CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH
2.2.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F. Greger H.- 2000. Chất đối chứng: Ampixilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (–), Nystatin đối với nấm sợi.
21
CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
● Hóa chất
Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagen Merck 60GF254, độ dày 0,2mm và bản mỏng ngược pha RP–18. Sắc ký cột thường: silicagen cỡ hạt 197 - 400 mesh (0,040 - 0,063mm) cho cột đầu. Sắc ký cột nhanh: silicagen cỡ hạt 70 - 200 mesh cho cột tiếp theo. Sắc kí cột pha đảo: RP–18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH - 20 Merck. Dung môi được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.
Phân lập các chất bằng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagen cỡ hạt 0,040 - 0,063mm Merck và Sephadex LH - 20.
Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng Vanilin/ H2SO4 trong dung dịch metanol - H2SO4 đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 1100C.
Dung môi dùng chạy cột và triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm n–hexan, CH2Cl2, EtOAc và MeOH loại tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm.
Một số hoá chất khác cũng đƣợc sử dụng nhƣ CH3COOH, HCl, pyridin, anhydrit axetic ...
● Thiết bị
* Các thiết bị dùng xác định cấu trúc chất:
- Phổ khối HP 5989B MS Engine, LC/MSD Agilent của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR, 13C - NMR đo trên máy Bruker Avance–500 MHz, chất nội chuẩn là TMS cho 1H - NMR và tín hiệu dung môi (DMSO, D2O) cho 13C - NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Header Page 31 of 126.
- Phổ hồng ngoại (FT - IR) đo dưới dạng viên nén KBr trên trên máy quang phổ IMPACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng.
- Phổ khối phân giải cao HR -ESI-MS đƣợc đo trên máy Qstar pulsar
(Applied Biosystems) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Một số trang thiết bị khác nhƣ máy quay cất chân không, máy sấy, máy siêu âm, tủ sấy và các dụng cụ thuỷ tinh, v.v...
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu:
● Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học
* Hoạt tính gây độc tế bào.
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng sự [29]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia (NCI) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm có:
– Human epidemic carcinoma (KB): Ung thƣ biểu mô.
– Heptatocellular carcinoma (Hep - G2): Ung thƣ gan.
– Human lung carcinoma (LU): Ung thƣ phổi.
– Human breast carcinoma (MCF - 7): Ung thƣ vú.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy
23
thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ đƣợc sử dụng để thử độc tính.
Quy trình thử độc tế bào: Cho 200 μg dung dịch tế bào pha loãng nồng độ ở 3 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep - G2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho dòng tế bào LU. Mẫu thử đƣợc xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 μg/ml; 32 μg/ml; 8 μg/ml; 2 μg/ml; 0,5 μg/ml. Ủ ở 37oC, 5% CO2 3 ngày. Giếng điều khiển gồm 200 μl dung dịch tế bào nồng độ 3 104 tế bào/ml ủ ở 39oC, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 μl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ ở 37oC trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectro photometer Genios TECAN.
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% số tế bào thử) được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị OD (mật độ quang) đo đƣợc trên máy.
* Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH) Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K và cộng sự (2003). Dựa theo nguyên tắc chất 1,1- diphenyl - 2 - picrylhydratzyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm.
Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging Capacity)
Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xữ lí số liệu Exel theo công thức:
Header Page 33 of 126.
SC%= [ 100 – TN MT
AT
OD OD
OD x 100]
ODTN: OD thí nghiệm ODMT: Mẫu trắng
ODAT: OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducal nhƣ sau:
2
(xi x) n 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (IC 50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 ( g / ml)
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị IC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50
% các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hòa chất thử.
- Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza
Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC Adenine dextrose citrate), pha loãng 10 - 20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5 - 1 ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh - 80oC. Khi dùng pha loãng thêm 25 - 50 lần bằng RB. H2O2
(0,2N hoặc 2%).
Indigo: chuẩn bị dung dịch stock - 80oC: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu đƣợc dung dịch phản ứng 0,001N.
Chất thử:
+ Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ.
+ Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm.
Phản ứng:
25
+ 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N + 10 l chất thử pha trong DMSO và RB
+ 60 l enzym pha loãng 500 lần + 60 l H2O2 0,2N hay 2%
+ 20 l Indigocarmin 0,001N + 50 l TCA 20%
+ Giếng điều khiển âm không có enzym, không có chất thử, giếng điều khiển dương enzym hoạt động 100%, không có chất thử.
+ Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 - 25phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bước sóng 610 nm.
* Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F. Greger H. - 2000. Chất đối chứng : Ampixilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (–), Nystatin đối với nấm sợi.
Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi thực hiện thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây Cổ yếm lá bóng tại Phòng Hóa sinh ứng dụng- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
● Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:
- Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi là MeOH hay EtOH ở nhiệt độ thường hoặc có thể tăng nhiệt độ. Thực hiện chiết mẫu lặp lại từ 3 đến 4 lần. Dịch chiết thu được được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không. Thu được cao chiết MeOH tổng. Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lƣợt với n–hexan, EtOAc và MeOH bằng phễu chiết. Với mỗi loại dung môi cũng thực hiện chiết lặp lại từ 3 đến 4 lần. Các dịch chiết đƣợc cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao: n–hexan; EtOAc; MeOH) để tiếp tục nghiên cứu.
