Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số chủng bacillus nuôi cấy trên môi trường dịch chiết cám gạo, cám ngô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS NI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG DỊCH CHIẾT CÁM GẠO, CÁM NGÔ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 7420201 Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Kim Dung Sinh viên thực : Ngô Thị Vân Anh Mã Sinh Viên : 1753070222 Lớp : K62 – CNSH Khóa học : 2017 - 2021 Hà Nội, 2021 LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban giám hiệu Trường Đại học Lâm Nghiệp, lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp giáo viên hướng dẫn tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng Bacillus ni cấy môi trường dịch chiết cám gạo, cám ngô’’ Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc tích cực đến đề tài hồn thành Để có kết trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Dung – Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, ban lãnh đạo cán nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Mặc dù cố gắng để hồn thành khóa luận tốt nghiệp song hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên tránh khỏi thiếu sót tồn định Để báo cáo hồn thiện kính mong nhận lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Ngô Thị Vân Anh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu cám gạo, cám ngô 1.1.1 Giới thiệu cám gạo 1.1.2 Giới thiệu cám ngô 1.2 Tổng quan probiotic – xu hướng nghiên cứu ứng dụng 1.2.1 Khái niệm probiotic 1.2.2 Cơ chế tác động probiotic 1.2.3 Vai trò Probiotic 1.2.4 Tiêu chuẩn chọn chủng Probiotic 10 1.2.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam 12 PHẦN II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu địa điểm nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng dinh dưỡng cám gạo, cám ngô 20 2.4.2 Phương pháp tạo dịch chiết cám gạo, cám ngô 25 2.4.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết đến khả sinh trưởng chủng Bacillus 25 2.4.4 Phương pháp xác định khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 27 ii 2.4.5 Phương pháp xác định khả sinh enzyme ngoại bào 28 2.4.6 Phương pháp xác định khả kháng khuẩn 30 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 31 PHẦN III : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Hàm lượng dinh dưỡng cám 32 3.1.1 Hàm lượng đường khử 32 3.1.2 Hàm lượng cellulose mẫu thí nghiệm 33 3.1.3 Hàm lượng protein có mẫu cám 34 3.1.4 Hàm lượng tinh bột mẫu cám 35 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh trưởng số chủng Bacillus 35 3.3 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh axit lactic số chủng Bacillus 37 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh enzyme ngoại bào số chủng Bacillus 39 3.5 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả kháng vi sinh vật gây bệnh số chủng Bacillus 41 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Diễn giải CFU Colonies Forming Unit (Mật độ tế bào) CMC Carboxyl methyl cellulose CP Protein thô Cs Cộng DM Chất khô DNS Axit Dinitro - Salicylic ĐC Đối chứng GRAS IDF Insoluble dietary fiber 10 LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn sinh axit lactic) 11 M – CG Môi trường MRS bổ sung dịch chiết cám gạo 12 M – CN Môi trường MRS bổ sung dịch chiết cám ngô 13 ME 14 MRS Man, Rogosa and Sharpe 15 NDF Chất xơ tẩy rửa trung tính 16 NSP Non Starch Polysaccharide (tổng số polysaccharid khơng phải tinh bột) 17 SDA Sabouraud Dextrose Agar 18 SDF Soluble dietary fiber 19 TT 20 VCK Vật chất khô 21 VSV Vi sinh vật 22 