NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE)

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số 4.3 Nghiên cứu một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển 4.3.2 Một số

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ựược sử dụng ựể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ựoan, mọi sự giúp ựỡ trong việc thực hiện luận văn này

ựã ựược cảm ơn, các thông tin trắch dẫn trong luận văn ựều ựã ựược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

đào Thị Thiêm

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thanh cảm ơn ựến thầy hướng dẫn PGS.TS.Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Khoa học Miền trung và TS.Nguyễn Văn Giang trưởng Bộ môn vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường Nông nghiệp Hà Nội, người ựã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ựỡ em, là ựộng lực giúp em trong thời gian em làm ựề tài và hoàn thành luận văn này

đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Th.S Vũ Thị Quyên cùng các cô, các anh chị, các bạn trong Phòng công nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện khoa học Miền trung ựã giúp ựỡ em rất nhiều trong thời gian em làm luận văn

Em xin chân thàn cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Ban quản lý ựào tạo sau ựại học cũng toàn thể các bạn trong lớp CNSHA K21 trường Nông nghiệp Hà Nội ựã giúp ựỡ và tạo ựiều kiện ựể em có thể hoàn thành tốt khóa học này

Qua ựây, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ựình, bạn bè

ựã luôn ựộng viên em trong suốt thời gian học tập

Tác giả

đào Thị Thiêm

2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn liên kết hải miên 3

2.3 Các chủng thử hoạt tắnh ựối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên 8

2.3.2 Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) 10

3.4.2 đánh giá hoạt tắnh ựối kháng Vibrio spp 18

3.4.4 định danh một số chủng tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số

4.3 Nghiên cứu một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển

4.3.2 Một số ñặc tính sinh hóa của các chủng tuyển chọn 33

4.4 ðịnh danh các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật giải

DANH MỤC BẢNG

4.1 Tổng số vi sinh vật ñược phân lập ñược trên 1gam mẫu Hải miên 24

4.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng nguồn bệnh vi khuẩn của một số

4.3 Hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn phân lập từ nước biển bảo quản mẫu 30

4.4 Tổng hợp phản ứng sinh hóa của vi khuẩn liên kết 41

4.5 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22b2 với gen 16S rADN 47

4.6 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs2 với gen 16S rADN 48

4.7 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs5 với gen 16SrADN 52

4.8 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv5 với gen 16SrADN 56

4.9 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv6 với gen 16SrADN 62

DANH MỤC HÌNH

2.1 Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà 3

4.1 Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập và làm sạch trên môi trường

4.4 Phản ứng thử catalase dương tính của chủng vi khuẩn 33

4.10 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 7% của vi khuẩn 37

4.14 Khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của vi

4.16 ðiện di ñồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom của các chủng 43 4.17 ðiện di ñồ plasmid tái tổ hợp của các chủng vi khuẩn 44

4.18 ðiện di ñồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 45

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Các sản phẩm tự nhiên là nền tảng cho hơn 50% các loại thuốc tại Mỹ

và chủ yếu thu ñược bằng lên men vi sinh vật trên cạn Nhưng việc khai thác các nguồn trên cạn sẽ dần cạn kiệt, trong khi lượng các hợp chất hoạt tính sinh học tách từ các nguồn tài nguyên biển khác nhau phong phú Phần lớn các sản phẩm biển tự nhiên ñược tách chiết từ ñộng vật không xương sống như hải miên (sponge), ñộng vật có vỏ (tunicate), ñộng vật thân mềm (mollusk) và bryozoans Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm

Rất nhiều ñộng vật không xương sống biển, ñặc biệt là hải miên

(phylum Porifera) ñáng chú ý bởi tính ña dạng vô cùng, các chất trao ñổi thứ

cấp của chúng có tiềm năng trở thành các loại thuốc hiệu quả ñể chữa bệnh Các hợp chất từ Hải miên ñược cho rằng có hoạt tính chống ung thư, chống nhiễm trùng và các hoạt tính sinh học khác, làm cho chúng trở thành các hợp chất dẫn ñể ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học Hải miên có cộng ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô của chúng Sự ña dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều kiện lý, hóa, sinh trong sponge,

có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Những nghiên cứu về

vi sinh vật liên ñới hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm ñến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006), và cộng ñồng này ñặc hiệu cho hải miên

Hải miên ñược biết là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như polyketides, nonribosomal peptides, và alkaloids Nhưng người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết hải miên sinh ra

Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng ñồng này tổng hợp rất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới Trong khi ñể nuôi ñộng vật không xương

sống ựể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ựắt ựỏ hoặc không thực hiện ựược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và

1.2 Mục tiêu của ựề tài

- đánh giá ựược mức ựộ ựa dạng và xác ựịnh ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn liên kết hải miên

- Phát hiện các chủng có hoạt tắnh ựối kháng nguồn bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản

1.3 Ý nghĩa của ựề tài

Bước ựầu tiến hành nghiên cứu về hệ vi khuẩn liên kết hải miên biển Việt Nam và từ ựó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung và vi khuẩn liên kết hải miên nói riêng

1.4 Nội dung nghiên cứu

a Phân lập vi khuẩn từ loài hải miên biển

b Xác ựịnh khả năng ựối kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh

c Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh lý sinh hóa của các chủng tuyển chọn

d định danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn liên kết hải miên

Hình 2.1: Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà

Hải miên (phylum Porifera) là những ñộng vật sống lâu và rất ổn ñịnh,

chúng ñã tồn tại 700-800 triệu năm với vận tốc sinh trưởng khác nhau cực kỳ

ở những nhóm khác nhau Chúng là ñộng vật không xương sống ña bào, ăn lọc sống bám chủ yếu vào nền biển, nhưng cũng có loài nước ngọt Trong số khoảng 15.000 loài hải miên, chỉ có khoảng 1% sống trong môi trường nước ngọt Hải miên không có mô thực sự, nhưng có các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác nhau và cùng nhau thực hiên các chức năng bình thường của cơ thể

Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh ña dạng các chất trao ñổi thứ cấp ñược phát hiện trong những năm gần ñây Hải miên sản xuất các chất trao ñổi thứ cấp ñể xua ñuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với các loài không cuống khác và ñể liên lạc, chống lại sự nhiễm bệnh Hải miên

có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều loại bệnh hiện

ñang lưu hành trên thế giới Trong số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển ñược

mô tả, hơn 30 % là từ hải miên (Koopmans et al., 2009; Niyaz 2012) Nhưng nồng ñộ các chất hoạt tính sinh học trong mô hải miên rất thấp, ví dụ,

Lissodendorix sp chứa khoảng 400µg/kg halichondrin B, ñiều ñó có nghĩa

cần phương pháp sản xuất bền vững ðể phát triển kỹ thuật sản xuất bền vững cần phải biết liệu hải miên hay các loài cộng sinh hay cả 2 chịu trách nhiệm sản sinh ra các chất hoạt tính sinh học, và trong trường hợp hải miên là nhà sản xuất thì tế bào nào chịu trách nhiệm Vì hàm lượng các chất hoạt tính sinh học trong hải miên thấp nên cần một lượng lớn sinh khối hải miên cho việc tách chiết

Hải miên là vật chủ của cộng ñồng vi sinh vật lớn và vai trò của những

vi sinh vật này thay ñổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh với hải miên,là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như polyketides, nonribosomal peptides, và alkaloids nhằm xua ñuổi và ngăn chặn ñộng vật ăn thịt, tranh giành không gian với các loài không cuống (sessile) khác, ñể liên lạc và bảo vệ không bị nhiễm bệnh Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào

(cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm

Rất nhiều hải miên có cộng ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô của chúng Sự ña dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm ñến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006),và cộng ñồng này ñặc hiệu cho hải miên

2.2 Vi khuẩn liên kết Hải miên biển

Vi sinh vật sinh sống trong tất cả các hệ sinh thái biển, chúng rất ña dạng và trao ñổi chất phức tạp Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối ñầu tiên trong ñại dương, thu nhận ánh sáng và cố ñịnh cacbon, và là những

recyclers dinh dưỡng ñầu tiên Vi sinh vật biển cũng ñược biết tham gia vào chu trình toàn cầu của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho, sắt, lưu huỳnh và các vi lượng Những ñóng góp quí giá của chúng vào các chu trình hóa ñịa sinh chưa ñược biết Nhưng do tính linh hoạt của các khả năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong hệ sinh thái biển, chúng ñược tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho việc duy trì các chu trình này, giúp ổn ñịnh các hệ sinh thái

Vi sinh vật liên kết với Hải miên và một số vật liệu biển khác có cả nội bào và ngoại bào Hiện nay, cộng ñồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa ñược hiểu rõ Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng ñồng này tổng hợp rất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới (associated) Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên

kết sinh ra Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis ñược qui cho là sản phẩm trao ñổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải miên Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P clavata ñược nhận

dạng là nguồn kháng sinh rifamycin Trong khi ñể nuôi ñộng vật không xương sống ñể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ñắt ñỏ hoặc không thực hiện ñược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và số lượng lớn.[7,22,11]

Vi sinh vật biển như nguồn kháng sinh và kháng virus[25]: chủng

Acremonium furcatum có khả năng sinh các dẫn xuất của D-allo- và isoleucine có hoạt tính ñối kháng B.subtilis, Staphylococcus aureus, E.coli và Botrytis cynerea Chủng vi khuẩn Marinomonas mediterranea phân lập từ

L-biển Mediterranean (ðịa Trung Hải) sinh kháng sinh marinocine có hoạt tính

ñối với 3 chủng nosocomial rất khó chữa trị bằng các loại kháng sinh thương

mại là Pseudomonas sp ceftazidime, Pseudomonas sp imipenemr và Staphylococcus aureus meticillin

Lysozyme có ở cả ñộng vật, thực vật và vi sinh vật có hoạt tính kháng

khuẩn và kháng virus Lysozyme chiết từ chủng Bacillus sp S-12-86 từ biển

có khả năng phá màng tế bào Candida albicans và làm cho tế bào chất không

ñối xứng Lysozyme này có hoạt tính với vi khuẩn gram (+), gram (-) và nấm

Một hợp chất kháng khuẩn khác ñược tách từ vi sinh vật biển (Streptomyces sp) là sisomicin, kháng Bacillus cereus và E.coli

Vi sinh vật biển sinh biosurfactant và bioremediation[26]: vi sinh vật

biển ñược chứng minh có lợi nhiều mặt, trong ñó có biosurfactant Các chủng vi

sinh vật sinh biosurfactant ñược chú ý, ñặc biệt cho bioremedation biển bị ô nhiễm bởi dầu thô Một số loài sinh tổng hợp biosurfactant là P.nautical Các

thành phần chính gồm proteins, carbohydrates và lipids tỉ lệ 35:63:2, tương ứng

Một chủng vi khuẩn biển nhiệt ñới Yarrowia lipolytica sinh emulsifier khi có mặt alkanes hoặc dầu thô Một số chủng khác như Alcaligenes sp.; Alcanivorax borkumensis; Myroides sp cũng có khả năng sinh biosurfactants khác nhau

Bên cạnh ñó, vi sinh vật biển có khả năng oxy hóa các ion kim loại

nặng Chủng Bacillus sp.SG-1 oxy hóa Coban và Manganese (Mn II) Mn (III,

IV) oxides ñược sản sinh bởi vi khuẩn oxy hóa Mn(II) là các chất oxy hóa mạnh có khả năng oxy hóa các hóa chất vô cơ và hữu cơ

