luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi lợn

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Văn Thế NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC VI SINH VẬT PHÙ HỢP CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG PHỤC VỤ CHĂN NUÔI LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – tháng 10 năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Văn Thế NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC VI SINH VẬT PHÙ HỢP CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG PHỤC VỤ CHĂN NUÔI LỢN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Phí Quyết Tiến Hà Nội - 2019 i Lời cam đoan Tơi xin cam đoan viết luận văn tìm tòi, học hỏi thân hướng dẫn tận tình PGS TS Phí Quyết Tiến đồng nghiệp Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bộ môn Dinh dưỡng động vật – Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mọi kết nghiên cứu ý tưởng tác giả khác, có trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn chưa bảo vệ hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ chưa công bố phương tiện Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người cam đoan Nguyễn Văn Thế ii Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Phí Quyết Tiến trực tiếp định hướng, tận tình hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn động viên giúp đỡ bảo tận tình cán Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, tạo hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn TS Trần Hiệp giảng viên Bộ môn Dinh dưỡng động vật – Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin trân gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam truyền đạt kiến thức giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lòng biêt ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp người động viên, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Học viên Nguyễn Văn Thế iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Chữ viết tắt Nội dung ADF Xơ axit Ash Khống tổng số bp Base pair CF Xơ thơ CFU LAB ME Đơn vị hình thành khuẩn lạc Protein Cetyltrimethylammonium bromide Vật chất khô Axit deoxyribonucleic Mỡ thô Fermented Liquid Feed (Thức ăn lên men dạng lỏng) Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) Năng lượng trao đổi NDF Xơ trung tính OD PCR Optical Density Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Deoxyribonucleic acid ribosome Revolutions per minute (Tốc độ lắc vòng/phút) CP CTAB DM DNA EE FLF rDNA RPM SDS TATX TE v/v VK VSV w/v Sodium dodecyl sulfate Thức ăn thô xanh Đệm Tris – EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Đơn vị thể tích/thể tích Vi khuẩn Vi sinh vật Đơn vị khối lượng/thể tích iv Danh mục Bảng Bảng 2.1 Thành phần hóa hóa học nguyên liệu thức ăn 24 Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp với số nguồn dinh dưỡng khác 24 Bảng 3.1 Khả sinh enzyme ngoại bào 38 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 26 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CaCO3 mơi trường MRS (bổ sung 1% CaCO3) 24 chủng vi khuẩn lactic 29 Bảng 3.3 Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 31 Bảng 3.4 Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng tuyển chọn 32 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái 14 chủng nấm men sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 3.6 Kết sàng lọc 03 chủng vi khuẩn 01 nấm men tuyển chọn 36 Bảng 3.7 Đặc điểm sinh học 04 chủng vi sinh vật tuyển chọn 37 Bảng 3.8 So sánh trình tự gen 16S rDNA vùng ITS4 chủng VSV tuyển chọn 39 Bảng 3.9 Giá trị dinh dưỡng phần ăn cho lợn sau 120 lên men với tỷ lệ phối trộn chế phẩm vi sinh khác 45 v Danh mục Hình ảnh Hình 2.1 Đường chuẩn axit lactic 17 Hình 3.1 Hoạt tính xylanase (A) cellulase (B) mơi trường có chất hai chủng đại diện VTX16 VTX18 27 Hình 3.2 Hoạt tính cellulase 26 chủng vi khuẩn tuyển chọn 28 Hình 3.3 Đặc tính phân giải CaCO3 mơi trường MRS số chủng vi khuẩn lactic đại diện nghiên cứu 28 Hình 3.4 Phản ứng với thuốc thử Uphenmen số chủng vi khuẩn lactic đại diện 29 Hình 3.5 Hàm lượng axit lactic chủng vi khuẩn lactic 30 Hình 3.6 Hình thái tế bào số chủng nấm men đặc trưng 34 Hình 3.7 Khối lượng sinh khối khơ hàm lượng protein thô chủng nấm men 35 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA 03 chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 Hình 3.9 Khả chịu pH axit muối mật chủng vi khuẩn tuyển chọn sau 3h ủ 42 Hình 3.10 Động học trình lên men chủng B subtilis VTX16 (A) B licheniformis VTX18 (B) quy mơ L/mẻ 43 Hình 3.11 Động học trình lên men chủng L plantarum LTX28 quy mô L/mẻ 44 Hình 3.12 Động học trình lên men chủng S cerevisiae MTX14 quy mô L/mẻ 44 vi MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt iii Danh mục Bảng iv Danh mục hình ảnh v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỨC ĂN THÔ XANH VÀ LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG CHO CHĂN NUÔI LỢN 1.1.1 Nguồn thức ăn thô xanh phù hợp sử dụng lên men thức ăn cho lợn 1.1.2 Yêu cầu chung số nhóm vi sinh vật sử dụng lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng 1.1.3 Một số đặc điểm thức ăn thô xanh lên men dạng lỏng 1.