WHO World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới Generally Recognized As Safe Năng lượng trao đổi Thứ tự iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học cám gạo Bảng 1.2 Các amino axit thiết yếu cám gạo Bảng 1.3 Thành phần cám ngô Bảng 2.1a Thí nghiệm xác định sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám gạo (CFU/ml) 26 Bảng 2.1b Thí nghiệm xác định sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám ngô (CFU/ml) 27 Bảng 2.2a Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung cám gạo 28 Bảng 2.2b Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung cám ngô 28 Bảng 2.3 Khả sinh enzyme chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 29 Bảng 2.4a Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 31 Bảng 2.4b Khả kháng nấm kiểm định chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 31 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ đường khử bước sóng 540nm 32 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ đường khử bước sóng 540nm mẫu thí nghiệm độ pha lỗng khác 33 Bảng 3.3 Khối lượng cellulose thu sau trình tách chiết 33 Bảng 3.4 Kết đo OD phức protein với thuốc nhuộm CBB bước sóng 595nm độ pha lỗng khác 34 Bảng 3.5 Kết hàm lượng tinh bột thu phương pháp Bertand 35 Bảng 3.6a Khả sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám gạo (CFU/ml) 36 Bảng 3.6b Khả sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám ngô (CFU/ml) 36 v Bảng 3.7a Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo 38 Bảng 3.7b Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám ngô 38 Bảng 3.8 Khả sinh enzyme chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 39 Bảng 3.9a Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 41 Bảng 3.9b Khả kháng nấm A niger chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô 42 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cám gạo Hình 1.2 Cám ngơ Hình 1.3 Sản phẩm Probiotic BioSpring 16 Hình 1.4 Sản phẩm probiotic ICFOOD 16 Hình 1.5 Sản phẩm probiotic Bio-Pharmachemie 17 Hình 1.6 Sản phẩn probiotic BioOne 17 Hình 2.1 Sơ đồ tạo dịch chiết 25 Hình 3.1 Đường chuẩn nồng độ đường khử với mật độ quang OD540nm 32 Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng B mojavensis 39 Hình 3.3 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng B amyloquefacien 40 Hình 3.4 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng B mojavensis 42 Hình 3.5 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng B amyloquefacien 43 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Đã từ lâu lúa ngơ khơng lương thực mà cịn làm vật liệu thức ăn chăn nuôi Những năm trở lại đây, trình chuyển dịch cấu theo hướng giảm dần tỷ trọng ngành trồng trọt tăng tỷ trọng ngành chăn nuôi nên nhu cầu lúa ngô lớn (tổng nhu cầu sử dụng lượng lúa ngô từ năm 2017 – 2019: Lúa 1,8 – 2,6 triệu tấn; Ngô 5,7 – 10,25 triệu tấn, theo báo cáo USDA Post, 2019) Hiện nay, q trình chế biến lúa gạo ngơ tạo lượng lớn cám gạo, cám ngô phụ phẩm chưa sử dụng hiệu Cám gạo hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phơi hạt, phần từ Cám gạo chiếm 810% trọng lượng chứa khoảng 90% chất dinh dưỡng hạt, thành phần cám gạo chứa lượng lớn xơ không tan dầu (15-20%) Cám ngô loại phụ phẩm từ ngô sợi phổ biến sử dụng rộng rãi thức ăn chăn nuôi giá thành tương đối thấp Cám ngô chủ yếu bao gồm chất xơ khơng hịa tan với 280g/kg cellulose 700g/kg hemicellulose Probiotic sản phẩm từ vi sinh vật có lợi cho đường tiêu hóa ứng dụng vào thức ăn chăn ni giúp vật ni có đường tiêu hóa khỏe mạnh, thay