thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật

Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụngđược biết tới như sau: 2, [3], 5, 25, 32, 33  Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến  Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SVTH : ĐỖ QUẾ MI HƯƠNG MSSV : 105111016

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tổng hợp, biên tập tài liệu có liên quan tới đề tài

Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vikhuẩn lên men lactic

Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính Probiotic

3 Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 01/04/2009

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 24/06/2009

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày tháng năm 2009

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN

Người duyệt (chấm sơ bộ):

LỜI CẢM ƠN

Qua bốn năm học tập tại Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ em đã được Thầy Cô trong Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học hướng dẫn, dạy dỗ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường và quá trình làm khóa luận.

Em xin được tỏ lòng biết ơn của mình tới quí Thầy Cô Nhờ Thầy Cô mà từng lớp sinh viên chúng em đã tự tin trên đường đời sau này.

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương, Cô là người trực tiếp hướng dẫn cho em và đã hết lòng quan tâm, chỉ bảo cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Cám ơn Cô đã cho em những bài học quí giá sẽ là hành trang quí giá để bước vào đời.

Em cũng gửi lời cảm ơn các Thầy Cô trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em thực tập tại phòng thí nghiệm.

Sau cùng em xin chân thành cảm ơn đến tất cả người thân, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ vào tạo điều kiện thuận lợi, đóng góp ý kiến giúp em hoàn thành bài khóa luận này.

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

TP HCM, ngày 20 tháng 6 năm 2009

Sinh viên

Đỗ Quế Mi Hương

MỤC LỤC

Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục kí hiệu và viết tắt

Danh mục bảng biểu

Danh mục hình ảnh

Danh mục đồ thị

Chương 1: Mở Đầu

1.1 Đặt vấn đề 01

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 03

1.3 Đối tượng nghiên cứu 03

1.4 Phương pháp nghiên cứu 04

1.4.1 Phương pháp luận 04

1.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 04

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 05

Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu 2.1 Tổng quan về probiotic 06

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về probiotic 06

2.1.1.1 Giới thiệu chung 06

2.1.1.2 Hiệu quả sử dụng probiotic 08

2.1.1.3 Các thành phần của probiotic 11

2.1.1.4 Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic 11

2.1.2 Qui trình chọn lọc các chủng probiotic 16

2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic 19

2.1.3.1 Khả năng bám dính (Adhesion assay) 19

2.1.3.2 Khả năng chịu acid dạ dày 20

2.1.3.3 Khả năng chịu được muối mật 21

2.1.3.4 Khả năng kháng vi sinh vật 21

2.1.3.5 Thử nghiệm In vivo 25

2.1.4 Ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 25

2.1.4.1 Trong chăn nuôi gia cầm 27

2.1.4.2 Trong chăn nuôi gia súc 28

2.2 Vi khuẩn lên men lactic 30

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn 30

2.2.2 Quá trình lên men lactic 33

2.2.3 Khả năng tổng hợp các enzyme tiêu hóa 35

2.2.4 Khả năng tổng hợp Vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng của vật chủ 36

2.2.5 Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn 36

2.2.5.1 Bacteriocin 36

2.2.5.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác 40

2.3 Vi sinh vật chỉ thị 41

2.3.1 Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị (indicator strains) 41

2.3.2 Vi sinh vật chỉ thị gây bệnh đường ruột – Escherichia coli 43

2.3.2.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa 43

2.3.2.2 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố 45

2.3.2.3 Một số bênh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc gia cầm 45

Chương 3: Vật Liệu & Phương Pháp Nghiên Cứu 3.1 Vật liệu 50

3.1.1 Địa điểm thực hiện đồ án 50

3.1.2 Giống vi sinh vật 50

3.1.3 Môi trường và hóa chất sử dụng 52

3.1.3.1 Môi trường 52

3.1.3.2 Hóa chất 53

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị 53

3.1.4.1 Dụng cụ 53

3.1.4.2 Thiết bị 54

3.2 Phương pháp nghiên cứu 54

3.2.1 Chuẩn bị giống vi sinh vật 54

3.2.2 Chuẩn bị môi trường test 55

3.2.3 Bố trí thí nghiệm 56

3.2.3.1 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn (khuếch tán trên bề mặt thạch) 56

3.2.3.2 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch) 57

3.2.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc diffusion assay (Khuếch tán qua vòng giấy lọc) 58

3.2.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Welldiffusion assay (khuếch tán qua giếng thạch) 593.2.3.5 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương phápTurbidometric assay (đo độ đục) 60