Vi sinh vật biển là nhà sản xuất enzymes[27]: người ta tính rằng thị

trường thế giới cho enzyme công nghiệp tăng 10-15% hàng năm

Công nghệ sinh học enzymes biển có thể cung cấp các chất xúc tác sinh học mới với các tính chất chịu muối, chịu nhiệt, chịu áp suất (barophilicity), thích nghi với lạnh (cold adaptivity) và dễ nuôi cấy qui mô lớn

ðối với vi sinh vật công sinh nuôi cấy ñược, Li và cs (2006) phân lập

23 khuẩn tia từ Craniella australiensis sử dụng môi trường nước biển và dịch chiết hải miên, trong ñó 11 chi Streptomyces riêng rẽ Các chi Streptomyces,

Pseudonocardia và Nocardia ñược phân lập từ hải miên biển Craniella australiensis, Halichondria rugosa, Sponge sp và Stelletta tenuis

Hiện nay, cộng ñồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa

ñược hiểu rõ Bằng các phương pháp lai huỳnh quang in situ hoặc giải trình tự

gen 16S rRNA chỉ ra rằng, phần lớn hải miên có quần thể vi sinh vật giống nhau (uniform), nhưng phức tạp về phát sinh loài (phylogenetically) và chúng khác hoàn toàn với quần thể vi sinh vật của phiêu sinh vật (plankton) biển hoặc bùn biển Những nghiên cứu phân tử hải miên chỉ ra các loại vi sinh vật

liên kết hải miên trong ñó có các thành viên Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria

Dựa trên những nghiên cứu cộng ñồng vi sinh vật bằng các phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S rRNA gene

sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người ta nhận

thấy cộng ñồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla, trong ñó

có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia, ngoài các thành viên của domain Archaea Các quần thể vi sinh vật khác sống

trong hải miên là fungi và microalgae Rất ít biết về virus trong hải miên,

mặc dù các hạt giống virus ñược phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola Có 2 con ñường ñể tạo nên vi khuẩn liên kết, một là

hấp thu vi khuẩn ñặc hiệu từ nước xung quanh khi nước ñi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên ñới thông qua giao

tử (gametes) của hải miên bằng cách ñưa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes)

hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al., 2007)

Những năm gần ñây, các nhà khoa học của Việt Nam ñã tiến hành một

số nghiên cứu về sinh vật biển nhằm khai thác tiềm năng to lớn nguồn tài nguyên thiên nhiên này Năm 2007-2008, PGS TS Lại Thúy Hiền, Viện CNSH, ñã phân lập ñược 11 chủng nấm men và 13 chủng vi khuẩn có khả

năng tạo các chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vùng biển Việt Nam và nghiên cứu các ñặc tinh sinh học của chúng trong khuôn khổ ñề tài ñộc lập cấp Nhà nước ðề tài trong Chương trình khoa học trong ñiểm cấp Nhà nước KC.09.09/06-10: Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo ñịnh hướng kháng sinh, gây ñộc tế bào và chống ôxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng (2007-2008), do GS Châu Văn Minh chủ trì ñã nghiên cứu một số sinh vật biển có chất kháng sinh, gây ñộc tế bào và chống ôxy hóa và ñăng ký 3 thực phẩm chức năng tại Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm – Bộ Y tế

Gần ñây người ta chú ý nhiều hơn ñến vi sinh vật liên kết hải miên ñể tìm nguồn gốc ñích thực của các hợp chất hoạt tính sinh học và sự liên kết hải miên với vi sinh vật

Môi trường biển rất ña dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt ñộ, ñộ mặn, dinh dưỡng cực ñoan Những enzymes của những vi sinh vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa ña dạng, cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các ñiều kiện cực ñoan ñó Hiện nay những nghiên cứu về sinh vật biển nói chung và vi sinh vật biển nói riêng còn là một lĩnh vực yếu và thiếu ở Việt Nam Vì vậy, ðề tài cung cấp những hiểu biết về ña dạng vi khuẩn liên kết hải miên bằng phương pháp phân lập và ñịnh danh các chủng phân lập trên các loại môi trường chọn lọc cho từng loại, hướng tới tuyển chọn các chủng hữu ích có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu các hoạt chất có hoạt tính sinh học

2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên

2.3.1 Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus)

Khác với hầu hết các loại vi khuẩn, V vulnificus là một loại vi khuẩn

hình dài có thể sống ở nước mặn Nó là một sinh vật sống tự nhiên trong nước biển, ñặc biệt ở những vùng có ñộ mặn thấp (0.5 ñến 2.0% muối), như: những

vùng gần bờ biển và các cửa sông, ở ñó, nước ngọt từ các dòng sông chảy về

hòa với nước mặn của biển mà thành Vi khuẩn Vibrio vulnificus sinh ra là do

hậu quả của sự ô nhiễm hóa chất hoặc sinh học

Vi khuẩn V vulnificus thích sống ở môi trường ấm và sinh sản nhanh

trong nhiệt ñộ của nước từ 86°F ñến 95°F và với ñộ mặn khoảng chừng 0.5% muối Ở Mỹ, người ta tìm thấy vi khuẩn này nhiều nhất là ở Vịnh Mexico (Gulf of Mexico) từ tháng 4 ñến tháng 10 Vi khuẩn này còn có ở các vùng ven biển khác của nước Mỹ, nhưng mức ñộ ít hơn nhiều; nó cũng ñược phát hiện có trong nước biển và trong các ñộng vật có vỏ ở các quốc gia khác