thuốc kháng sinh, giảm phần ăn, giảm thiểu mùi hôi chất thải Các chủng vi sinh vật sử dụng làm probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp… Trong vi khuẩn Bacillus xem đối tượng giàu tiềm Bacillus khơng có khả sinh bào tử để chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi (Hong, 2005; Sanders cs, 2003), mà sinh chất kháng sinh, chất kháng khuẩn kìm hãm vi sinh vật gây bệnh (Sanders cs, 2003) Ngồi ra, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn cịn chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu làm cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn giúp vật nuôi tăng trọng nhanh Đặc biệt, chế phẩm probiotic từ Bacillus dễ bảo quản không gây hại cho người động vật Ở nước ta, việc ứng dụng dịch chiết cám gạo cám ngô để xác định hoạt tính chủng vi khuẩn nhằm bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi hay điều trị bệnh đường ruột cịn hạn chế Vì vậy, lý lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng Bacillus ni cấy môi trường dịch chiết cám gạo, cám ngô” PHẦN I : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu cám gạo, cám ngô 1.1.1 Giới thiệu cám gạo Trong trình xay xát chế biến gạo, sau thu sản phẩm gạo cịn phụ phẩm có giá trị cao cám gạo Từ lâu, cám gạo nhà máy xay xát thu hồi bán sản phẩm sau gạo - Thành phần cấu tạo cám gạo Hình 1.1 Cám gạo Cám gạo phụ phẩm thu từ lúa sau xay xát thường chiếm khoảng 10% trọng lượng lúa Cám gạo bao gồm lớp vỏ bao bên hạt gạo phôi hạt lúa Khi đem xay lúa thu khoảng 50% gạo, 10% cám, – 6,5% tấm, phần lại cám bổi trấu (Lê Hồng Mận, 2004) Cám gạo có màu sáng mùi thơm đặc trưng Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng cám gạo biến động lớn, phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo - Thành phần dinh dưỡng cám gạo Tuy phụ phẩm cám gạo có thành phần dinh dưỡng tương đối cao nên sử dụng rộng rãi làm thức ăn chăn nuôi cho gia súc, gia cầm thủy sản Cám gạo chứa lớp cám với mầm phơi nhân hạt thóc nên chứa thành phần có giá trị protein, vitamin, dầu ăn, chất xơ axit amin có giá trị dinh dưỡng chức cao (Luh, 1980; Wang cs, 2017) Căn vào hàm lượng dầu, cám gạo phân thành ba nhóm: cám thơ ngun chất Nguyễn Thị Lệ Ngọc cs (2019) nghiên cứu thủy phân protein cám gạo enzyme sử dụng nuôi cấy vi khuẩn Khi phân tích hàm lượng protein tổng số cám gạo trước nuôi cấy 135mg Tác giả cho rằng, hàm lượng protein tổng số thu chịu ảnh hưởng loại dầu, muối vitamin gạo 3.1.4 Hàm lượng tinh bột mẫu cám Tinh bột xem thành phần hóa học thiếu cám gạo cám ngô Thông qua việc xác định hàm lượng tinh bột đánh giá chất lượng thành phẩm thu Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp Bertand nhằm xác định thành phần phần trăm tinh bột có mẫu cám gạo cám ngơ (bảng 3.5) Bảng 3.5 Kết hàm lượng tinh bột thu phương pháp Bertand Cám gạo Thể tích dung dịch đường (V1, ml) Cám ngơ Mẫu thí nghiệm KMnO4 1/30N (ml) Glucose (mg) Hàm lượng tinh bột (%) 15,40 ± 0,05 15,9 71,55 11,21 ± 0,07 11,5 51,75 Bảng 3.5 hàm lượng tinh bột có cám gạo cao so với cám ngô (lần lượt 71,55% 51,75%) Có thể thấy hàm lượng tinh bột cám ngô thấp cám gạo khoảng 20% Ngoài ra, theo thống kê Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) với cám gạo tinh bột chiếm khoảng 80% cám ngô khoảng 70% Nguyên nhân dẫn đến kết nghiên cứu thấp so với thống kê thực tế trình thủy phân tinh bột, tinh bột chưa thủy phân hồn tồn cịn tồn dịch chiết trình chuẩn độ xảy sai số 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh trưởng số chủng Bacillus Các chủng Bacillus ni mơi trường MRS có bổ sung 10 