khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây rau má lá sen hydrocotyle bonariensis l. và hydrocotyle

và Hydrocotyle vulgaris L.” với đề tài này chúng em mong muốn góp phần vào việc khảo sát sự có mặt và hàm lượng của các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen... Với đề tài “Khảo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRONG CÂY RAU MÁ LÁ SEN

Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L.

Cán bộ hướng dẫn:

ThS TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN GIÁP - 2041719

NGUYỄN NGỌC THỂ - 2041778 Lớp: Cử nhân Hóa – K.30

Cần Thơ 06/2008

LỜI CẢM ƠN



Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Tôn Nữ Liên Hương, giảng

viên bộ môn Hóa Học – Khoa Khoa Học – Trường Đại Học Cần Thơ và là giáo viên hướng dẫn đề tài luận văn, đã cho chúng em ý tưởng, động lực và sự giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian chúng em thực hiện đề tài luận văn

Xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu

cho các kết quả

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức

cho chúng em trong những năm học vừa qua; cung cấp, hỗ trợ các phương tiện để chúng em có thể thực hiện đề tài luận văn

Xin gửi lời cảm ơn đến Cô Lê Thu Trang, Cô Lê Thị Ngọc Điệp, nhân viên

phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ, phòng thí nghiệm Hóa Phân Tích đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn các bạn sinh viên đã cùng chúng tôi thực hiện đề tài.

Cảm ơn gia đình, bạn bè những người đã động viên, hỗ trợ chúng em hoàn

thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Trường Đại Học Cần Thơ

Khoa Khoa Học

Bộ Môn Hoá Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -

Tôn Nữ Liên Hương

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: ThS Tôn Nữ Liên Hương

2 Tên đề tài: “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá

Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L.”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Giáp MSSV: 2041719

b Nội dung:

c Những vấn đề còn hạn chế:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2008

Cán bộ hướng dẫn

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện: .

2 Tên đề tài: Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen

Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L.

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Giáp MSSV: 2041719

b Nội dung:

c Những vấn đề còn hạn chế:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2008

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch hiện đang được sử dụng rộng rãi và ngày càng nhiều, tuy nhiên chúng đều đắt tiền

và có nhiều tác dụng phụ gây nguy hiểm Vì vậy xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ nguồn gốc thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng ít độc hơn và dễ dung nạp, nhất là ở người cao tuổi và người có bệnh mạn tính Chính vì vậy nhóm sắc tố tự nhiên flavonoid là một trong những nhóm sắc tố không kém phần thu hút sự chú ý quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu

Hiện nay đã có đề tài nghiên cứu về khả năng sản xuất flavonoid từ nhiều loại cây cỏ, tuy nhiên Rau Má Lá Sen là nguồn nguyên liệu mới khảo sát và định danh ở nước ta trong thời gian ngắn gần đây và chưa được nghiên cứu về hóa học Vì vậy mở rộng việc nghiên cứu trên các nguồn nguyên liệu mới, là cần

thiết Đây cũng chính là lý do mà chúng em chọn đề tài “ Khảo sát các hợp

chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L.” với đề tài này chúng em mong muốn góp phần vào

việc khảo sát sự có mặt và hàm lượng của các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen

Với đề tài “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen

Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L.”, luận văn sẽ tiến hành

ly trích tạo các cao thô từ lá và thân cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris theo 2 phương pháp: phương pháp trích lỏng – lỏng và

phương pháp trích rắn – lỏng Sau đó định tính sự có mặt của flavonoid trong các mẫu cao thô này Đồng thời tiến hành điều chế flavonoid thô từ cao

methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris và

cô lập flavonoid tự nhiên từ cao flavonoid thô bằng sắc ký cột Nội dung của đề tài được tóm lượt như sau:

 Phần 1: Tổng quan

 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả

 Phần 3: Kết luận và kiến nghị

Mục lục

MỤC LỤC



LỜI CẢM ƠN .i

LỜI MỞ ĐẦU .i

PHẦN TÓM LƯỢT .ii

MỤC LỤC iii

MỤC LỤC BẢNG vi

MỤC LỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ vii

MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT ix

PHẦN 1 1

TỔNG QUAN 1

CHƯƠNG 1 2

GIỚI THIỆU CHUNG 2

1.1 Giới thiệu chung về cây Rau Má 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Sinh thái học của cây Rau Má 2

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.2 Sơ lược về cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L .5

1.2.1 Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L 5

1.2.1.1 Tên gọi 5

1.2.1.2 Phân loại 5

1.2.1.3 Sinh thái học 5

1.2.1.4 Thành phần hóa học 6

1.2.2 Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L .6

1.2.2.1 Tên gọi 6

1.2.2.2 Sinh thái học 7

1.2.2.3 Thành phần hóa học 7

1.3 Công dụng của cây Rau Má 9

1.4 Giới thiệu chung về flavonoid 9

1.4.1 Định nghĩa 9

1.4.2 Phân loại 10

1.4.2.1 Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học 10

1.4.2.1.1 PCO 10

1.4.2.1.2 Quercetin 11

1.4.2.1.3 Biflavonoid của họ chanh (cam, quít, chanh,…) 11

1.4.2.1.4 Polyphenol của trà (chè) xanh 11

1.4.2.2 Phân loại dựa theo màu sắc 11

1.4.2.2.1 Anthocyanin 11

1.4.2.2.2 Anthoxathin và flavone 12

1.4.2.2.3 Catechin và leucoanthocyanin 13

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang iv

Mục lục

1.4.3 Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm sắc tố flavonoid 13

1.4.4 Tác dụng sinh học của nhóm sắc tố flavonoid 15

CHƯƠNG 2: MỘT SỐ QUI TRÌNH TRÍCH FLAVONOID Ở VIỆT NAM 16

2.1 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ 16

2.1.1 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetat chì 16

2.1.2 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau 17

2.2 Trích rutin từ hoa Hòe 18

2.3 Trích polyphenol từ trà (có hỗ trợ bằng vi sóng) 19

CHƯƠNG 3: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRÍCH TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY 22

3.1 Phương pháp trích lỏng – lỏng 22

3.2 Phương pháp trích rắn – lỏng 23

3.2.1 Phương pháp trích ngâm dầm 23

3.2.2 Phương pháp trích bằng máy Soxhlet 23

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

CHƯƠNG 1 : VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

1.1 Địa điểm - thời gian tiến hành 25

1.2 Phương tiện nghiên cứu 25

1.2.1 Dụng cụ 25

1.2.2 Hóa chất 26

1.3 Phương pháp nghiên cứu 26

CHƯƠNG 2: ĐIỀU CHẾ VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU CAO 27

2.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu 27

2.2 Điều chế cao 27

2.2.1 Điều chế cao methanol tổng và cao nước (trích bằng phương pháp ngâm dầm) 27

2.2.1.1 Điều chế cao methanol tổng 28

2.2.1.2 Điều chế cao nước 29

2.2.2 Điều chế cao theo phương pháp trích lỏng – lỏng 30

2.2.2.1 Sơ đồ điều chế cao 30

2.2.2.2 Điều chế cao petroleum ether 31

2.2.2.3 Điều chế cao chloroform 32

2.2.2.4 Điều chế cao ethyl acetate 33

2.2.2.5 Điều chế cao buthanol 34

2.2.3 Điều chế cao theo phương pháp trích rắn – lỏng (trích Soxhlet)

36 2.2.3.1 Sơ đồ điều chế cao 36

2.2.3.2 Điều chế cao 36

2.3 Định tính sự có mặt của flavonoid trong các mẫu cao 39

2.3.1 Định tính sự có mặt của flavonoid bằng thuốc thử Shibata và dung dịch HCl đậm đặc 39

2.3.2 Định tính sự có mặt của flavonoid bằng 3 loại thuốc thử: thuốc thử Stiasny, chì acetate bão hoà và dung dịch FeCl3 bão hoà 40