Các Trung Tâm Phòng Chống Bệnh (the Centers for Disease Control and Prevention) tường thuật rằng mỗi năm có khoảng 90 trường hợp bị nhiễm

vi khuẩn V vulnificus ở Hoa Kỳ Vi khuẩn thật sự chỉ gây bệnh nặng với

những người có hệ thống miễn dịch yếu hoặc người có tình trạng sức khỏe không ñược tốt hay ñang có bệnh làm cho vi khuẩn có khả năng dễ gây nhiễm ñộc và lan truyền nhanh khắp cơ thể của họ (bệnh nhiễm trùng máu)

Tổng số tỷ lệ tử vong vì bệnh nhiễm vi khuẩn V vulnificus là 40%

ðối với những người có sức khỏe tốt, vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng

dạ dày nhẹ (như chóng mặt, ói, ñau dạ dày hoặc tiêu chảy) hoặc nhiễm trùng

da (cellulitis) nhưng các trường hợp này ít xảy ra và thường là không nặng Những tình trạng sau ñây làm cho người dễ bị nhiễm ñộc nặng:

• Bệnh gan (từ viêm gan, xơ gan, chứng nghiện rượu, hoặc ung thư)

• Bệnh tiểu ñường

• Bệnh ung thư (bệnh bạch cầu, ung thư máu, ung thư hệ thống miễn nhiễm)

• Bệnh quá thừa chất sắt (hemochromatosis)

• Bệnh hoa liễu (HIV/AIDS)

• Dạ dày bị rối loạn (người ñã bị mỗ dạ dày, người ñang dùng thuốc là giảm ñộ axit trong dạ dày)

• Các thứ bệnh khác, hoặc những trường hợp bị phương pháp trị liệu làm yếu hệ thống miễn dịch (như hóa liệu pháp)

2.3.2 Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus)

V.parahaemolyticuslà Gram âm, bao gồm các chủng có ñộc tố có khả

năng gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoai tử gan tụy cấp tính AHPND

(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) Dòng vi khuẩn gây bệnh

AHPND phát triển trong dạ dày tôm, chúng hình thành nên các màng sinh học ( biofilm) giúp bảo vệ chúng bởi tác dụng của các loại kháng sinh và các

phương pháp ñiều trị khác V.parahaemolyticus có khả năng chịu ñựng với

các ñộ mặn, pH, nhiệt ñộ và dễ dàng ñeo bám trên các sinh vật phù du di chuyển theo dòng chảy

Chỉ có một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên

tôm nuôi Phần lớn nó là mầm bệnh cơ hội, tức là chúng chỉ phát triển và gây bệnh khi vật chủ bị stress hoặc yếu và không có khả năng chống lại

chúng Chỉ có một số ít mầm bệnh vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh chính trên ñộng vật khỏe mạnh Vi khuẩn Vibrio có ñộc tính cao có thể giết

chết tôm khi tiếp xúc với sự hiện diện rất ít của mầm bệnh hoặc khi tôm ăn phải một lượng nhỏ vi khuẩn

V.parahaemolyticus rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa

sông, và một số ít hiện diện trong môi trường nước ngọt Hầu hết chúng ñều không có khả năng gây bệnh và thường vô hại khi ăn phải, tuy nhiên ñộc tố phát sinh từ vi khuẩn này thường ñược tìm thấy trong các loài cá tự nhiên và chúng là một trong những nguyên nhân gây ngộ ñộc khi ăn hải sản

Các loài Vibrio cũng có thể lây lan từ bố mẹ và hậu ấu trùng Ví dụ như

mầm bệnh gây nên AHPND hiện diện ở rất nhiều loài tôm và ở các giai ñoạn phát triển khác nhau ðiều này có thể giải thích tại sao chúng có thể dễ dàng bùng phát, lây lan và vấn ñề tiêu diệt hoặc kiểm soát mầm bệnh này không hề ñơn giản

Màng sinh học là tập hợp của các sinh vật bám trên một bề mặt Ví dụ như một mảnh vụn hữu cơ trên nền ñáy ao tôm hoặc bề mặt ñó là dạ dày tôm như trường hợp của vi khuẩn gây bệnh AHPND Màng sinh học giúp bảo vệ các vi khuẩn chống lại kháng sinh và sự tấn công của các vi khuẩn cạnh tranh khác có trong ao nuôi

Sự hình thành các màng sinh học bắt ñầu khi vi khuẩn bám vào lớp kitin trên bề mặt dạ dày tôm Sau ñó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành lên một lớp “keo” giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt dạ dày tôm Khi ñã hình thành các màng sinh học chắc chắn trên dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt ñầu nhân lên, màng là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành và có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp ñiều trị khác, trong khi các hoạt ñộng trao ñổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường

Do tính chất phức tạp của Giống vi khuẩn Vibrio, làm cho việc kiểm soát và khống chế mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trở nên rất

phức tạp và khó khăn Vi khuẩn V parahaemolyticus sản sinh ra ñộc tố nhưng

ñộc tố ñó không là nguyên nhân trực tiếp gây tổn hại ñến vật chủ Hầu hết mầm bệnh vi khuẩn Vibrio sau khi xâm nhập vào vật chủ chúng sẽ nhanh chóng phát triển, gia tăng mật số ñể bảo vệ chính nó và cùng với sự phát triển của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu ñi và dẫn ñến cái chết Dòng vi

khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPND không tấn công và xâm

nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các cơ chế xâm nhập khác ðiều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thể ngăn chặn các nhiễm trùng do EMS/AHPND gây nên Nếu như kháng sinh không thể tiếp xúc với mầm bệnh ở mức ñộ ñủ ñể ảnh hưởng ñến nó thì kháng sinh sẽ không thể phát huy tác dụng Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng ñến kháng sinh trong việc ñiều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh ñể trị bệnh EMS/AHPND là một ví dụ rất ñiển hình về việc sử dụng kháng sinh không

hiệu quả Ẩn mình trong cái vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi

khuẩn V parahaemolyticus - tác nhân gây bệnh EMS/AHPND ñược bảo vệ

trước các hóa chất về mặt lý thuyết là có thể tiêu diệt chúng ðiều này sẽ ñặt

ra một thách thức rất lớn ñối với các cố gắng phát triển một phương pháp ñiều trị EMS/AHPND