60% (ml/ml) dịch chiết cám gạo môi trường MRS bổ sung dịch chiết cám ngô theo tỷ lệ thể tích, số lượng vi sinh vật xác định nồng độ 35 dịch chiết cám gạo dịch chiết cám ngô khác so với môi trường MRS (ĐC) sau 24 nuôi cấy Kết ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết cám gạo cám ngô bổ sung đến sinh trưởng chủng Bacillus bảng 3.5a 3.5b Bảng 3.6a Khả sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám gạo (CFU/ml) TT Chủng B mojavensis Tỷ lệ bổ sung dịch chiết cám gạo (%) 10 20 30 40 50 60 2,3×106 3,1×107 2,8×108 3,4×108 3,1×107 3,1×105 3,1×105 B 2,4×106 2,8×107 3,0×108 2,8×108 3,5×107 3,2×106 2,9×106 amyloquefacien Bảng 3.6b Khả sinh trưởng chủng Bacillus môi trường bổ sung cám ngô (CFU/ml) TT Tỷ lệ bổ sung dịch chiết cám ngô (%) Chủng B mojavensis 10 20 30 40 50 60 2,8×106 3,1×108 3,5×108 3,1×108 3,1×107 3,1×105 3,1×105 B 2,9×106 3,3×107 3,0×108 2,8×108 2,9×106 amyloquefacien 3×105 2,6×105 Bảng 3.5a 3.5b cho thấy, dịch chiết cám gạo cám ngơ có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn nghiên cứu, cụ thể số lượng khuẩn lạc tỉ lệ thuận với nồng độ dịch chiết Nồng độ dịch chiết bổ sung cao số lượng khuẩn lạc thu nhiều ngược lại, nồng độ dịch chiết thấp số lượng khuẩn lạc thu thấp, Đối với dịch chiết cám gạo, mật độ chủng B mojavensis cao (3,4×108 CFU/ml) với tỷ lệ dịch chiết bổ sung 30% mật độ chủng B amyloquefacien cao (3,0×108 CFU/ml) với tỷ lệ dịch chiết bổ sung 20% Kết tương đồng với cơng bố Hồng Văn Tuấn cs (2013), bổ sung dịch chiết cám gạo số lượng vi sinh vật cao so với đĩa thạch ko 36 bổ sung dịch chiêt, cụ thể: Lactobacillus acidophilus 2,5×108 CFU/ml; Bifidobacterium bifidum 3,4×108 CFU/ml; Lactobacillus bulgaricus 5,9×108 CFU/ml Mặt khác, với dịch chiết cám ngô cho mật độ vi khuẩn đạt cực đại tỷ lệ dịch chiết 20% đối tượng vi khuẩn B mojavensis B amyloquefacien 3,5×108 CFU/ml 3,0×108 CFU/ml Theo nghiên cứu Vijayaraghavan cs (2016) cám ngô chưa khử trùng trộn với mẫu ban đầu bao gồm B subtilis MA139, E faecium S cerevisae theo tỷ lệ 10: (w/v), sau trộn, cám ngơ xử lý chứa 5,7×107 CFU/g; B subtilis MA139 chứa 2,6×107 CFU/g; E faecium S cerevisae 1,5×107 CFU/g Ngồi ra, cơng bố Võ Thị Thúy Huệ cs (2018) cho thấy, vi khuẩn nuôi cấy môi trường 85% cám ngô + 15% cám gạo đạt mật độ tế bào cao 1,6x1012 CFU/g sau 48 3.3 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh axit lactic số chủng Bacillus Các chủng Bacillus nuôi cấy môi trường MRS bổ sung 10 60% (v/v) dịch chiết với tốc độ lắc 150 vòng/phút nhiệt độ 37ºC Kết thể bảng 3.7 Kết cho thấy khả sinh axit chủng nuôi cấy môi trường bổ sung tỷ lệ dịch chiết khác khác Đối với cám gạo, hàm lượng axit cao đạt 2,96% bổ sung 30% dịch chiết với chủng B mojavensis 2,88% bổ sung dịch chiết với chủng B amyloquefacien (bảng 3.2a) Đối với cám ngô lượng axit sinh cao chủng B mojavensis B amyloquefacien bổ sung 20% dịch chiết cám ngô đạt 3,44% 3,16% (bảng 3.2b) Lượng axit sinh so sánh mơi trường MRS trung bình chủng B mojavensis B amyloquefacien 1,96% 2,11% Theo kết nghiên cứu Võ Thị Thúy Huệ cs (2018), vi khuẩn nuôi cấy 37 môi trường MRS sinh axit lactic cao sau ngày nuôi cấy Bacillus coagulans (27,36 g/l) Lactobacillus plantarum (20,34 g/l) Bảng 3.7a Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo Hàm lượng axit chủng vi sinh vật (%) Tỷ lệ bổ sung dịch chiết cám gạo (%, v/v) B mojavensis B amyloquefacien 1,94 ± 0,08 2,11± 0,08 10 2,19 ± 0,06 2,19 ± 0,08 20 2,35 ± 0,08 2,88 ± 0,04 30 2,96 ± 0,12 2,71 ± 0,04 40 2,79 ± 0,12 2,19 ± 0,08 50 2,35 ± 0,08 1,98 ± 0,04 60 1,86 ± 0,08 1,26 ± 0,04 