CHƯƠNG 3: ĐIỀU CHẾ FLAVONOID THÔ 43

Mục lục

3.1 Trích flavonoid thô bằng dung dịch acetate chì 43

3.2 Trích flavonoid thô bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau

45 3.3 Kết luận 46

3.4 Định tính flavonoid thô 46

CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT CAO FLAVONOID THÔ CỦA CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS 48

4.1 Chuẩn bị nguyên liệu 48

4.2 Sắc ký cột cao flavonoid thô 48

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang vi

Mục lục

MỤC LỤC BẢNG



Bảng 1: Thành phần hóa học của cây Rau Má 3

Bảng 2: Các hợp chất hóa học trong cây Rau Má 4

Bảng 3: Một số nhóm flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hằng ngày 9

Bảng 4: Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid 14

Bảng 5: Các dụng cụ thí nghiệm 25

Bảng 6: Hóa chất sử dụng 26

Bảng 7: Tóm tắt thu suất điều chế cao methanol tổng và cao nước 30

Bảng 8: Thu suất điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích lỏng – lỏng 35

Bảng 9: Thu suất điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích rắn – lỏng (trích Shoxhlet) 38

Bảng 10: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle bonariensis 40

Bảng 11: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle vulgaris 40

Bảng 12: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle bonariensis 42

Bảng 13: Kết quả định tính flavonoid trong các cao của cây Hydrocotyle vulgaris 42

Bảng 14: Thu suất điều chế flavonoid thô bằng dung dịch acetate chì 44

Bảng 15: Thu suất điều chế flavonoid thô bằng chu trình kiềm 46

Bảng 16: Kết quả định tính flavonoid thô 47

Bảng 17: Kết quả của quá trình sắc ký cột 49

Mục lục

MỤC LỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ



Hình 1: Cây Rau Má 2

Hình 2: Cây Hydrocotyle bonariensis 5

Hình 3: Hoa Hydrocoytyle bonariensis 5

Hình 4: Cây Hydrocotyle vulgaris 6

Hình 5: Hoa Hydrocotyle vulgaris 6

Hình 6: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle bonariensis 29

Hình 7: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle vulgaris 29

Hình 8: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis 30

Hình 9: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle vulgaris 30

Hình 10: Sắc ký bản mỏng cao PE của cây Hydrocotyle bonariensis 32

Hình 11: Sắc ký bản mỏng cao PE của cây Hydrocotyle vulgaris 32

Hình 12: Sắc ký bản mỏng cao C của cây Hydrocotyle bonariensis 33

Hình 13: Sắc ký bản mỏng cao C của cây Hydrocotyle vulgaris 33

Hình 14: Sắc ký bản mỏng cao Ea của cây Hydrocotyle bonariensis 34

Hình 15: Sắc ký bản mỏng cao Ea của cây Hydrocotyle vulgaris 34

Hình 16: Sắc ký bản mỏng cao Bu của cây Hydrocotyle bonariensis 34

Hình 17: Sắc ký bản mỏng cao Bu của cây Hydrocotyle vulgaris 34

Hình 18: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle bonariensis 39

Hình 19: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle vulgaris 39

Hình 20: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle bonariensis 41

Hình 21: Định tính flavonoid cho kết quả dương tính của cây Hydrocotyle vulgaris 41

Hình 22: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle bonariensis 44

Hình 23: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle vulgaris 44

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang viii

Mục lục

Hình 24: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyl bonariensis 45

Hình 25: Sắc ký bản mỏng flavonoid thô của cây Hydrocotyle vulgaris 45

Hình 26: Định tính flavonoid thô của cây Hydrocotyle bonariensis 47

Hình 27: Định tính flavonoid thô của cây Hydrocotyl vulgaris 47

Hình 28: Sắc ký bản mỏng cao flavonoid thô 49

Hình 29: Sắc ký cột cao flavonoid thô 49

Hình 30: Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn 6 50

Sơ đồ 1: Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetate chì 16

Sơ đồ 2: Trích flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau 17

Sơ đồ 3: Trích rutin từ hoa Hòe 18

Sơ đồ 4: Trích polyphenol từ trà 19

Sơ đồ 5: Tinh chế sơ bộ sản phẩm 20

Sơ đồ 6: Điều chế cao methanol tổng và cao nước 28

Sơ đồ 7: Điều chế cao theo phương pháp trích lỏng – lỏng 31

Sơ đồ 8: Điều chế cao theo phương pháp trích rắn – lỏng 36

Phần 1: Tổng quan

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Giới thiệu chung về cây Rau Má

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Cetella asiatica.