2.3.3 Pseudomonas

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi

trường Sự biến dưỡng dễ thay ñổi và linh ñộng của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, ñất, trên cây và trong các

ñộng vật Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có

thể ñược sử dụng trong công nghệ sinh học

ðặc ñiểm hình thái chung của Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình

que, di ñộng nhờ roi ở ñầu và không có bào tử

Các ñặc ñiểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố ñịnh nitrogen

Pseudomonas aeruginosa (ñại diện của Pseudomonas, hay còn gọi là

trực khuẩn mủ xanh) là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở ñộng vật và con người Nó ñược tìm thấy trong ñất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, do

ñó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, ñường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể Bên cậnh ñó, vi khuẩn này cũng ñược phát hiện trên các dụng cụ

y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông

2.3.1.4 Micrococcus.luteus (M.luteus)

M.luteus là cầu khuẩn Gram dương, sống trông ựất, nước, không khắ

Micrococcus gây bệnh trên cá M.luteus ựược gọi là một chất gây ô nhiễm ở những bệnh nhân bị bệnh

và có khả năng chống băng cách lmaf chậm quá trắnh trao ựổi chất lớn và cảm ứng của các gên ựộc ựáo đó là một tỷ lệ G + C vi khuẩn cao

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn: agar, cao thịt, cao nấm

men, peptone, NaCl…

- Hóa chất sử dụng thử phản ứng sinh lý, sinh hóa của các chủng vi

khuẩn nghiên cứu: KNO3, glucose, KOH, anpha- naphton, ñỏ phenol, lysozyme, KI, ZnCl2, tinh bột, Na3C6H5O4.2H2O…

- Hóa chất dùng trong sinh học phân tử:

- TE1:

+ 10 mM Tris–HCl + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0

- ðệm lysis + 0.5 M NaCl + 100 mM EDTA + 10 mM Tris, pH 8.0

- TE (H2O) vô trùng

- Bộ hóa chất cho PCR: Taq polymerase, dNTPs, DNA Ladder, cặp mồi, Buffer taq, cồn tuyệt ñối

- bộ TA TOPO cloning kit

- bộ kit Quagen tach Plasmid

- Bộ kit thôi gel Quagen

- Các dụng cụ dùng cho nghiên cứu vi sinh thông thường như que cấy; ñĩa pepri; bình tam giác; que ria của ðức

3.3 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường phân lập vi khuẩn (Marine Agar 2216) (g/l): Peptone 5.0, cao nấm men 1.0, Citrate sắt -0.1, NaCl - 19.45, MgCl2.6H2O - 8.8, Na2SO4 - 3.24, CaCl2.2 H2O - 1.8, KCl - 0.55, NaHCO3 - 16, KBr - 0.08, thạch - 20.0 Các loại vi lượng (mg/l): SrCl2 - 34.0, H3BO3 - 22.0, Na2(SiO2)nO - 4.0, NaF - 2.4, NH4NO3 - 1.6, Na2HPO4 - 8.0 Ngoài ra còn một số hóa chất dùng trong nuôi cấy vi sinh vật như NaCl 0.9%, nước biển nhân tạo

- Nước biển nhân tạo có thành phần sau (g/l): MgSO4.7H2O - 3.50, NaHCO3 - 0.11, MgCl2.6H2O -4.80, CaCl2.2 H2O - 1.60, KCl - 0.77, NaCl - 28.13

- Môi trường TCBS ( Thiosulfate citrate bile salts succharose) (g/l): Cao men 5; Peptone 10; Sodium thiosulfate (Na2S2O3 ) 10; Sodium citrate (C6H5

Na3O7) 10; Ox gall 5; Sodium cholate (C24H39O5Na) 3; Saccharose 20; NaCl

10; Ferric citrate (C6H5FeO7) 1; Bromothymol blue 0,04; Thymol blue 0,04; Thạch 15

Môi trường thử hoạt tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nghiên cứu

Môi trường thử khả năng sinh catalase

Môt trường xác ñịnh khả năng sinh acetoin (phản ứng Prokauer (V-P))

Môt trường xác ñịnh khả năng kháng NaCl 5,7,10%

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên

Mẫu hải miên ñược chuyển từ tủ -20oC sang hộp xốp có ñá, ñể rã ñông từ

từ Cân 1 gram hải miên cho vào cối sứ, rửa qua bằng nước biển nhân tạo Hải miên sau khi rửa ñược bổ sung 1ml nước biển nhân tạo và nghiền nát Lấy 100µl dịch nghiền hải miên cấy trải lên ñĩa Petri có môi trường Marine Agar