Bảng 3.7a Khả sinh axit lactic chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám ngô Hàm lượng axit chủng vi sinh vật (%) Tỷ lệ bổ sung dịch chiết cám gạo (%, v/v) B mojavensis B amyloquefacien 1,98 ± 0,08 2,11 ± 0,08 10 2,67 ± 0,06 2,55 ± 0,04 20 3,44 ± 0,12 3,16 ± 0,08 30 2,79 ± 0,12 3,0 ± 0,08 40 2,63 ± 0,04 2,84 ± 0,08 50 2,47 ± 0,12 2,63 ± 0,04 60 2,39 ± 0,04 2,23 ± 0,12 38 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả sinh enzyme ngoại bào số chủng Bacillus Khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) chủng Bacillus có vai trị quan trọng, nhằm hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, phân hủy thức ăn dư thừa chuồng nuôi làm giảm mùi hôi thối chuồng trại Bảng 3.8 Khả sinh enzyme chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngơ Đường kính vịng phân giải (D – d, mm) Chủng Môi trường B mojavensis B amyloquefacien Amylase Protease Cellulase Amylase Protease Cellulase ĐC 16,5 ± 0,21 9,0 ± 0,11 17,0 ± 0,06 2,0 5,0 ± 0,2 4,5 ± 0,33 M – CG 4,5 ± 0,1 17,0 ± 0,06 22,0 ± 0,05 18,0 ± 0,11 22,0 ± 0,05 26,0 ± 0,04 M - CN 23,0 ± 0,04 26,0 ± 0,04 26,0 ± 0,04 7,5 ± 0,07 22,0 ± 0,05 21,0 ĐC: Môi trường MRS, M – CG: Môi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám gạo 20% chủng, M – CN: Môi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám ngơ 30% chủng B mojavensis 20% chủng B amyloquefacien Hình 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng B mojavensis A Amylase B Protease C Cellulase 39 Hình 3.3 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng B amyloquefacien A Amylase B Protease C Cellulase Bảng 3.8 cho thấy, chủng B mojavensis B amyloquefacien cho khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao môi trường ni cấy có bổ sung dịch chiết cám gạo cám ngô so sánh với môi trường MRS đơn (hình 3.2 hình 3.3) Đối mơi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, chủng B amyloquefacien có khả sinh enzyme amylase, protease cellulase cao chủng B mojavensis (đường kính vịng chất bị thủy phân chủng là: chủng B mojavensis: 14,5; 17,0; 22,0 mm với hoạt tính ức chế từ trung bình đến mạnh; chủng B amyloquefacien: 18,0; 22,0; 26,0 mm hoạt tính vịng phân giải mạnh đến mạnh) Ngược lại, môi trường nuôi cấy bổ sung dịch chiết cám ngô, khả sinh enzyme ngoại bào chủng B mojavensis lại cao so với chủng B amyloquefacien Đường kính vịng chất bị thủy phân chủng B mojavensis mạnh thể là: 23,0; 26,0; 26,0 mm; chủng B amyloquefacien với amylase yếu (7,5mm), protease cellulase hoạt tính mạnh 22,0; 21,0 mm Đặc biệt bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngơ giàu chất xơ hịa tan hoạt tính enzyme tăng so với ni cấy chủng môi trường không bổ sung dịch cám (mơi trường MRS) (đường kính vịng chất bị thủy phân chủng là: chủng B mojavensis: 16,5; 9,0; 17,0 mm; chủng B amyloquefacien: 2,0; 5,0; 4,5 mm), ảnh hưởng dịch chiết cám gạo cám ngô đến khả sinh enzyme chủng Bacillus tương đối cao 40 Theo nghiên cứu Đào Thị Lương cs (2010), phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic để thử hoạt tính sinh enzyme đường kính vịng phân giải amylase từ 7,0 – 13,0 mm, protease từ 5,0 – 12,0 mm, cellulase từ 8,0 – 12,0 mm 3.5 Ảnh hưởng dịch chiết cám gạo, cám ngô đến khả kháng vi sinh vật gây bệnh số chủng Bacillus Để hạn chế phát triển vi sinh vật gây bệnh, khả đối kháng đặc tính quan trọng chủng vi sinh vật chọn làm probiotic Hoạt tính ức chế, đối kháng chúng đánh giá hiệu số (D – d, mm) Kết thể bảng 3.9; hình 3.3 3.4 Bảng 3.9a Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngơ Đường kính