Header Page 35 of 126.
- Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô đƣợc chiết lần lƣợt với từng loại dung môi có độ phân cực tăng dần nhƣ: n-hexan, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi đƣợc chiết lặp lại từ ba đến bốn lần. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu.
Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo cách thứ nhất.
● Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau thu đƣợc, đƣợc tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagen. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng sephadex LH–20 hoặc ngƣợc pha RP–18. Kiểm tra các phân đoạn và độ sạch của các chất cũng nhƣ theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp.
● Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch đƣợc thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT- IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H - NMR,
13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC.
3.2. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN.
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật
Mẫu Cổ yếm lá bóng thu hái vào tháng 6 năm 2011 tại Hòa Bình. Tổng số 2 kg mẫu đã đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 40ºC đến nhiệt độ không đổi. Sau đó đem xay nhỏ chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O = 80:20 ở nhiệt độ phòng (chiết lặp lại 4 lần) lƣợng dung môi mỗi lần dùng để chiết 3 lít. Thời gian mỗi lần ngâm chiết 4 giờ. Dịch chiết được quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không, thu đƣợc cặn dịch chiết MeOH (khoảng 300ml cặn dịch).
27
Từ 300 ml cặn dịch được pha loãng thêm bằng nước cất sau đó dùng các dung môi có độ phân cực khác nhau (n-hexan; ethylacetat; n-butanol) để chiết phân lớp.
Mỗi loại dung môi đƣợc chiết lặp lại 4 lần: các dịch chiết đƣợc cô quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy quay cất chân không, thu được các cặn dịch chiết tương ứng; n- hexan (17gam); ethylacetat (28gam) và n-butanol (20gam).
3.2.2. Chiết tách và tinh chế các chất từ dịch chiết etyl axetat
Từ 28 gam dịch chiết EtOAc được tách bằng sắc ký cột trên silicagen (đường kính cột d = 60mm; chiều dài lớp silicagen l = 600mm); với 500 gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm), rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2). Sau đó tăng dần đến tỉ lệ 95:5 và chạy cột tiếp đến tỉ lệ 1:1. Kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH ở các tỉ lệ khác nhau; hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm. Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau lại thu đƣợc 15 nhóm phân đoạn các nhóm phân đoạn đƣợc ký hiệu từ E1 đến E15. Phân đoạn E2 dƣợc kết tinh lại thu đƣợc chất sạch E2.2 (18mg) ký hiệu là GCL2.2 (46). Qua phân tích các số liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho biết chất GCL2.2 (46) là 4‟,7-dimethoxy kaempferol. Gộp 4 nhóm phân đoạn từ E12-E15 đặt tên là E14 (14g), từ 14 gam phân đoạn E14 đƣợc tách bằng sắc ký cột có kích thước (đường kính cột d= 30mm; chiều dài lớp silicagel l=600mm) với 200 gam chất hấp phụ silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (100:2) sau đó tăng dần đến tỉ lệ 1:1 Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH 95:5 hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm. Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau thu được 9 nhóm phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc ký hiệu là E14.1 đến E14.9. Phân đoạn E14.2 đƣợc tách lại qua sắc ký cột nhiều lần và tinh chế lại thu đƣợc chất sạch ký hiệu là GCl14.2 (44) Qua phân tích các số liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho biết chất GClL4.2 (44) là 4‟,7-dimethoxy quercetin (còn có tên là Ombuin) .
Header Page 37 of 126.
Sơ đồ chiết và tách chất từ dịch chiết EtOAc
SKC nhắc lại
Cột silica gen, CH2Cl2:MeOH 100 : 1 Cột silicagen
Hệ dung môi: CH2Cl2 : MeOH 98 : 2 (Tăng dần MeOH) Cô quay dung môi dưới áp suất giảm
Chiết phân lớp lần lƣợt với dung môi: n-hexan, EtOAc, n-BuOH (mỗi loại chiết 4 lần)
Cô quay dung môi dưới áp suất giảm Cặn chiết MeOH
28 gam cặn chiết EtOAc (E) 17 gam cặn chiết n-
hexan (H)
20 gam cặn chiết n- BuOH (B)
E6 E7 E8 E9 E12
E13
E1 E2 E3 E4 E5
Kết tinh lại
GCL 2.2 - 18mg
GCL14.2 - 17mg
GCL 14.4 - 11mg
GCL14.5.4 - 8mg
E10 E11
E14 E15
SKC nhắc lại
SKC nhắc lại
29
3.2.3. Chiết tách và tinh chế các chất từ dịch chiết BuOH.
Tử 20 gam cặn dịch chiết n-butanol, được tách bằng sắc ký cột đường kính cột d= 50mm; chiều dài lớp silicagen l = 600mm) với 350 gam silicagen Merck (cỡ hạt 0,043-0,063mm) rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5) sau đó tăng dần tỉ lệ CH2Cl2:MeOH 1:1 và cuối cùng chạy hoàn toàn bằng MeOH. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH 9:1 hiện hình bằng UV bước sóng λ =360nm. Sau khi gộp các phân đoạn giống nhau thu được 9 nhóm phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc ký hiệu là B.1 đến B.9.