2216 Nuôi ở nhiệt ñộ 30oC Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn các khuẩn lạc ñặc trưng, riêng rẽ, làm sạch lại trên môi trường phân lập, cấy trải ở các nồng ñộ

từ cao ñến thấp và giữ giống cho những nghiên cứu tiếp theo

3.4.2 đánh giá hoạt tắnh ựối kháng Vibrio spp

Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch Các chủng vi khuẩn kiểm ựịnh và vi khuẩn phân lập ựược hoạt hóa trong môi trường lỏng thắch hợp qua ựêm Các chủng vi khuẩn phân lập ựược nuôi trong môi trường Marine Broth 2216 và nhiệt ựộ 30oC trong 24 giờ Các chủng vi khuẩn kiểm ựịnh ựược cấy trải trên môi trường ựặc TCBS với mật ựộ cuối cùng 1-1,5x105/ml Các ựĩa Petri có môi trường TCBS ựã ựược cấy vi sinh vật kiểm ựịnh ựược ựục một số lỗ ựường kắnh 8 mm bằng dụng cụ chuyên dụng Lấy 100 ộl

vi khuẩn phân lập ựã ựược nuôi 24 giờ ựổ ựầy vào lỗ Ủ 30 phút ở nhiệt ựộ phòng ựể dịch nuôi cấy phân tán vào thạch Nuôi các ựĩa ở 30oC Sau 24 giờ, xác ựịnh ựường kắnh vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch D-d( mm) (Trong ựó: D là ựường kắnh vòng vô khuẩn và d là ựường kắnh lỗ thạch

Thắ nghiệm ựược lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình

3.4.3 đặc ựiểm sinh hóa

3.4.3.1 Nhuộm gram

Hóa chất:Dung dịch Tắm kết tinh (Crystal violet), dung dịch Iod, dung

dịch tẩy màu (cồn 95%), dung dịch nhuộm bổ sung Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) ựể có dung dịch 0,5%, nước cất

Vật liệu: Máy ựo (ựầu vật kắnh 100X), phiến kắnh, bình tia , que cấy tròn, ựèn cồn

Tiến hành

Hình 3.1 Các bước tiến hành nhuộm Gram

3.4.3.2 Các phản ứng sinh hóa

a Phương pháp thử phản ứng catalase

Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo

phương thức hô hấp oxy là chất nhận ñiện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý

ðể 1’, rửa nước

ðể 30’’, thấy mất màu, rửa nước

ðể 1’, rửa nước, ñể khô, ñọc kết quả

+ Dùng ñầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính

+ Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính

+ Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch ñĩa cũng cho kết quả tương tự

b Phản ứng khử nitrate

Nguyên tắc:Phát hiện enzyme nitratase xúc tác khử nitrate thành nitrite

hoặc sinh hơi nitrogen tự do của vi khuẩn

Cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu vào môi trường xác ñịnh khả năng khử nitrat, ủ ở 30oC /24 giờ Sau nhỏ từ từ thuốc thử α-naphthylamine 20% và sulfanilic acid vào khoảng 1-2 phút Hai hợp chất này kết hợp với hợp chất nitrit ñể tạo thành hợp chất màu xanh tím

Phản ứng dương tính: dung dịch này chuyển màu xanh tím

Phản ứng âm tính: không ñổi màu

c Phản ứng Voges Proskauer (V-P)

Nguyên tắc:Phát hiện các vi khuẩn có hại loại enzyme chuyển hóa

2,3-butanediol thành acetoin khi có oxy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl-guanidin có màu ñỏ

Cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu vào môi trường khả năng sinh acetoin, ủ ở 30oC /2-6 ngày Sau ñó nhỏ 6 giọt thuốc thử α-naphtol 5% và 2

giọt thuốc thử KOH 40% lắc nhẹ.ðọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất 4 tiếng

Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu ñỏ Phản ứng âm tính: môi trường không ñổi màu

d Phản ứng lên men glucose kỵ khí

Mục ñích: Phát hiện ra enzyme có khả năng phân giải ñường glucose

trong ñiều kiện kỵ khí

Nuôi kị khí cách chủng trên môi trường chứa glucose Tạo ñiều kiện nuôi cấy kị khí bằng cách bổ sung paraphin vào môi trường nuôi cấy và ñặt trong máy tạo môi trường yếm khí Sau 8h- 12h nuôi cấy, các chủng vi khuẩn

có enzyme phân giải ñường glucose thành axit pyruvic làm cho pH môi trường giảm xuống, chất chỉ thị phenol ñỏ chuyển từ mầu ñỏ sang mầu vàng

Phản ứng dương tính: màu ñỏ xuất hiện trong ống nghiệm Phản ứng âm tính: không ñổi màu

e Xác ñịnh khả năng phát triển trên môi trường 5,7,10% NaCl

+ Chuẩn bị môi trường dịch thể thích hợp ñối với từng loài vi khuẩn + Bổ sung NaCl ở các nồng ñộ, môi trường cần trong suốt

+ Cấy vi khuẩn ñã hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày

+ Theo dõi mức ñộ sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi khuẩn làm ñối chứng)

Vi khuẩn phát triển ñược trong môi trường này thì môi trường ñục hơn ñối chứng Nếu không phát triển ñược thì môi trường không ñục

f Khả năng phân giải gelatine

Nguyên tắc: Xác ñịnh khả năng sinh enzyme gelatinase làm tan chảy môi trường gelatine Biến dưỡng protein bởi enzyme gelatinase có hai bước Kết quả tạo hỗn hợp các aminoacid riêng lẻ

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có bổ sung gelatin, nuôi ở

30oC Sau 48h mang ra ñể lạnh so sánh khả năng phân giải gelatin của các chủng vi khuẩn so với ñối chứng

Phản ứng dương tính: môi trường hóa lỏng Phản ứng âm tính: môi trường không bị hóa lỏng

g Khả năng thủy phân tinh bột tan

Nguyên tắc: Vi khuẩn tiết ra enzyme amylase, enzyme này khuếch tán

ra xung quanh vi khuẩn phân giải tinh bột có trong môi trường thành ñường Khi nhỏ dung dịch thuốc thử lugol vào, nơi nào trên môi trường có tinh bột thì

iod tác dụng với tinh bột tạo màu xanh tím Nếu xung quanh vi khuẩn không còn tinh bột thì có màu trong