Tên đồng nghĩa: Hydrocotyle asiatica L.

Tên khác: Liên Tiền Thảo, Tích Tuyết Thảo, Phắc Chèn (Tày)

Tên nước ngoài: Indiana pennywort (Anh), Centelle

Họ: Hoa tán (Apiaceae)

Hình 1: Cây Rau Má

1.1.2 Sinh thái học của cây Rau Má [16-17]

 Cây ưa ẩm, hơi chịu nóng, thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng Rau Má sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm

 Thân thảo nhỏ, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu Lá mọc

so le, nhưng thường tụ họp 5 – 6 lá ở một mấu, phiến lá nhẵn, mép khía tai bèo, cuốn lá mảnh, dài 3 – 5 cm, có khi 7 – 8 cm

 Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ, mỗi tán mang 1- 5 hoa, hoa thường có màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống, cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan, nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim, bầu hình cầu

 Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7 – 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ

 Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang 3

Phần 1: Tổng quan

1.1.3 Phân bố

 Hydrocotyle asiatica L phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, một số ở vùng

nhiệt đới Nam và Đông Nam Châu Á và các tỉnh Nam Trung Quốc

 Ở Việt Nam, Rau Má là loại cây rất quen thuộc Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi Ở vùng đồng bằng sông Cửu Long phát hiện hai loại giống Rau Má Lá Sen đã được định dạnh, đó là Rau

Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L.

 Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi, Trần Hợp, [1,3,5] ở Việt Nam có

hơn hai mươi loài Rau Má, đó là: Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard, Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard, Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle siamica Craib, Hydrocotyle sibthorpioides Lamk, Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim.

1.1.4 Thành phần hóa học

Rau Má thường chứa những hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau,sau đây là bảng thành phần hóa học và bảng các hợp chất hóa học của câyRau Má [16-17]

Bảng 1: Thành phần hóa học của cây Rau Má

Khi thủy phân, thankunisid cho acid thankunic, glucose và rhamnose.

Các acid triterpenic trong Rau Má là acid asiatic, acidbrahmic, acid isobrahnic

Tinh dầu

Phần trên mặt đất của cây Rau Má mọc ở Malaysia có 41thành phần, trong đó 80% là các sesquiterpen (thành phần chính) và 10% germacren-D Cây Rau Má mọc ở Srilanca chứa tinh dầu trong đó có -copaen 14%, -caryophylen12%, trans--farnesen 53% và -humulen 9%

Flavonoid Các flavonoid gồm: kaempferol, quercetin, 3-glucosyl

quecetin, 3-glucosyl-kaempferol

Steroid Các hợp chất steroid gồm: -sitosterol, stigmasterol và

campestrol

Dầu béo Các glyceride của các acid oleic, linoleic, lignoceric,

palmitic, stearic, linolenic, elaidic

Acid amin Acid glutamic, serin, alanin

Các nhóm

khác

Tanin, carotenoid, vitamin C, alkaloid (hydro cotylin),oligosaccharide (centelose)

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis L.

Tên nước ngoài: Hydrocotyle petiolaris D.C, Hydrocotyle polystachyavar,

guin queradiata Thourasex A Rich, Pennywort, Kurnell curse, large leaf pennywoet paraguita

Tên thường gọi: Rau Má Lá Sen

Hình 2: Cây Hydrocotyle bonariensis Hình 3: Hoa Hydrocoytyle bonariensis

 Quả hình bầu dục, dày 0,5 – 2 cm, rộng 2,5 – 3 mm, đáy và đỉnh có khíasống lưng và phần bên gân nổi rõ.