- Phân đoạn B6 đƣợc tách trên cột sephadex LH-20 hệ dung môi rửa giải là MeOH thu đƣợc chất sạch ký hiệu là GCL17(43) (50mg). Phân tích phổ 1H và 13C-NMR cho thấy chất này chính là 3‟,4‟,5,7- tetrahydroxyflavonol hay còn gọi là quercetin.
- Phân đoạn B8 đƣợc tách trên cột sephadex LH-20 (lặp lại nhiều lần ) hệ dung môi rửa giải là MeOH thu đƣợc 2 phân đoạn B8.1 và B8.2. Kết tinh lại phân đoạn B8.2 trong MeOH thu đƣợc 20mg chất sạch ký hiệu là GCLB.3N (45). Qua phân tích các số liệu phổ cho thấy đây là 3,3‟,5- trihydroxy-4‟,7- dimethoxyflavone 3-O-rutinosid còn đƣợc gọi là ombuin rutinosid.
Header Page 39 of 126.
Sơ đồ chiết và tách chất từ dịch chiết BuOH
Sắc ký cột silicagen lặp lại nhiều lần Giảo Cổ Lam (2kg)
Cặn chiết MeOH lẫn H2O
- Chiết
- MeOH80%(4x3l) - Cất loại MeOH
- Chiết phân lớp(n-hexan;
EtOAc; n-BuOH) mỗi loại 4 lần - Cô quay loại dung môi
Cặn chiết BuOH (20g)
Cặn chiết EtOAc (28g) Cặn chiết n-hexan
(17g)
PĐB1 PĐB2 PĐB3 PĐB4 PĐB5 PĐB6 PĐB7 PĐB8 PĐB9
Sephadex LH-20 Dung môi tách MeOH
PĐB17 (50mg)
Sephadex LH-20 Dung môi tách MeOH
PĐB8.1
PĐB8.2
Kết tinh lại
PĐB3N
31 3.3. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
3.3.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp tiến hành.
Chuẩn bị chất thử: Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml đƣợc pha loãng thành các nồng độ khỏc nhau để thử hoạt tớnh với enzym từ nồng độ 128àg/ml; 32àg/ml;
8àg/ml; 0.5àg/ml.
Phản ứng: Mẫu thử thêm vào phản ứng làm sao cho đạt nồng độ cuối cùng trong phản ứng theo dãy nồng độ trên.
Phộp thử theo E.xavron 1996 phản ứng gồm 60àg đệm acetat natri 0,1N pH = 4,7; 20 àg indigocarmin 0,001N; 60àg 0.2N; 60àg enzym mỏu người.Để thời gian phản ứng 20 phút.
Hoạt động của enzym đƣợc đánh giá nhờ lƣợng cơ chất bị chuyển hóa trong phản ứng oxy hóa đọc trên máy spectrophotometer ở bước sóng 610nm.
IC50 được tính bằng chương trình raw data. Kết quả thử ở bảng 4.1.
3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào Phương pháp thử độ độc tế bào
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO- 170); tủ cấy sinh học an toàn cấp II; máy ly tâm (Universal 320 R) kính hiển vi ngƣợc (Zeizz); tủ lạnh sâu -25oC, -80oC; buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu là:
KB- ung thƣ biểu mô (CCl-17TM) là dòng luôn đƣợc sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào; HepG2 – ung thƣ gan (HB-8065TM); và MCF7 – ung thƣ vú (HTB-22TM), được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.
Header Page 41 of 126.
Chuẩn bị chất thử: Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml đƣợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính chống ung thƣ với ba dòng tế bào KB- ung thƣ biểu mô (CCl-17TM); HepG2 – ung thƣ gan (HB-8065TM); và MCF7 – ung thƣ vú (HTB-22TM), từ nồng độ 128 μg/ml; 32 μg/ml; 8 μg/ml; 2 μg/ml; 0,5 μg/ml.
Phản ứng: Mẫu thử thêm vào phản ứng làm sao cho đạt nồng độ cuối cùng trong phản ứng theo dãy nòng độ trên.
Mẫu thụ cú IC50 ≤ 20àg/ml; chất sạch cú IC50 ≤ 20àM/ml đƣợc đỏnh giỏ là cú hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ.
Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị OD đo đƣợc kết quả thử ở bảng 4.2.
3.3.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F. Greger H. - 2000. Chất đối chứng : Ampixilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (–), Nystatin đối với nấm sợi. kết quả thử ở bảng 4.3.