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có bổ 1-3% tinh bột tan Sau 3-5 ngày nuôi cấy ở ñiều kiện thích hợp lấy ra và nhỏ 1-2ml dung dịch lugol ñể thử Nếu vi khuẩn có enzyme có khả năng phân hủy tinh bột thì chúng sẽ tạo thành một vòng phân giải xung quanh vị trí vi khuẩn phát triển có màu trong, phía bên ngoài mầu xanh tím của lugol

Phản ứng dương tính: môi trường xung quanh vi khuẩn không màu, trong suốt Phía bên ngoài có màu xanh tím

Phản ứng âm tính: Toàn bộ môi trường xung quanh vi khuẩn màu xanh tím

Nếu vòng phân giải mạng lớn thì khả năng thủy phân tinh bột của vi khuẩn càng mạnh

h Khả năng ñồng hóa citrate

Nguyên tắc: Xác ñịnh khả năng sử dụng citate như là nguồn carbon duy

nhất trong quá trình biến dưỡng của vi khuẩn

Nuôi vi khuẩn trên ñĩa môi trường citrate ở 30oC/ 24 giờ

Môi trường có chứa muối amonium vô cơ, vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối amonium làm nguồn nito và sinh NH3 làm pH môi trường tăng nên mầu của chỉ thị chuyển từ màu xanh lục sang xanh lam (phản ứng dương tính)

Phản ứng âm tính: không ñổi màu

3.4.4 ðịnh danh một số chủng tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử Một số phương pháp sinh học phân tử

Tách DNA vi khuẩn, PCR, tách dòng gen theo Sambrook và cs (2001) Giải trình tự gen trên máy giải trình tự tự ñộng ABI PRISMR 3100 (viện Công nghệ sinh học)

ðịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA

Một số chủng vi khuẩn tuyển chọn ñược nuôi qua ñêm, tách DNA tổng

số từ sinh khối vi khuẩn Sử dụng cặp mồi ñặc hiệu cho gen 16S rRNA vi khuẩn và tiến hành PCR ñể tách dòng gen

Chu trình nhiệt cho phản ứng là: 95°C 5 phút, 30 chu kỳ [95°C /30 giây, 50°C /30 giây, 72°C /2 phút], 72°C 5 phút Sản phẩm PCR (2 µl) ñược ñiện di trên thạch agarose 1% tại 110V, 80mA, 50 phút; nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bằng chương trình Gel DocTM 2000 Gel Documentation System (Bio-Rad).Marker 1kb ñược dùng làm thang phân tử chuẩn DNA Sản phẩm PCR ñược tinh sạch bằng kít QiaQuickTM Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Sau ñó, 3 µl sản phẩm PCR tinh sạch ñược trộn với 0.9 µl mồi 16Ss hoặc 16Sr với nước tinh sạch ñể ñạt thể tích 15 µl Hỗn hợpnày ñược gửi ñến MCLAB (Molecular cloning laboratories, South San Fransico, USA).Giải trình tự gen và so sánh trình tự nhận ñược với các trình tự tương ứng trong Ngân hàng gen Quốc tế (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên

Bằng phương pháp mô tả, ñã phân lập ñược 380 dòng vi khuẩn liên kết

loài hải miên Dycidea cinerea thu thập từ biển miền trung Việt Nam Ngoài ra

còn phân lập ñược 10 chủng nấm mốc, 8 chủng nấm men, 15 chủng xạ khuẩn trong tủ -80oC

Các dòng vi khuẩn này có sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc trên môi trường Marine Agar 2216 Làm sạch khuẩn lạc và cấy trải ở nồng ñộ từ cao ñến thấp

Bảng 4.1 Tổng số vi sinh vật ñược phân lập ñược trên 1gam

mẫu Hải miên

hiếu khí

nấm mốc

STT Tên mẫu Vi khuẩn

hiếu khí

nấm mốc

Hình 4.1:a) Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập và làm sạch trên môi

trường marine agar 2216

b) Hình ảnh vi khuẩn cấy trải ở nồng ñộ 10-5 c) Hình ảnh vi khuẩn cấy trải ở nồng ñộ 10-6

Những nghiên cứu phát sinh loài ñã nhận diện ñược 26 phyla vi khuẩn khác nhau liên kết hải miên biển Theo Schmitt và cs (2012), các loài hải miên khác nhau chứa quần thể vi khuẩn gồm các loài khác nhau (quần thể ñặc hiệu loài) và có quần thể nòng cốt Nhưng các loài vi khuẩn trong các loài hải miên khác nhau vẫn có mối quan hệ gần hơn so với các loài vi khuẩn ở môi trường nước xung quanh

Những nghiên cứu sử dụng kính hiển vi cho thấy hải miên với các mô dày ñặc chứa quần thể vi sinh vật dày ñặc, ña dạng về hình thái, trong khi những loài với mô dễ rửa (well-irrigated) chứa ít vi khuẩn và thường chỉ ñơn

a

hình Hai nhóm hải miên ñược phân biệt dựa trên cấu trúc mô và vi khuẩn liên kết với chúng ñược gọi là “hải miên giàu vi sinh vật - HMA” và “hải miên nghèo vi sinh vật - LMA” Mật ñộ vi sinh vật liên kết với LMA hải miên phản ánh mật ñộ vi sinh vật trong nước biển quanh chúng Trong khi nước biển ở tây bắc biển Mediterranean thường chứa 5x105 TB/ml, mật ñộ vi sinh vật liên kết hải miên trong HMA hải miên lớn gấp 2-3 lần