1.2.1.4 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu hóa học trên cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis cho

biết khả năng hấp thụ muối NaCl của lá cây ở những vùng đất mặn có ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyl và làm thay đổi hàm lượng protein trong lá,

do có sự điện chuyển So với cây Foeniculum vulgare L thì cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L nhận NaCl nhiều hơn.

Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L đã được người dân sử dụng để

làm thực phẩm và theo họ cây có vị đắng hơn các loại Rau Má thường Chưa

có sự nghiên cứu nào về thành phần hóa học trên cây này

1.2.2 Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L [4]

1.2.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris L.

Tên khác: Marsh pennywort, Umbrella plant, Rau Má Lá Sen

Hình 4: Cây Hydrocotyl vulgaris Hình 5: Hoa Hydrocotyle vulgaris

6 cm, có khía tai bèo, có 6-9 gân lá.

 Hoa màu trắng, hồng nhạt hoặc hơi xanh, có đường kính 1 mm

 Quả hình trứng dài khoảng 2 mm, rộng khoảng 2,5 mm, dày 0,8 mm

 Năm 1979, Hiller [10] và cộng sự đã cô lập được quercetin-3--D- galactopyranosyl-6-O--L-arabinopyranoside, còn gọi là rumarin, từ phần mọc

trên mặt đất của cây Hydrocotyle vulgaris L.

Quercetin-3--D-galactopyranosyl-6-O--L-arabinopyranoside

 Năm 1981, Voigt [10] và các cộng sự cô lập từ Hydrocotyle vulgaris L tươi

được hỗn hợp gồm sáu flavonol glycoside bên cạnh các kaempferol và quercetin glycoside Đó là các chất sau: quercetin-3-O-robinobioside, quercetin-3-O--D-galactopyranoside, quercetin-3-O--D-galactopyranosyl-6- O--L-arabinopyranoside, kaempferol-3-O-robinobioside, và hai chất với phầnđường tương tự của kaemferol

Kaempferol-3-O-robinobioside

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang 9

1.3 Công dụng của cây Rau Má

 Rau Má có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng giải nhiệt nên được dùng trong thực phẩm như một loại rau gia vị hoặc dùng làm nước giải khát rất thích hợp trong mùa hè

 Ngoài ra Rau Má còn được dùng trong y học có thể chữa được nhiều loại bệnh như: Cầm máu, làm lành vết thương, bảo vệ thần kinh, trị mụn nhọt, trị kiết lị, trị bệnh chảy máu cam, chữa sốt, trị ho…

1.4 Giới thiệu chung về flavonoid

1.4.1 Định nghĩa

 Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, có vai trò rất lớn trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại rau, hoa, quả… Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy flavonoid rất hữu ích trong việc điều trị và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh Flavonoid được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây, các loài thực vật, trà, rượu, trái cây và cả rễ cây,… Sau đây là bảng một số nhóm flavonoid

có chứa trong thực phẩm quen thuộc hằng ngày

Bảng 3: Một số nhóm flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hằng ngày

Hạt đậu tương (đậu nành) Isoflavone

 Về cấu trúc flavonoid là một nhóm chất thiên nhiên quan trọng có chứa 2vòng benzene (ký hiệu là vòng A và vòng B) được nối với nhau bởi một mạch

3 cacbon Mạch cacbon này được đánh theo thứ tự các số tương ứng là 2, 3,

4, có thể liên kết với 1 nhóm hydroxyl (-OH) ở vòng A để hình thành nên vòng C Flavonoid được phân loại dựa theo cấu trúc của vòng C này [6,12]

Khung sườn của flavonoid

 Khác với nhóm carotenoid vốn cũng có màu vàng và đỏ, không tan trong nước, các glucosid của flavonoid đều dễ tan trong nước Một số tan trong rượu acid vô cơ loãng và bazơ loãng Flavonoid cho kết tủa màu vàng cam hoặc đỏ với acetate chì, kết tủa màu xanh lục hoặc đỏ nâu với FeCl3 [6-7]

1.4.2 Phân loại

1.4.2.1 Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học [13]