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ VAI TRỊ CỦA MỘT SỐ NHĨM VI SINH VẬT SỬ DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 1.2.1 Vi sinh vật lên men lactic 1.2.2 Vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào 1.2.3 Nấm men tích lũy protein đơn bào 1.2.4 Yêu cầu an toàn vi sinh vật sử dụng chăn nuôi 1.2.5 Một số đặc tính sinh học nhóm vi sinh vật sử dụng lên men thức ăn chăn nuôi 1.3 HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 11 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH TRONG LÊN MEN THỨC ĂN CHO LỢN VIỆT NAM 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 15 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị 15 2.1.3 Môi trường nghiên cứu 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Phương pháp phân tích hóa sinh 16 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại vi sinh vật phương pháp sinh học phân tử 20 2.2.3 Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm phối trộn thức ăn thô xanh lên men 22 vii 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH CELLLASE VÀ CÁC ENZYM NGOẠI BÀO CAO 26 3.1.1 Sàng lọc khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus spp 26 3.1.2 Xác định hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn 27 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO 28 3.2.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh axit tổng số cao 28 3.2.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh axit lactic cao 29 3.2.3 Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn lactic 30 3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN 32 3.4 TUYỂN CHỌN NẤM MEN TÍCH LŨY PROTEIN ĐƠN BÀO 33 3.4.1 Đặc điểm hình thái, tế bào chủng nấm men 33 3.4.2 Tuyển chọn chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao 35 3.5 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG ĐƯỢC TUYỂN CHỌN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 37 3.5.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng VSV tuyển chọn 37 3.5.2 Phân loại chủng VSV tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử 38 3.5.3 Khảo sát khả chịu muối mật pH axit chủng tuyển chọn 41 3.6 NGHIÊN CỨU THU HỒI VÀ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH 42 3.6.1 Nghiên cứu thu hồi sinh khối chủng tuyển chọn tạo chế phẩm vi sinh 42 3.6.2 Tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng cho lên men thức ăn thô xanh 44 3.7 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 56 MỞ ĐẦU Theo báo cáo Cục Chăn ni, nước ta có đàn lợn khoảng 29 triệu con, đứng đầu ASEAN, đứng thứ châu Á nằm nhóm 15 nước có đàn lợn lớn giới Tốc độ tăng trưởng đàn lợn giai đoạn 2007 – 2017 đạt trung bình 0,91%/năm Sản lượng thịt lợn năm 2016 đạt mức kỷ lục 3,36 tấn, tăng 5% so với năm 2015 đứng thứ giới sau Trung Quốc, Mỹ, Đức, Tây Ban Nha, Brazil Nga Lợn thịt xẻ ngạch xuất sang thị trường Hong Kong Malaysia khoảng 15-20 ngàn (tương đương 200.000 con) giai đoạn từ năm 2013 - 2016 Các số liệu thống kê cho thấy, tình hình xuất thịt lợn Việt Nam hồn tồn không tương xứng với lực sản xuất nước Ngun nhân thịt lợn Việt Nam khơng thể cạnh tranh với thịt lợn xuất nước giá thành sản xuất cao, phụ thuộc vào thức ăn công nghiệp, chất lượng thịt không bảo đảm, dư lượng kháng sinh vượt ngưỡng cho phép Năm 2017 đặc biệt khó khăn với ngành chăn ni Việt Nam việc xuất lợn theo đường tiểu ngạch giảm mạnh nhu cầu thịt lợn Trung Quốc sụt giảm, chi phí chăn ni lợn cao giá bán, nguồn cung cao cầu dẫn tới nhiều chuồng trại chăn nuôi lợn bỏ trống Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí yếu tố định chất lượng, giá thành sản phẩm Năm 2017, Việt Nam nhập 1,5 triệu thức ăn chăn nuôi thành phẩm từ nước ngoài, nhập 16,3 triệu nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi nguồn nguyên liệu nội địa đáp ứng 16,3 triệu Như ngành chăn nuôi nước thực tế mang lợi nhuận chủ yếu cho công ty sản xuất thức ăn Đây lý giá thịt lợn sản xuất nước cao dự kiến hạn chế lợi cạnh tranh với sản phẩm nhập Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) thực Ở nước nhiệt đới, việc sử dụng thức ăn thô xanh chăn nuôi lợn ngày phát triển so với hệ thống chăn nuôi thâm canh giảm chi phí đầu vào Một số nghiên cứu công bố lên men thức ăn thô xanh nâng cao hàm lượng protein thức ăn giàu xơ nhờ tăng sinh khối nấm men Manivanh Preston (2015) công bố lên men thân chuối dọc khoai nước cải thiện lượng protein thu nhận tốc độ tăng trọng lợn Để nâng cao dinh dưỡng loại thức ăn thô xanh đáp ứng nhu cầu phát triển chăn nuôi thâm canh, cần thiết phải áp dụng đồng thời công nghệ 45 Cerevisiae MTX14 đạt mật độ 1012 CFU/g Trộn thành phần chế phẩm vi sinh với tỷ lệ sau: chủng B subtilis VTX16 (1%), B licheniformis VTX18 (1%), L plantarum LTX28 (2%), S Cerevisiae MTX14 (2%), sữa tách béo (4%), cám gạo (30%) bột ngô (60%) Chế phẩm dạng bột sấy thường (nhiệt độ 40°C) đến độ ẩm 5-8% Mật độ sau trộn đạt 109 CFU/kg Chế phẩm dạng bột giữ túi nhơm/túi polyethylen, hút chân khơng, hàn đóng gói tránh ánh sáng trực tiếp, khối lượng chế phẩm kg/1túi Bảo quản chế phẩm điều kiện: 4ºC nhiệt độ phòng (kết khơng cơng bố chi tiết) 3.7 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG Sau nghiền trộn nguyên liệu theo tỷ lệ Bảng 3.9, mẫu thức ăn thời điểm khác nhau: 0h, 120h Kết cho thấy, so với thời điểm trước ủ sau 120h lên men phần cho lợn tỷ lệ chế phẩm vi sinh khác có thay đổi theo hướng cải thiện giá trị dinh dưỡng có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức bổ sung khác tiêu dinh dưỡng khảo sát mức P