Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn liên kết hải miên (sponge)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  ðÀO THỊ THIÊM NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  ðÀO THỊ THIÊM NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƯỜNG TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả ðào Thị Thiêm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thanh cảm ơn ñến thầy hướng dẫn PGS.TS.Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Khoa học Miền trung và TS.Nguyễn Văn Giang trưởng Bộ môn vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường Nông nghiệp Hà Nội, người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ñỡ em, là ñộng lực giúp em trong thời gian em làm ñề tài và hoàn thành luận văn này. ðồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Th.S Vũ Thị Quyên cùng các cô, các anh chị, các bạn trong Phòng công nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện khoa học Miền trung ñã giúp ñỡ em rất nhiều trong thời gian em làm luận văn. Em xin chân thàn cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Ban quản lý ñào tạo sau ñại học cũng toàn thể các bạn trong lớp CNSHA K21 trường Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện ñể em có thể hoàn thành tốt khóa học này. Qua ñây, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè ñã luôn ñộng viên em trong suốt thời gian học tập. Tác giả ðào Thị Thiêm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi PHẦN I: MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu của ñề tài 2 1.3 Ý nghĩa của ñề tài 2 1.4 Nội dung nghiên cứu 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn liên kết hải miên 3 2.2 Vi khuẩn liên kết Hải miên biển 4 2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên 8 2.3.1 Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus) 8 2.3.2 Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) 10 2.3.3 Pseudomonas 12 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu 14 3.2 Hóa chất, thiết bị 14 3.3 Môi trường nghiên cứu 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 17 3.4.2 ðánh giá hoạt tính ñối kháng Vibrio spp. 18 3.4.3 ðặc ñiểm sinh hóa 18 3.4.4 ðịnh danh một số chủng tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử Một số phương pháp sinh học phân tử 22 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page iv PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 24 4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số chủng phân lập 28 4.3 Nghiên cứu một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển chọn 32 4.3.1 Xác ñịnh Gram 32 4.3.2 Một số ñặc tính sinh hóa của các chủng tuyển chọn 33 4.4 ðịnh danh các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA 42 4.5 Kết quả phân tích trình tự 5 chủng vi khuẩn 46 4.5.1 Trình tự mẫu LC22b2 46 4.5.2 Trình tự mẫu LC22cs2 47 4.5.3 Trình tự mẫu LC22cs5 51 4.5.4 Trình tự mẫu LC22xv5 55 4.5.5 Trình tự LC22xv6 61 4.3.5 Các chủng ñã ñược ñịnh danh ra ñến loài 62 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 63 5.1 Kết luận 63 5.2 ðề xuất 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Tổng số vi sinh vật ñược phân lập ñược trên 1gam mẫu Hải miên 24 4.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng nguồn bệnh vi khuẩn của một số chủng phân lập 28 4.3 Hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn phân lập từ nước biển bảo quản mẫu 30 4.4 Tổng hợp phản ứng sinh hóa của vi khuẩn liên kết 41 4.5 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22b2 với gen 16S rADN 47 4.6 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs2 với gen 16S rADN 48 4.7 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs5 với gen 16SrADN 52 4.8 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv5 với gen 16SrADN 56 4.9 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv6 với gen 16SrADN 62 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà 3 3.1 Các bước tiến hành nhuộm Gram 19 4.1 Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập và làm sạch trên môi trường marine agar 2216 26 4.2 Thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn 31 4.3 Ảnh nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 32 4.4 Phản ứng thử catalase dương tính của chủng vi khuẩn 33 4.5 Phản ứng thử catalase âm tính 34 4.6. Thử khả năng sinh acetoin của vi khuẩn 34 4.7 Phản ứng lên men glucose kỵ khí 35 4.8 Kiểm tra khả năng sinh enzyme nitratase 36 4.9 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 5% 37 4.10 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 7% của vi khuẩn 37 4.11 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 10% 38 4.12 Khả năng phân giải gelatin 39 4.13 Khả năng thủy phân tinh bột tan 39 4.14 Khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn trong quá trình biến dưỡng. 