h. Khả năng ựồng hóa citrate
4.4. định danh các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA
gen 16S rRNA
Tách DNA tổng số của các chủng phân lập
Từ 1,5ml dịch nuôi cấy của mỗi một chủng vi khuẩn ựã chọn, qua nhiều bước xử lý ựã thu ựược DNA genomẹ độ tinh sạch của sản phẩm ựược kiểm tra bằng phổ hấp thụ tử ngoại và ựiện di trên gel agarose 1%. Hình ảnh ựiện di (Hình 4.15) cũng cho thấy các mẫu DNA khá sạch. Ngoài ra, ựể ựánh giá ựộ tinh sạch của DNA chúng tôi ựo OD 260/280 (nm), kết quả các mẫu DNA ựều có tỉ lệ OD 260/280 dao ựộng trong khoảng 1,8-2, chứng tỏ DNA ựạt tiêu chuẩn, có thể sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR.
Nhân gen 16S ADN riboxom
Từ DNA genom của 5 chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF và 16SR, tiến hành PCR nhân ựoạn gen 16S DNA riboxom, với chu trình nhiệt:
Chu trình : 94oC 3Ỗ Hình 4.15 :Tách DNA tổng số (1) LC22cs2; (2) LC22cs5; (3) LC22b2; (4) LC22 XV5 và (5) LC22XV6 1 2 3 4 5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 43 94oC 1Ỗ (30 chu kỳ) 46oC 1Ỗ 72oC 1Ỗ30ỖỖ 72oC 8Ỗ 4oC ∞
Với cặp mồi ựược thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen 16S RNA riboxom vi khuẩn và khuôn là DNA genom thì theo lý thuyết, sản phẩm PCR có ựộ dài xấp xỉ 1500 bp. Kết quả ựiện di ựồ sản phẩm PCR (hình 4.16) cho thấy các sản phẩm PCR của các chủng chi xuất hiện một băng duy nhất có kắch thước khoảng 1500bp. Như vậy chu trình phản ứng PCR thiết lập là hoàn toàn phù hợp với mục ựắch nhân dòng ựoạn gen 16S ADN riboxom của các chủng nghiên cứụ
Tạo dòng mang gen 16S ADN riboxom
Sản phẩm PCR từ các chủng ựược gắn trực tiếp vào vectơ pCR 2.1 và biến nạp vào Ẹcoli chủng TOP10F. Do sản phẩm PCR ựược tạo với Taq-
Hình 4.16 : điện di ựồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom của các chủng: (1) LC22cs2; (2) LC22cs5; (3) LC22b2; (4) LC22 XV5 và (5) LC22XV6; (M) thang DNA chuẩn
1,5 kb
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 44
polymeraza có ựắnh thêm adenin vào ựầu 3Ỗ của mỗi chuỗi nên sẽ bắt cặp bổ sung với ựầu dắnh timin của vectơ nhờ xúc tác của enzym T4- ADN ligazạ
Các dòng Ẹcoli chủng TOP10F dự ựoán có mang vectơ tái tổ hợp ựược nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampixilin. Sau ựó plasmid tái tổ hợp ựược tách chiết từ huyền dịch Ẹcoli rồi ựược kiểm tra bằng cách ựiện di trên gel agarosẹ Nếu sản phẩm PCR ựược gắn vào vectơ thì trên ựiện di ựồ plasmid tái tổ hợp sẽ chạy chậm hơn so với plasmid không ựược gắn thêm gen ngoại lai (hình 4.17)
Plasmid tái tổ hợp ựược tách chiết từ huyền dịch Ẹcoli ựược kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme cắt hạn chế. Nếu sản phẩm PCR ựược gắn vào vectơ thì khi xử lý bằng EcoRI sẽ xuất hiện băng có kắch thước bằng kắch thước của sản phẩm PCR (hình 4.18 ).
Hình 4.17: điện di ựồ plasmid tái tổ hợp của các chủng vi khuẩn (1) LC22cs2; (2) LC22cs5; (3) LC22b2; (4) LC22 xv5 và (5) LC22xv6; (X) plasmid không mang gen ngoại lai
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 45
điện di ựồ trên hình 4.18 cho thấy sản phẩm PCR ựã ựược gắn vào vector pCR2.1, trong ựó sản phẩm PCR của chủng LC22b2 có ựiểm cắt của enzyme EcoRỊ Các plasmid tái tổ hợp ựược làm sạch và giải trình tự gen. 1 M 2 3 4 M 5 6 7 M
Hình 4.18 : điện di ựồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp
(1) LC22cs2; (2) LC22b2; (3,7) sản phẩm PCR; (4) LC22cs5; (5)LC22xv5 và (6) LC22xv6; (M) 1Kb DNA lađer Fermentas
Giải trình tự gen và dựng cây phân loại của các chủng
Trình tự của gen ựược xác ựịnh theo phương pháp của Sanger&ựtg. Sau khi xử lý các dữ liệu thu ựược qua chương trình Bioedit, chúng tôi ựã nhận ựược trình tự hoàn chỉnh các gen 16S ARN riboxom của các chủng
1,65kb 5kb
0,8kb
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 46