vịng kháng khuẩn (D – d, mm) Chủng E coli S aeruginosa P typhymurium S aureus B spizizenii 5,5 ± 0,09 - - 6,5 ± 0,08 - M - CG 11,5 ± 0,13 - - 9,0 ± 0,11 - M - CN 11,5 ± 0,04 - - 5,5 ± 0,09 - 3,5 ± 0,14 1,5 ± 1,0 3,5 ± 0,14 - 2,3 ± 0,3 M - CG 10,5 ± 0,05 7,0 ± 0,14 9,5 ± 0,05 - 9,5 ± 0,26 M - CN 14,0 ± 0,14 14,0 ± 0,14 8,5 ± 0,18 - - ĐC B mojavensis ĐC B amyloquefacien ĐC: Môi trường MRS, M – CG: Mơi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám gạo 20% chủng, M – CN: Mơi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám ngô 30% chủng B mojavensis 20% chủng B amyloquefacien, (-): Không biểu kháng 41 Bảng 3.9b Khả kháng nấm A niger chủng Bacillus môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngơ Đường kính vịng kháng khuẩn (D – d, mm) B mojavensis B amyloquefacien ĐC M - CG M - CN ĐC M - CG M - CN 4,0 ± 0,25 8,75 ± 0,14 - 9,5 ± 0,26 18,5 ± 0,14 14 ± 0,29 ĐC: Môi trường SDA, M – CG: Mơi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám gạo 20% chủng, M – CN: Mơi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám ngô 30% chủng B mojavensis 20% chủng B amyloquefacien, (-): Không biểu kháng Hình 3.4 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng B mojavensis A E coli B A niger 42 C S aureus Hình 3.5 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng B amyloquefacien A S aeruginosa B P typhymurium D E coli C A niger E B spizizenii Đối môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo, chủng B mojavensis có khả kháng với chủng vi sinh vật kiểm định E coli, A niger, S aureus; chủng B amyloquefacien có khả kháng với chủng kiểm định E coli, A niger, S aeruginosa, P typhymurium, B spizizenii với đường kính vòng kháng tương đối cao (8 – 16 mm) Chủng B amyloquefacien có khả kháng khuẩn Samonella Pseudomonas với đường kính vịng kháng thấp (lần lượt mm; 9,5 mm) Mặt khác, đôi với môi trường bổ sung dịch chiết cám ngơ, chủng B amyloquefacien có khả kháng chủng kiểm định E.coli, A niger, S aeruginosa, P typhymurium với vòng kháng cao, chủng B mojavensis kháng chủng kiểm định E coli, S aureus với vòng kháng thấp (kháng chủng kiểm định S aureus với khả kháng yếu 5,5 mm) Cả chủng B mojavensis B amyloquefacien có khả kháng nấm A niger (bảng 3.9b) với vịng kháng từ trung bình đến mạnh (8,75 – 18,5 mm) Cùng với công bố Hoàng Văn Tuấn cs (2013) rằng, bổ sung dịch chiết cám gạo vi khuẩn kháng vi sinh vật gây bệnh E coli từ – 43 mm, A niger 12 mm S aureus từ – 20 mm Ngoài ra, theo nghiên cứu Nguyễn Thị Hồng Nhung cs (2019) khả kháng khuẩn Samonella mức trung bình từ 16,5 - 19 mm Cùng với nội dung nghiên cứu trên, Yang cs (2015) xác định Bacillus subtilis MA139 có hoạt tính kháng khuẩn cao chống lại Escherichia coli, Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus 44 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Xác định hàm lượng chất dinh dưỡng cám gạo, cám ngơ vói số là: Hàm lượng đường khử 0,454g 0,70g, hàm lượng cellulose 4,53% 2,15%, hàm lượng protein 0,07.10-5g 0,92.10-5g, hàm lượng tinh bột 71,55% 51,75% Tỷ lệ dịch chiết cám gạo cám ngô phù hợp cho phát triển chủng Bacillus chủng B mojavensis (30% cám gạo, 20% cám ngô), chủng B amyloquefacien (20% cám gạo cám ngô) Đã kết luận khả sinh axit lactic chủng Bacillus bổ sung dịch chiết cám: Với chủng B mojavensis (2,96 – 3,44%) chủng B amyloquefacien (2,88 – 3,16%) Cả chủng vi khuẩn thí nghiệm cho khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bảo (amylase, protease, cellulase) Hơn nữa, bổ sung dịch chiết vào mơi trường ni cấy có tác động tích cực lên q trình sinh