40 4.15 Tách DNA tổng số 42 4.16 ðiện di ñồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom của các chủng 43 4.17 ðiện di ñồ plasmid tái tổ hợp của các chủng vi khuẩn 44 4.18 ðiện di ñồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 45 4.19 Cây phân loại 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 1 PHẦN I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Các sản phẩm tự nhiên là nền tảng cho hơn 50% các loại thuốc tại Mỹ và chủ yếu thu ñược bằng lên men vi sinh vật trên cạn. Nhưng việc khai thác các nguồn trên cạn sẽ dần cạn kiệt, trong khi lượng các hợp chất hoạt tính sinh học tách từ các nguồn tài nguyên biển khác nhau phong phú. Phần lớn các sản phẩm biển tự nhiên ñược tách chiết từ ñộng vật không xương sống như hải miên (sponge), ñộng vật có vỏ (tunicate), ñộng vật thân mềm (mollusk) và bryozoans. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm Rất nhiều ñộng vật không xương sống biển, ñặc biệt là hải miên (phylum Porifera) ñáng chú ý bởi tính ña dạng vô cùng, các chất trao ñổi thứ cấp của chúng có tiềm năng trở thành các loại thuốc hiệu quả ñể chữa bệnh. Các hợp chất từ Hải miên ñược cho rằng có hoạt tính chống ung thư, chống nhiễm trùng và các hoạt tính sinh học khác, làm cho chúng trở thành các hợp chất dẫn ñể ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học. Hải miên có cộng ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô của chúng. Sự ña dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều kiện lý, hóa, sinh trong sponge, có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Những nghiên cứu về vi sinh vật liên ñới hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm ñến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006), và cộng ñồng này ñặc hiệu cho hải miên Hải miên ñược biết là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như polyketides, nonribosomal peptides, và alkaloids. Nhưng người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết hải miên sinh ra. Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng ñồng này tổng hợp rất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới. Trong khi ñể nuôi ñộng vật không xương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 2 sống ñể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ñắt ñỏ hoặc không thực hiện ñược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và số lượng lớn. ðề tài: “Nghiên cứu ñặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn liên kết Hải miên (Sponge)” nhằm ñánh giá sự ña dạng sinh học của vi khuẩn liên kết hải miên và tìm kiếm chủng có hoạt tính sinh học và có tiềm năng ứng dụng trong thực tế. 1.2. Mục tiêu của ñề tài - ðánh giá ñược mức ñộ ña dạng và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn liên kết hải miên - Phát hiện các chủng có hoạt tính ñối kháng nguồn bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản 1.3. Ý nghĩa của ñề tài Bước ñầu tiến hành nghiên cứu về hệ vi khuẩn liên kết hải miên biển Việt Nam và từ ñó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung và vi khuẩn liên kết hải miên nói riêng. 1.4 Nội dung nghiên cứu a. Phân lập vi khuẩn từ loài hải miên biển b. Xác ñịnh khả năng ñối kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh c. Nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh lý sinh hóa của các chủng tuyển chọn d. ðịnh danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA [...]