Hơn 4000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa học Dựa vào cấu trúc hóa học flavonoid được phân ra làm 4 nhóm chính gồm: PCO, quercetin, biflavonoid cam quít và rượu đa chức ở trà xanh

1.4.2.1.1 PCO

Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn được gọi là procyanidins) Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác tạo thành một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins nhị trùng, tam trùng, tứ trùng và

các phân tử trùng phân lớn hơn được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi

tắt là PCO PCO có trong nhiều loại thực vật và rượu vang đỏ, tuy nhiên về

mặt thương mại người ta hay dùng PCO trong dịch trích hạt nho

Đề tài luận văn tốt nghiệp

1.4.2.1.3 Biflavonoid của họ chanh (cam, quít, chanh,…)

Các Biflavonoid trong cam quít gồm: Rutin, hesperidin, quercitrin và naringin Hầu hết các khảo sát về rutin và hỗn hợp biflavonoids thô đều được thực hiện trong thập niên 1970 Từ đó đến nay người ta thường dùng loại hỗn hợp rutinoside định chuẩn gọi là hydroxyethylrutosides (HER) Các bằng chứng lâm sàng rõ rệt nhất trong điều trị tăng tính thấm thành mạch, dễ bị vết bầm dưới da, trĩ và các trường hợp dãn tĩnh mạch

1.4.2.1.4 Polyphenol của trà (chè) xanh

Cả trà xanh và trà đen đều xuất nguồn từ cây trà (chè) (Camellia sinensis) Trà

xanh được làm từ đọt lá, sấy nhẹ, còn trà đen được hình thành sau một quá trình oxy hóa lá trà Polyphenol có chứa vòng phenol trong cấu trúc phân tử Polyphenol chính trong trà xanh là các flavonoid (catechin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, và proanthocyanidin)

1.4.2.2 Phân loại dựa theo màu sắc [14]

Dựa theo màu sắc flavonoid được phân ra làm 3 nhóm chính:

 Anthocyanin cho màu đỏ, xanh, tím

 Anthoxanthin và flavone cho màu vàng

 Tanin thực phẩm: Bao gồm catechin và leucoanthocyanin không màu

 Có 3 loại anthocyanidin tìm thấy trong mô thực vật là:

Quercetin có trong vỏ củ hành, chanh, quýt

Apigenin là glycoside có trong cây ngò và thược dược

Hesperitin là sắc tố của cam, chanh

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang 13

1.4.2.2.3 Catechin và leucoanthocyanin

Các chất này vô sắc, nhưng phản ứng với kim loại đều cho màu

 Catechin là cấu tử của chất tannin thu được từ một số cây như thông, liễu

và nhất là trong chồi non cây trà Catechin còn có trong một số loại quả như lê, táo, mận, nho

 Các tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của acid galic và acid digalic ởdạng tự do cũng như dạng kết hợp với glucose

 Dưới tác dụng của tannin, protein dễ bị đông vón, chúng rất bền với nước

và các vi khuẩn gây tối, có tính dẻo, đàn hồi

1.4.3 Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm sắc tố flavonoid

Các flavonoid đều có chung một khung sườn flavonoid và chúng được phân loại dựa vào khung sườn này, sau đây là bảng trình bày một số cấu trúc phân

tử thuộc nhóm flavonoid thường gặp: [12,15]

Bảng 4: Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid

Đề tài luận văn tốt nghiệp

Tháng 06/2008

Trang 15

1.4.4 Tác dụng sinh học của nhóm sắc tố flavonoid

 Kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ung thư

 Hoạt tính chống oxy hóa mạnh tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzyme hay hệ thống thần kinh, nội tiết…

 Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim,

xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giống như các chất chống oxy hóa khác như vitamin C, E,…) [13]

 Nhiều loại flavonoid có chứa vitamin P, tăng cường tác dụng của acid ascorbic, giúp củng cố các thành mạch máu đang bị suy yếu và có tác dụng làm dịu các cơn đau Chúng còn được xem là một loại thuốc tiêu độc