Li và cs (2006) ñã sử dụng 16S rDNA-DGGE fingerprinting không qua nuôi cấy và phân tích phát sinh loài và sự ña dạng của cộng ñồng vi sinh vật

liên kết với 4 loài hải miên Stelletta tenui, Halichrondria, Dysidea avara, và Craniella australiensis biển nam Trung Quốc Kết quả nhận ñược cho thấy Proteobacteria, (α, β và γ subdivisions), là những vi khuẩn chiếm ưu thế và

có lẽ có quan hệ cộng sinh mật thiết với hải miên Hải miên Craniella australiensis có sự ña dạng vi sinh vật lớn nhất, với 4 phyla vi khuẩn là Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, và Actinobacteria; tiếp ñến là Dysidea avara với 2 phyla Proteobacteria và Bacteroidetes; và hải miên Stelletta tenui, Halichrondria với phylum Proteobacteria Lee và cs (2009) ñã

sử dụng phương pháp nuôi cấy và không nuôi cấy ñể ñánh giá liệu hải miên cùng loài hoặc cùng giống quanh ñảo San Juan (Washington) có các quần thể

vi sinh vật ñặc hiệu không Kết quả cho thấy quần thể vi sinh vật liên kết

Myxilla incrustans và Haliclona rufescens rất giống nhau, trong khi với loài Halichondria panicea lại rất khác Kumar và cs (2013) ñã phân lập ñược các loài vi khuẩn Vibrio diazotrophicus, Bacillus subtilis, B.firmus, Thalassomonas agarivorans, Oleiphilus messinensis, Planococcus maritimus

và Brevundinomonas vesicularis từ hải miên biển Hyattella cribriformis

Với mẫu hải miên Dycidea cinerea khá nhiều dòng vi khuẩn ñã ñược

phân lập Nhìn chung các chúng phân lập chỉ có một số dạng khuẩn lạc như tròn, trong; một số khuẩn lạc có sắc tố; một loại khuẩn lạc khác có màu trắng

ñục như sữa và một số có hình dạng dị thường

4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số chủng phân lập

Các dòng vi khuẩn phân lập ñược ñánh giá hoạt tính ñối kháng một số

nguồn bệnh vi khuẩn, trong ñó có hai loài Vibrio gây bệnh cho thủy ñộng vật là V.parahaemolyticus và V.vulnificus và 2 chủng vi khuẩn kiểm ñịnh là M luteus (gram dương) và P.putida (gram âm) Kết quả nhận ñược cho thấy, trong số 380

dòng vi khuẩn phân lập, chỉ có 5 dòng thể hiện hoạt tính ñối kháng với một hoặc vài trong số các chủng vi khuẩn kiểm ñịnh sử dụng (bảng 4.2)

Bảng 4.2: Hoạt tính ức chế sinh trưởng nguồn bệnh vi khuẩn của một số

chủng phân lập

Số

TT

Chủng phân lập

hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh cũng không quá cao, ñường kính vòng kháng khuẩn chỉ từ 5,33 mm ñến 13,33 mm

Rất nhiều nghiên cứu chứng minh các chủng vi khuẩn liên kết hải miên

có hoạt tính kháng khuẩn Chủng Alteromonas rava SANK 73390, sản sinh một

số các chất trao ñổi thứ cấp chứa lưu huỳnh, thiomarinols A-G, có hoạt tính chống vi khuẩn Gram(-) và (+) rộng Thiomarinols ñặc biệt có hoạt tính kháng vi

khuẩn Gram(+) và ñược công bố có hoạt tính chống S.aureus kháng methicilin

(MIC ≤0,01µg/ml) Cách hoạt ñộng chống khuẩn của chúng là ức chế transfer RNA synthetase, giống cơ chế ñược mô tả cho pseudomonic acids A

isoleucyl-and C, ñược tách chiết từ Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586, và là các

thành phần chính của kháng sinh mupirocin (Rahman et al., 2010) Có báo cáo tỉ

lệ vi khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật tách từ ñộng vật không xương sống ở biển cao hơn từ các nguồn khác Rất nhiều các sản phẩm tự nhiên từ ñộng vật không xương sống ở biển có cấu trúc giống cực kỳ so với các chất trao ñổi nguồn gốc vi sinh vật, cho rằng vi sinh vật là nguồn gốc thực sự của các chất trao

ñổi này hoặc tham gia vào sinh tổng hợp chúng Các chi Alteromonas, Pseudomonas, Flavobacterium, Micrococcus, Vibrio, Plesiomonas, Corynebacterium, Photbobacterium và Bacillus chiếm ña số từ 14 loài hải miên

ở ñộ sâu 5 - 10m ñều có khả năng sinh kháng sinh (Saravanakumar et al., 2011)

Hai chủng vi khuẩn P fluorescens và Penicillium cirtinum phân lập từ C diffusa

có hoạt tính kháng một số nguồn bệnh nấm như F oxysporum, B.cinerea, A.alternata, R.solani, F.udam,M.phaseolina, P hypolateritia, C.theae, P.thae Dịch chiết của Pseudomonas sp PB2 liên kết với hải miên S domuncula, thể

hiện hoạt tính anti-angiogenic, hemolytic, kháng ví inh vật và hoạt tính ñộc tế

bào (Vasanthabharathi & Jayalakshmi, 2012) Radjasa (2007) ñã chọn ñược 2

trong số 90 chủng vi khuẩn phân lập từ hải miên có hoạt tính ñối kháng E.coli Penesyan và cs (2011) phân lập một số chủng vi khuẩn từ hải miên Cymbastela concentrica và ñã xác ñịnh ñược tropodithietic acid là hợp chất chịu trách nhiệm

chính cho hoạt tính kháng khuẩn của chúng Yung và cs (2011) ñã phát hiện 3 enzymes thủy phân mới có hoạt tính kháng khuẩn từ quần thể vi sinh vật liên kết hải miên biển Có thể thấy, vi sinh vật liên kết hải miên là nguồn giàu có các hợp