... d r a (well-irrigated) ch a ít vi khu n và thư ng ch ñơn H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c sĩ Khoa h c Nông nghi p Page 26 hình Hai nhóm h i miên ñư c phân bi t d a trên c u trúc mô và vi khu n liên k t v i chúng ñư c g i là “h i miên giàu vi sinh v t - HMA” và “h i miên nghèo vi sinh v t - LMA” M t ñ vi sinh v t liên k t v i LMA h i miên ph n ánh m t ñ vi sinh v t trong nư c bi n quanh... ph i bi t li u h i miên hay các loài c ng sinh hay c 2 ch u trách nhi m s n sinh ra các ch t ho t tính sinh h c, và trong trư ng h p h i miên là nhà s n xu t thì t bào nào ch u trách nhi m Vì hàm lư ng các ch t ho t tính sinh h c trong h i miên th p nên c n m t lư ng l n sinh kh i h i miên cho vi c tách chi t H i miên là v t ch c a c ng ñ ng vi sinh v t l n và vai trò c a nh ng vi sinh v t này thay... i miên v i vi sinh v t Môi trư ng bi n r t ña d ng và vi sinh v t bi n phơi nhi m áp su t, nhi t ñ , ñ m n, dinh dư ng c c ñoan Nh ng enzymes c a nh ng vi sinh v t trong nh ng môi trư ng như th rõ ràng có nh ng tính ch t sinh lý và sinh hóa ña d ng, cho phép qu n th vi sinh v t thích nghi và phát tri n m nh trong các ñi u ki n c c ñoan ñó Hi n nay nh ng nghiên c u v sinh v t bi n nói chung và vi sinh. .. nhi u h i miên có c ng ñ ng vi sinh v t c c kỳ ña d ng trong mô c a chúng S ña d ng này có th gi i thích m t ph n b i s thay ñ i các ñi u ki n lý, hóa, sinh trong h i miên, có th nh hư ng ñ n sinh thái vi sinh v t và ti n hóa Nh ng nghiên c u v vi sinh v t liên k t h i miên cho th y vi sinh v t có th chi m ñ n 50% th tích h i miên, và con s này l n hơn 2-3 l n so v i lư ng vi khu n trong nư c bi n (Wang... c hi u cho h i miên 2.2 Vi khu n liên k t H i miên bi n Vi sinh v t sinh s ng trong t t c các h sinh thái bi n, chúng r t ña d ng và trao ñ i ch t ph c t p Vi sinh v t bi n là các nhà s n xu t sinh kh i ñ u tiên trong ñ i dương, thu nh n ánh sáng và c ñ nh cacbon, và là nh ng H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c sĩ Khoa h c Nông nghi p Page 4 recyclers dinh dư ng ñ u tiên Vi sinh v t bi n cũng... thi u Vi t Nam Vì v y, ð tài cung c p nh ng hi u bi t v ña d ng vi khu n liên k t h i miên b ng phương pháp phân l p và ñ nh danh các ch ng phân l p trên các lo i môi trư ng ch n l c cho t ng lo i, hư ng t i tuy n ch n các ch ng h u ích có ti m năng ng d ng trong nghiên c u các ho t ch t có ho t tính sinh h c 2.3 Các ch ng th ho t tính ñ i kháng c a vi khu n liên k t H i miên 2.3.1 Vi khu n Vibrio... ng ñ ng vi sinh v t h i miên và h gen c a chúng chưa ñư c hi u rõ B ng các phương pháp lai huỳnh quang in situ ho c gi i trình t gen 16S rRNA ch ra r ng, ph n l n h i miên có qu n th vi sinh v t gi ng nhau (uniform), nhưng ph c t p v phát sinh loài (phylogenetically) và chúng khác hoàn toàn v i qu n th vi sinh v t c a phiêu sinh v t (plankton) bi n ho c bùn bi n Nh ng nghiên c u phân t h i miên ch... thành vi n c a domain Archaea Các qu n th vi sinh v t khác s ng trong h i miên là fungi và microalgae R t ít bi t v virus trong h i miên, m c dù các h t gi ng virus ñư c phát hi n trong nhân t bào c a Aplysina (Verongia) cavernicola Có 2 con ñư ng ñ t o nên vi khu n liên k t, m t là h p thu vi khu n ñ c hi u t nư c xung quanh khi nư c ñi qua h i miên trong quá trình ăn l c và hai là truy n th ng vi khu... hóa t sinh v t bi n nh m t o các s n ph m có giá tr dư c d ng (2007-2008), do GS Châu Văn Minh ch trì ñã nghiên c u m t s sinh v t bi n có ch t kháng sinh, gây ñ c t bào và ch ng ôxy hóa và ñăng ký 3 th c ph m ch c năng t i C c V sinh an toàn th c ph m – B Y t G n ñây ngư i ta chú ý nhi u hơn ñ n vi sinh v t liên k t h i miên ñ tìm ngu n g c ñích th c c a các h p ch t ho t tính sinh h c và s liên k... nguyên t sinh h c như nitơ, cacbon, oxy, photpho, s t, lưu huỳnh và các vi lư ng Nh ng ñóng góp quí giá c a chúng vào các chu trình hóa ñ a sinh chưa ñư c bi t Nhưng do tính linh ho t c a các kh năng sinh hóa và sinh kh i to l n c a chúng trong h sinh thái bi n, chúng ñư c tin r ng là các thành ph n chính ch u trách nhi m cho vi c duy trì các chu trình này, giúp n ñ nh các h sinh thái Vi sinh v t liên . và số lượng lớn. ðề tài: Nghiên cứu ñặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn liên kết Hải miên (Sponge) nhằm ñánh giá sự ña dạng sinh học của vi khuẩn liên kết hải miên và tìm kiếm chủng. liên kết hải miên 3 2.2 Vi khuẩn liên kết Hải miên biển 4 2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên 8 2.3.1 Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus) 8 2.3.2 Vibrio. ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  ðÀO THỊ THIÊM NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01