hợp Trong đó, đường kính vòng phân giải tương đối lớn nằm khoảng 13,0 – 26,0 mm Đã khảo sát khả đối kháng với số chủng vi sinh vật gây bệnh (E coli, A niger, S aureus, S aeruginosa, P typhymurium, B spizizenii) cho thấy bổ sung dịch chiết cám gạo, cám ngô khả kháng khuẩn cải thiện rõ rệt (với đường kính vịng kháng 8,0 – 19,0 mm so với môi trường MRS đơn thuần) 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng probiotic khác môi trường dịch chiết cám gạo, cám ngơ Nghiên cứu xác định tính an toàn sản phẩm để ứng dụng cho vật nuôi, thủy sản 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Lê Văn An, Nguyễn Thị Lộc, Nguyễn Minh Hương (2017) Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum) phần thức ăn nuôi lợn giai đoạn sau cai sữa nuôi thịt Tạp chí khoa học cơng nghệ nơng nghiệp 1(2), tr 209- 216 [2] Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2009) Chiến lược phát triển nông nghiệp nông thôn giai đoạn 2011-2020 Kèm theo công văn số: 3310/BNN-KH ngày 12/10/ 2009 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn) [3] Nguyễn Thị Chính Truơng Thị Hoa (2005) Vi sinh vật y học Hà Nội, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội [4] Trần Cát Đông (2015) Xu hướng nghiên cứu ứng dụng chủng lợi khuẩn probiotic y học thực phẩm chức năng, trung tâm thông tin khoa học công nghệ Tp Hồ Chí Minh [5] Nguyễn Thị Minh Hằng Nguyễn Minh Thư (2013) Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp amylase bacteriocin Tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp số 3, kỳ [6] Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền (2010) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại Di truyền học - Chuyên sâu Công nghệ sinh học [7] Phạm Ngọc Lan (2013) Nghiên cứu tuyển chọn chủng lactic có khả chịu axit muối mật Tạp chí sinh học Đại học Nơng Lâm Thái Ngun [8] Hồ Thị Bích Ngọc, Lê Minh Châu, Cù Thị Thúy Nga (2019) Đánh giá ảnh hưởng men tuaf-saccha bổ sung phần đến suất chất lượng trứng gà đẻ Tạp chí Khoa học cơng nghệ Đại học Thái Ngun 197(04), tr 197-203 [9] Nguyễn Thị Hồng Nhung, Lê Thị Thương, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Huyền (2019) Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích bước đầu ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn ni Tạp chí khoa học công nghệ Lâm Nghiệp số [10] Nguyễn Thị Tuyết Nhung Lã Thị Lan Anh (2020) Xác định khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa người Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1) 161-168 [11] Nguyễn Thị Lệ Ngọc, Lê Nguyễn Đoan Duy Nguyễn Công Hà (2019) Nghiên cứu thủy phân protein cám gạo enzyme sử dụng ni cấy Bacillus subtilis Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019)(2): 267-275 [12] Trần Thị Thu Thủy (2003) Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo Trường ĐH Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh 21 - 24 , 28 - 43 [13] Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Lài (2013) Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết cám gạo đến hoạt tính vi khuẩn probiotics Tạp chí sinh học 195 – 199 [14] Bùi Thị Thanh, Tạ Minh Huyền, Phí Thị Thanh Mai (2018) Nghiên cứu điều kiện lên men cám gạo giống lúa Khang Dân nấm men Saccharomyces cerevisiae để thu nhận hoạt chất chống oxy hóa, góp phần nâng cao giá trị sử dụng chất dinh dưỡng sẵn có cám gạo Tạp chí khoa học cơng nghệ Tp HCM [15] Trần Anh Tuyên, Nguyễn Thị Quyên, Nguyễn Xuân Việt, Hoàng Thị Phương Thúy (2019) Sử dụng chế phẩm probiotics bổ sung thức ăn chăn ni gà thịt Tạp chí khoa học công nghệ trường Đại