có tác 39 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh dụng giảm thể trọng mỡ máu chuột béo phì thực nghiệm” Tạp chí hóa học ứng dụng Số 18 (102) 2009 Trang 36 – 40 15 Đỗ Trung Quân (2007), “Đái tháo đường Điều trị”, NXB Y học 16 Trần Đức Thọ (2002), “Bệnh đái tháo đường”, Bài giảng bệnh nội khoa, tập I, NXB Y học, tr.258 – 272 17 Nguyễn Văn Thu (2004), “Bài giảng dược liệu tập 1”, NXB Y học, tr 240, 335, 368 18 Đỗ Thị Tính (2001), “Góp phần nghiên cứu rối loạn Lipid máu bệnh nhân béo phì thông số hoá sinh”, Luận án Tiến Sỹ Y học – Hà Nội Tiếng Anh Antolovich M, Prenzler.P, Robards K, Ryan D (2000), “Sample preparation in the determination of phenolic compounds in fruits”, analyst, 215, pp 989 – 1009 Andersen M., Kenneth R.M., (2006), “Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications”, CRC Press, Taylor & Francis Group Barnett H H;and Kumar S.(2009), Obesity and diabetes,second edition,Wiley Blackwell,Printed in Great Britain Bhavana S., Satapathi S K., Roy P (2007), Hypoglycemic and Hypolipidemic effect of Aegle marmelos L leaf extract on Streptozotocin induced diabetic mice International Journal of Pharmacology (6) 444 – 452 Cannell R J P (1989), Natural Products Isolation, Humana Press, pp 354 Chien-Chang Shen, Yuan-Shiun Chang, and Li-Kang Ho, Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, Vol 34, No 3, pp 843-845 Dattajirao K., Iliya P (1990), “Dietary Tannins”, pp – Foster D.W (1998), “Diabetes mellitus”, Harrison/s principles of internal medicine, McGrw – Hill, Vol 2, pp 1979 – 2000 Greesman (1975), “The chemistry of flavonoid compounds” Academicporess, London 10 Harbonne J B (1994), The flavonoids advance in research since 1986, Chapman & Hall, pp – 676 11 Haslam (1989), “Plant polyphenol-vegetable Tannins” Revisited Chemistry and Pharmacology of Natural products, Cambridge University Pres, Cambride, pp 165 12 Hayerman A E., Bulter I G (1994), “Assay of condensed tannin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant” Meth, Enz, Vol 234, pp 249 13 Henning Beck – Nielse and Ole Hother – Nielsen (1996), “obesity in non – insulin dependent diabetes mellitus” Diabetes Mellitus, Lippincott – Raven, New York, pp 475 – 483 14 Ji – Won Yoon (1996), “Role of viruses in the pathogenesis of insulin dependent diabetes mellitus”, Diabetes Mellitus, Lippincott – Raven, New York, pp 339 – 347 15 John H Karam (1998), “Pancreatic Hormones and Antidiabetes drugs” Basic and Clincal Pharmarcology, Appleton and Lange, pp 684 – 705 40 Luận văn thạc sĩ Đinh Hải Linh 16 Karamali Khanbabaee and Teunis va Ree (2001), “Tannins : Classfication and Definition”, Nat.Prod.Rep, 18, pp 641– 649 17 Lenzen S (2008) “The mechanisms of alloxan and streptozocin-induced diabetes” Diabetologia 51:216-226 18 Lorke D A (1983), “A new approach to practical acute toxicity testing”, Arch Toxicol , Vol 54, pp 275 – 287 19 Mohammed Rahmatullah, Mst Afsana Khatun, Niaj MorshedDivision (1995), “A Randomized Survey of Medicinal Plants used by Folk Medicinal Healers of Sylhet”, Advances in Natural and Applied Sciences-American Eurasian Network for Scientific Information, Vol.4, pp 52-62 20 Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata, AlphaGlucosidase inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris), Food Chemistry, 2006, 103, 1319-1323 21 Payene R L., Bidner T D., Southern L L., and Geaghan (2001), “Effect of dietarysoy isoflavones on growth, carcass traits and meat quality in growing finishing figs”, J Anim Sci 2001, 79, pp 2130 – 2139 22 Rajnikant, Dinesh and Kamni (2005), “Weak C – H …O hydrogen bonds in Alkaloids: An overview”, Bull Master Sci, vol 28, No 3, pp 187 – 198 23 Rence J G., Tetsusok (2000), “Plant – fungal interaction the search for phytoalexin and other antifungal compounds from higher plants” Phytochemistry, Vol 56, pp 253 – 263 24 Richard J Comi (1996), “drug – induced diabetes”, Diabetes Mellitus, Lippincott – Raven, New York, pp 491 – 495 25 Rodney Croteau, Toni M Kuchan, Norman G Lewis (2002), Natural products (secondary metabolites), Chapter 24, pp 2150 –1318 26 Schinari R., Lin Y M., Anderson H (2007), “In vitro anti – HIV activity of flavonoids isolated from Rhus succedanea and Garcinia multiflora”, J Nat Prod, Sep, 60(9), pp 884 – 888 27 Singleton V.L., Orthofer V.L., Lamuela-Raventos R.M., (1999), “Analysis of total phenols and other oxydation substrates and antioxidants by means of ForlinCiocalteu Reagent”, Methods in Enzymemology, pp 152-178 28 Srinivasan K., Viswanad., Asrat.L., Kaul C L., Ramarao P (2005), “Combination of hight – fat – diet – fet and low-does STZ treated rat: A model for type diabetes and pharmacological screening” Pharmacological Reseach 52 (2005), pp 313 – 320 29 Soumyanath A.(2006), Traditional medicines for modern times: anti-diabetic plants, CRP press 30 Tan B K H., Tan C H., Pushparaj N P (2005), “Anti-diabetic activity of the semi – purified fractions of Averrhoa bilimbi in high fat diet fed –streptozotocindinduced diabetic rats”, Life Sciences, Vol.76, pp 2827 – 2839 31 Trudy McKee; James R.McKee, Biochemistry, Second Edition, 1999, The McGraw-Hill Companies, p 558-574 41