 Ngoài ra, nếu lượng flavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên rõ rệt Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, E, selenium và kẽm Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động

hỗ trợ cho nhau

CHƯƠNG 2 MỘT SỐ QUI TRÌNH TRÍCH FLAVONOID

Ở VIỆT NAM

2.1 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ

2.1.1 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetat chì [6]

C

ơ s ở lý t hu y ế t : Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid Hòa tan cao bằng dung

dịch ethanol 10% trong nước, chứa trong một bình tam giác Sau đó rót từ từ dung dịch nước 10% acetate chì vào bình tam giác này, khuấy nhẹ ta thu được tủa flavonoid Lọc thu lấy tủa, hòa tan tủa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành một dung dịch keo đồng nhất Sau đó thêm từ từ dung dịch nước bão hòa Na2SO4, nhằm loại bỏ tủa PbSO4 Lọc lấy dung dịch nước, cô quay dịch lọc ở áp suất kém ta thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần Sắc

ký cột để tách riêng các flavonoid

Q ui trình :

Cao tríchHòa vào ethanol 10%

Dung dịch nước

Dung dịch nước acetate chì 10%, khuấy đều, để yên, lọc

Hòa vào ethanol 10%

Thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4

Để yên Lọc

Tủa PbSO4

Sơ đồ 1: Trích flavonoid ra khỏi

cây cỏ bằng dung dịch acetate chì

Dung dịch nước

Cô quayFlavonoid thô + Na2SO4 dư

Hòa vào methanol Cô quay Flavonoid thô

Sắc khí cộtCác flavonoid riêng

2.1.2 Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng các dung dịch kiềm có độ

kiềm khác nhau [6]

C

ơ s ở l ý t hu y ế t : Các flavonoid do có mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thể

tan được trong dung dịch kiềm Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềm loãng hoặc nước vôi ta có thể trích được flavonoid ra khỏi cây cỏ, dung dịch trích sau đó sẽ được acid hóa để trả flavonoid về dạng –OH tự do, quá trình trích này được thực hiện như sau: Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid Hòa tan cao vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụ: chloroform, ethyl acetate… Tiến hành trích lỏng - lỏng dung dịch này với dung dịch nước kiềm 5 – 10% như: dung dịch NaHCO3, Na2CO3… Acid hóa các dịch trích Sau đó sử dụng dung môi hữu cơ phù hợp để trích các flavonoid ra khỏi dung dịch nước Làm khan nước bằng CaCl2, Na2SO4… Sau đó đuổi dung môi, ta thu được cao thô chứaflavonoid toàn phần Tiến hành sắc ký cột để tách riêng các flavonoid

Thực hiện sự trích lỏng - lỏng với dungmôi hữu cơ: chloroform, ethyl acetate,…

Làm khan nước

Đuổi dung môi.

Flavonoid thô

Sắc kí cộtCác flavonoid riêng rẽ

Sơ đồ 2: Trích flavonoid bằng các dung dịch

kiềm có độ kiềm khác nhau

2.2 Trích rutin từ hoa Hòe [2]

C

ơ s ở l ý t h u y ết :

 Nguyên liệu sử dụng chính là hoa Hòe khô Sau khi mua về, sàng để loại đất cát, cành lá Tất cả đem sấy khô ở nhiệt độ 50- 600C Sau đó đem nghiền mịn, ta thu được bột hoa Hòe, bột này được bảo quản kín và sử dụng để đều chế rutin

 Bột hoa Hòe được trích với dung môi ở nhiệt độ sôi thích hợp, riêng với dung môi là NaOH thì thực hiện ở 750C Tiến hành lọc để thu dịch lọc Dịch lọc sau đó được acid hóa với HCl về pH = 3 – 4, sau đó làm lạnh và kết tinh

 Kết quả thu được nhận thấy khi độ phân cực của dung môi giảm dần, lượng rutin thu được cũng tăng dần Hơn nữa, khi dung môi là nước thì những thành phần chất nhầy, nhựa, saponin, … cũng được trích ra và kết hợp với rutin mịn khi nhiệt độ hạ, tạo thành hệ gần như keo, làm quá trình lọc tách bã rất khó khăn Các dung môi là cồn không gặp trở ngại này Tiến hành tinh chế rutin sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 800.