học Hùng Vương tập 16, số 3, 3–9 [16] Ứng dụng công nghệ vi sinh vật chăn nuôi gia súc, gia cầm nay: thực trạng giải pháp, Ngày 24/09/2020, sở khoa học công nghệ tỉnh Trà Vinh Tài liệu tiếng anh [17] Allerdings E., Ralph J., Steinhart H., Bunzel M (2006) Isolation and structural identification of complex feruloylated heteroxylan side-chains from maize bran Phytochem 67, 1276–1286 [18] Buckner C.D., Erickson G.E., Klopfenstein T.J., Macken C.N., Sayer K.M., T.W (2013) Loy Effect of corn bran and steep inclusion in finishing diets on diet digestibility, cattle performance, and nutrient mass balance Journal of Animal Science, 91, 3847-3858 [19] Carvajal-Millan E., Rascón-Chu A., Márquez-Escalante J A., Micard V., de León N P., Gardea A (2007) Maize Bran Gum: Extraction, Characterization and Functional Properties Carbohydr Polym 69, 280–285 DOI: 10.1016/j.carbpol.2006.10.006 [20] Denev S (2006) Role of Lactobacilli Gastrointestinal Ecosystem, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 12(1) 63 [21] FAO/WHO (2002) Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics, Food London, Ontario, Canada [22] Galassi G., Sandrucci A., Tamburini A., Succi G (2001) Energy utilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening pigs, I Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen 145-148 [23] Goktepe I., Juneja V.K., Ahmedna M (2005) Probiotics in food safety and human health, CRC Press [24] Hao X.Y., Mu C.T., Zhang C.X., Zhao J.X., Zhang J.X., Zhang M.Z., Zhang X.Z (3/2021) Effects of feeding corn bran and soybean hulls on nutrient digestibility, rumen microbial protein synthesis, and growth performance of finishing lambs [25] Inglett G E., Chen D (2011) Antioxidant activity and phenolic content of air-classified corn bran Cereal Chem 88, 36–40 [26] Kim A.M., Sarmankulov T.M., Sultanova Z.M., U.Z., Yeleukenova K.A (2013) Sagyndykov Formulation of feed for lambs on the basis of feed supplements Новосmu науku Kазахсmaha Выn 112-118 [27] Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C (2008) Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72(4) 728-764 [28] Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E (2006) Comparative genomics of the lactic acid bacteria, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(42) 15611–15616 [29] Narayanan N., Roychoudhury P.K., Srivastava A (2004) L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization, Electronic journal of Biotechnology, 7(2) 167-178 [30] Rose D J, Inglett G E., Liu S X (2010) Utilisation of corn (Zea mays) bran and corn fiber in the production of food components J Sci Food Agric 90, 915–924 10.1002/jsfa.3915 [31] Sabina Bano, Dr Shweta Sao and Dr Harit Jha (2018) Bioethanol production from rice & wheat husks after acid hydrolysis & yeast fermentation World Journal of Pharmaceutical Research Volume 7, Issue 13, 991-1004 [32] Tannock G.W (2004) A special fondness for lactobacilli, Applied and environmental microbiology, 70(6) 3189-3194 [33] Willcox, J K, Ash, S L., Catignani, G L.(2004) Antioxidants and Prevention of Chronic Disease Crit Rev Food Sci Nutr 44, 275–295 [34] Yang J J., Niu C C, Guo X H (2015) Mixed culture models for predicting intestinal microbial interactions between Escherichia coli and Lactobacillus in the presence of probiotic Bacillus subtilis [35] Young Ju kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001) Study on the bacteriocin produced hy Lactobacillus sản phẩm GM 73 11, Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National ƣniversity