Q ui trình : Qui trình trích rutin từ hoa Hòe được tóm tắt trong sơ đồ sau:

Dung môi

Nguyên liệuTrích với dung môi

Sơ đồ 3: Trích rutin từ hoa Hòe

2.3 Trích polyphenol từ trà (có hỗ trợ bằng vi sóng) [11]

C

ơ s ở l ý t hu y ế t : Trà tươi nguyên liệu sau khi được mang về phòng thí

nghiệm được xử lý ức chế enzyme, để ráo và xay nhỏ bằng máy xay thực phẩm Sau đó, bột trà được cân với lượng thích hợp rồi cho vào bình cầu, thêm dung môi và thực hiện quá trình trích ly Để tránh hiện tượng quá nhiệt

do chiếu vi sóng liên tục, quá trình chiếu sóng được thực hiện gián đoạn theo chu kì, 1 phút chiếu sóng, 2 phút làm mát bằng ống giải nhiệt trong bình, nhiệt độ trong suốt quá trình trích ly được giữ ở mức 75 – 800C Sau khi kết thúc quá trình trích ly, dịch trà được đem lọc, bỏ bã, dịch lọc được định mức lên thể tích thích hợp và đem phân tích để đánh giá hiệu quả trích ly thu được

Q ui trình: Qui trình trích polyphenol từ trà được tóm tắt trong sơ đồ sau:

Búp trà nguyên liệuDiệt men

Dịch tríchXác định polyphenol tổng Phương pháp so màu

Đánh giá hiệu quảquá trình trích ly

Sơ đồ 4: Trích polyphenol từ trà có hỗ trợ bằng vi sóng

Sau khi polyphenol được trích ra từ trà, sẽ được tinh chế sơ bộ lại theo qui trìnhđược thể hiện trong sơ đồ sau:

Dịch lọc

Dung dịch gelatin 25%

Tỉ lệ 1: 60

Gia nhiệt đến 400CTạo tủa (loại các phần tử lơ lửng)Làm lạnh dưới 100CLọc hút chân không Tủa

Vtđ Chloroform

Dịch lọcTách loại các chất màu

Vtd ethyl acetate ( 200mlx2)

Na2SO4 làm khan

Chất bảo quản

TríchLớp nước Chuyển pha ethyl acetate Làm khan

Cô chân khôngSấy phun / Sấy thăng hoa

Lớp Chloroform

Ethyl acetateSản phẩm dạng bột

Sơ đồ 5: Tinh chế sơ bộ sản phẩm T

hu y ế t m i n h qu i t r ì nh : Dịch trích thu được sau quá trình trích ly được tách loại

sơ bộ các tạp chất lơ lửng, tách các tannin phân tử lớn bằng cách gia nhiệt đến

400C và tạo tủa với dung dịch gelatin 25%, sau đó dung dịch được làm lạnh đến

< 100C và lọc bỏ tủa Dịch trích thu được trong suốt, không bị tủa lại trong thời

gian quan sát 1 tháng Do các catechin không bị tủa với gelatin nên quá trình xử

lý sẽ không ảnh hưởng đến thành phần catechin của dịch trích

Dịch trích sau khi lọc được tách loại chất màu và một phần caffeine bằng cách trích với chloroform, sau đó loại bỏ lớp chloroform (có màu xanh) Lớp nước thu được có màu vàng Phần catechin trong lớp nước được chuyển sang lớp ethyl acetate, bằng cách trích với 3 thể tích ethyl acetate, dung dịch ethyl acetate sau cùng có màu vàng nhạt Sau đó dịch ethyl acetate được tiến hành làm khan và cô đặc để loại bỏ dung môi, trong quá trình cô đặc một lượng nước thích hợp được thêm vào để tách hoàn toàn ethyl acetate Dịch đặc được đem làm khô bằng cách sấy phun hoặc sấy thăng hoa