Chương 4: Kết Quả Và Biện Luận

4.1 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn(khuếch tán trên bề mặt thạch) 634.2 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test(khuếch tán trên bề mặt thạch) 644.3 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc diffusionassay (Khuếch tán qua vòng giấy lọc) 664.4 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Well diffusionassay (khuếch tán qua giếng thạch) 684.5 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Turbidometricassay (đo độ đục) 74

Chương 5: Kết Luận Và Kiến Nghị

5.1 Kết luận 805.2 Kiến nghị 81

Phụ Lục

Tài Liệu Tham Khảo

DANH MỤC KÍ HIỆU & VIẾT TẮT

LAB: Vi khuẩn lên men lactic

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn probiotic 07

Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic 09

Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là Probiotics 11

Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng 12

Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật 22

Bảng 2.6: Một số đặc điểm của các chi vi khuẩn lactic 32

Bảng 2.7: Một số Bacteriocin và đặc điểm của chúng 39

Bảng 2.8: Kiểu hoạt động đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng 41

Bảng 2.9: Một số vi sinh vật chỉ thị điển hình sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc probiotic 42

Bảng 3.1: Các chủng được kiểm tra hoạt tính probiotic 50

Bảng 4.1: Đường kính vịng khng khuẩn đo đường bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) 72

Bảng 4.2: Tỉ lệ sống sót của E coli sau khi ủ với dịch nuôi cấy LAB ly tâm 76

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu 04

Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn probiobic 17

Hình 2.2: Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic 18

Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật 19

Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác động đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh 20

Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của probiotic 22

Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật 24

Hình 2.7: Vi khuẩn lên men lactic trong hệ thống phân loại 31

Hình 2.8: Quá trình lên men lactic của LAB (A): Lên men lactic đồng hình (B): Lên men lactic dị hình 34

Hình 2.9: Cơ chế kháng khuẩn của một số loại Bacteriocin 39

Hình 2.10:Giới thiệu về hình thái Escherichia coli 45

Hình 2.11:Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà 46

Hình 2.12:Anh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con 48

Hình 2.13:Anh hưởng của bệnh phù thủng trên heo cai sữa 49

Hình 4.1: Thử nghiệm không thành công phương pháp Agar spot test 65

Hình 4.2: Thử nghiệm không thành công phương pháp Disc diffusion assay 67

Hình 4.3: So sánh kết quả C1 ở hai đĩa môi trường với độ dày và nồng độ vi khuẩn chỉ thị khác nhau 69

Hình 4.4: Vòng kháng của những chủng điển hình 70

Hình 4.5: Kết quả kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp đo đô đục 75

DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1:Tỉ lệ ức chế tăng trưởng E coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm không trung hòa và sau khi trung hòa 77

th 4.2: Đồ thị 4.2: ị 4.2: S t ng quan gi a ph ng pháp đo đ đ c (turbidimetric assayự tương quan giữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay ương quan giữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay ữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay ương quan giữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay ộ đục (turbidimetric assay ục (turbidimetric assay method) và ph ng pháp khu ch tán qua gi ng th ch (well diffusion assay)ương quan giữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay ếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) ếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) ạch (well diffusion assay) 79

Chương 1: Mở Đầu

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay công nghệ sinh học là một lĩnh vực đang phát triển và có nhiều tiềmnăng lớn Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển công nghệ sinh học,đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong công nghiệp

Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học Nóđang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà

nó thể hiện Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuần là làm thức ăn ngonhơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩymạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose;cải thiện chức năng miễn dịch; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngănchăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩngây hại; tăng trọng nhanh…

Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đang chiếmthế thượng phong so với một số phương cách khác Vì tính hiệu quả của probiotic (tínhtrị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại trong sinhvật chủ Mà với sự khắt khe của con người thì điều này là số một

Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất kháng sinhtrong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó mang lại như:

 Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

 Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóngvới sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn

 Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làmcho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh)

 Phòng các bệnh mãn tính và ngăn chặn xẩy ra những dịch bệnh do vitrùng

 Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

Tuy nhiên, thế giới đã nhanh chóng nhận ra những tác động xấu do việc làm nàymang lại Sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng không đúng cáchtrong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất kích thích sinhtrưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tăng hiện tượng kháng khángsinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi Có ý kiến cho rằng, việc sửdụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đã biến vật nuôi thành nơi để một số loài vikhuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tác dụng của các loại kháng sinh Hậu quả của sự khángkháng sinh ở vi khuẩn về kinh tế rất lớn Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế khôngphải là chính yếu mà vấn đề đáng lo ngại là không chỉ vật nuôi mà ngay cả loài ngườiđang đứng trước hiểm hoạ xẩy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốcgây ra mà không thể kiểm soát được

Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotic vào cuộc sống là một côngviệc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa Có như vậy mới tiếp tục hoàn thiệnprobiotic đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày được cao hơn, an toànhơn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta Có thể nói đây là sự tácđộng thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở ra một chiến lược phát triển bềnvững và an toàn

Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng caocủa con người Trên phương trình tăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chấtlượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản thân họ.

Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học phát triển “Probiotic” là một phần của sự phát triển ấy

Để có thể có một chế phẩm probiotic có đầy đủ những hoạt tính cần thiết, khâuchọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic là cực kì quan trọng Bởi vì ngay tại khâu này

sẽ quyết định vai trò và tác dụng của chế phẩm lên đối tượng cần quan tâm Tuy nhiên,trong phạm vi nhỏ hẹp của nghiên cứu này, tôi chỉ thực hiện đề tài ở bước kiểm trahoạt tính kháng vi sinh vật vì thời gian thực hiện đề tài chỉ trong 12 tuần không chophép tôi thực hiện hoàn chỉnh tất cả các tiêu chí tuyển chọn Probiotic Chính vì thế tôi

đã chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT

TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN

CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vikhuẩn lên men lactic

Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic

1.3 Đối tượng nghiên cứu

Vì thời gian hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung ở những đối tượng sau :

- Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối, dưa muối,nem, sữa lên men) và có nguồn gốc từ các chế phẩm dược

- Vi sinh vật chỉ thị Escherichia coli.

1.4 Phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp luận

Trước khi bắt tay vào thực hiện đề tài này, tôi đã tham khảo khá nhiều các nghiêncứu từ trước tới nay về probiotic cũng như các phương pháp tuyển chọn nó Nhận thấy

có khá nhiều phương pháp được sử dụng để thực hiện việc chọn lọc này, tôi đã xem xét

và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tài của mình

Tôi xin đề xuất sơ đồ tiến hành nghiên cứu như sau:

Tổng hợp biên tập tài liệu

Phân tích các nghiên cứu liên quan

Tiến hành thử nghiệm các phương pháp Trao đổi ý kiến với giáo viên hướng dẫn

Phân tích ưu điểm – khuyết điểm của các phương pháp

Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành chọn lọc probiotic

Đưa ra kết quả nghiên cứu

Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu

1.4.2 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn

Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình, độ lệchchuẩn, vè đồ thị tương quan

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Tìm hiểu về các phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị của các

vi khuẩn lên men lactic

Tạo tiền đề cho các nghiên cứu liên quan sau này tại phòng thí nghiệm

Góp phần chọn lọc được chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic

Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu

2.1 Tổng quan về Probiotics

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về probiotic

2.1.1.1. Giới thiệu chung

Việc sử dụng các vi khuẩn lactic như thức ăn bổ sung đã xuất hiện từ lâu khi conngười biết đến sữa lên men Việt nghiên cứu được bắt đầu từ Metchnikoff làm việc ởviện Pasteur Paris Ông ta cho rằng vi sinh vật trong ruột có ảnh hưởng xấu tới sức

khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này có thể được cải thiện bởi việc sử dụn sữachua Ông đã trích dẫn các quan sát về nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữachua và có tuổi thọ rất cao Ông phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là

“Bulgarian bacillus” và sử dụng chúng trong các thử nghiệm Những sinh vật này được xác định và được biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L.

delbrueckii subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và

sản xuất yoghurt Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu này

chuyển về USA Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng các L.

acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này 34

Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa khác nhau, nó được sử dụng lần đầutiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi một protozoan đểkích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác Đến năm 1974, Parker đã sử dụng đểchỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật và chất có tác động tích cực lênđộng vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gầnvới hiện nay là “ một bổ sung vi sinh vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên kýchủ bằng cách cải thiện cân bằng vi sinh vật đường ruột” 33

Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn probiotic (T

Mattila-Sandholm, M Saarela, Probiotic functional foods)

France,Belgium,Spain,Switzerland,Portugal, Italy,Germany, UK

Fermented

milk drink Yakult Yakult L casei Shirota strain

Nertherlands,

UK, GermanyCultures

yoghurt-style

product

Yoghurt

ActimelCholesterolControl

milk drink

Yoghurt Yoplait Waterford

2.1.1.2. Hiệu quả sử dụng probiotic

Đã có rất nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi được đăng kí

bảo hộ sáng chế Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobacillus spp hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii, hay Bacillus subtilis.

Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sựđiều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụngđược biết tới như sau: 2, [3], 5, 25, 32, 33

 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến

 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa

 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp lactose

 Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh

 Kích thích hệ thống miễn dịch

 Giảm nhiễm trùng đường niệu

 Tăng trọng (5%) ở gia cầm

 Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm

 Giảm tiêu chảy ở dộng vật non

 Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh

Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảng dướiđây:

Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15]

Lactibacillus rhamnosus GG

(ATCC 53103) Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy dokháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng

rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu

chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích

miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không

điển hình ở trẻ em

Lactobacillus johnsonii

(acidophilus) LJ-1 (La1)

Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường

miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori

Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy do

virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vậtđường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kíchthích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm dakhông điển hình ở trẻ em

Lactobacillus reuteri (BioGaia

Biologics)

Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ

em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn vàdung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIVdương tính

Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt

tính enzyme phân, có tác động tích cực đối vớiung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung,không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của ngườikhỏe mạnh

Lactobacillus plantarum

DSM9843 (299v)

Cân bằng hệ bi sinh vật đường ruột, tăng hàmlượng acid béo mạch ngắn trong phân

Saccharomyces boulardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm

ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu

chảy ở bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ốngChủng trong sữa chua

Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh vậtđường ruột này Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn đã thúcđẩy tăng trưởng của vật nuôi Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh hưởng tới việctăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột này và cách thức

mà nó tác động lên vật chủ Thứ hai, càng ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh, cungcấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong đường ruột bởi những vật chủ có

sẵn Và cuối cùng cho thấy rằng L acidophilus không là vi khuẩn lactobacillus duy

nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng làmprobiotics Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 1014 vi sinh vật thuộckhoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vìvậy việc nghiên cứu về những sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được

mở rộng [30]

Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật có thể sửdụng làm probiotic Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo

2.1.1.3. Các thành phần của Probiotics

Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al 2001) [5]

Lactobacillus Bifidobacteriu Other lactic acid Non-lactic acid

Bacillus cereus var Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii

2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34]

Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn như:

 Tiêu chuẩn về an toàn

 Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng

Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành cho probiotic,

ta có thể tổng kết lại như sau:

 Khía c nh an toàn c a probiotic bao g m nh ng i m c th ạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể ủa probiotic bao gồm những điểm cụ thể ồm những điểm cụ thể ững điểm cụ thể điểm cụ thể ểm cụ thể ụ thể ểm cụ thể sau:

 Có định danh chính xác

 Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người

 Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh

 Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh

 Không liên quan tới bệnh tật

 Không gây khử liên hợp muối mật

 Đặc điểm di truyền ổn định

 Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được

Tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu Có một sốphương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như: nghiên cứu trêncác đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotic,

nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ Các probiotic thường thuộcnhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe)

Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15]

Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các bệnhnhân suy giảm miễn dịch (AIDS)

Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S thermophilus được sử dụng trong cácsản phẩm sữaEnterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng kháng

sinh

Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics

Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người

Propionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotic

Saccheromyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở ngườiPhần lớn những vi sinh vật sử dụng làm probiotic cho người đều phải đạt nhữngyêu cầu khắc khe như đã nêu trên Còn đối với vật nuôi ta có thể nới lỏng những yêucầu này, tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng của nó

 Trước khi một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng thường phải có những đặc điểm sau: [2], [4], [23]

 Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để cóthể đưa vào sản xuất dễ nuôi cấy

 Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm

 Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm

 Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng Để tồn tạiđược nó phải có đặc tính sau:

Có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị củangười

Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng đểprobiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non)

 Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ

 Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ cóthể sử dụng

 Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm

 Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối khángvới các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột

 Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin, hydrogenperoxide, acid hữu cơ)

 Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.

Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụng làmprobiotic

Khả năng bám dính sẽ tạo nên một mối tương tác giữa probiotic và bề mặt niêmmạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho, điều này sẽ kích thích tính miễn dịch tại chỗ vàtoàn bộ cơ thể Do đó người ta cho rằng chỉ có những chủng probiotic có khả năng bámdính mới tạo được hiệu quả cảm ứng miễn dịch và làm ổn định hàng rào bảo vệ niêmmạc ruột

Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn kết vào biểu môruột, giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic Qua một số thử nghiệm, đều cho thấy

Lactobacillus acidophilus còn sống hay đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự

bám dính của các vi khuẩn gây bệnh

Trong thử nghiệm về khả năng bám dính của probiotic người ta thường kiểm tratrên những dòng tế bào ung thư trực tràng như HT-29 và Caco-2 Hai dòng tế bào nàyđược biệt hóa thành tế bào ruột, được sử dụng như là một mô hình cho biểu mô ruộtnon Những thử nghiệm này cho ta biết được sự khác biệt về khả năng bám dính củanhững chủng probiotic khác nhau

Ngoài sử dụng hai dòng tế bào trên, người ta còn có thể nghiên cứu bằng kỹ thuậtsinh thiết, bằng cách sinh thiết một mẫu mô sau một thời gian sử dụng probiotic Kỹthuật này được xem là cho kết quả chính xác nhất về khả năng bám dính của probiotic.Tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều hạn chế trong vấn đề về đạo đức của việc lấy mô, đòi hỏingười thực hiện có chuyên môn cao, và có thể mắc sai số

 Khả năng điều hòa miễn dịch [1], [2]

Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotic có thể được trình bày theo 3 cách sau:

1 Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sv hayhạt carbon

2 Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và interferon (nhân

tố kháng virus không đặc hiệu)

3 Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột, thường là IgA

 Khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh [2], [5]

Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng

đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra cáckháng sinh hay là những chất cạnh tranh

Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng mà ức chế cả vi khuẩn Gram dương vàGram âm Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm

bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo racác độc tố

Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở cácchủng probiotic là:

 Khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư [2], [5], [18]

Trong nhiều năm qua, có những nghiên cứu cho thấy vi sinh vật trong thực phẩmhay trong hệ sinh thái ruột có khả năng chống đột biến và chống lại các yếu tố gây ungthư Cơ ché này được nghiên cứu và kết luận như sau:

Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư

Sản xuất các hợp chất kháng ung thư

Điều hòa những enzyme tiền chất gây ung thư ruột, như các enzyme phân(nitroreductase, -glucuronidase ) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thánhchất gây ung thư trong trực tràng

Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch

Những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay in vivo, việc mở rộng

ra trên người để dự phòng ung thư còn đang là vấn đề còn nhiều tranh cãi

Trên người: pha 1

Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu nhiên

Tên chi, loài, ký hiệu chủng

Số lượng tối thiểu vi khuẩn sốngĐiều kiện bảo quản thích hợpThông tin liên hệ với khách hàng

PROBIOTIC

Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người

So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng

probiotic với phương pháp điều trị thông thường

Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn Probiobic

Hình 2.2 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic

Phân lập các dòng

vi khuẩn

Sàng lọc in vitro

Sàng lọc in vivo quy mô nhỏ

Kiểm tra khả năng gây bệnh đối với vật chủ

Không đạt

OK

? Đạt

Đạt

Thử nghiệm in vivo quy mô pilot

2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật

Probiotics

Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotics đều dự trên cơ sở

sự ức chế tăng trường vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, được khái quát nhưsau:

Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vậtCác chỉ tiêu và phương pháp trên sẽ được giới thiệu kĩ hơn ở phần tiếp theo

2.1.3.1 Khả năng bám dính (Adhesion assay) [9], [24], [41]

Nguyên tắc: dựa trên mối quan hệ tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm mạcruột là nơi chứa các tế bào lympho Ngoài ra sự bám dính của probiotic tạo nên khảnăng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô ruột giữavi khuẩn gây bệnh và probiotic

Tế bào Caco2 ở nội tạng thường được sử dụng trong nghiên cứu in vitro dựa trên

hệ thống tế bào bám dính của Lactobacilli không gêy bệnh Chuỗi tế bào này được sử

dụng để kiểm tra hện thống tế bào bám dính và sự xâm nhập của các vi sinh vật chỉ thị

Tế bào Caco2 được nuôi cấy tăng sinh khối tế bào trong Eagle’s minimumessential medium (MEM) Hỗn hợp chứa vi khuẩn khoảng 108tb/ml và 240µl MEMđược sử dụng để ủ với tế bào Caco2 Sau khi nuôi ủ, sinh khối tế bào được nhuộm với

dung dịch màu Giema Lúc này quan sát được các tế bào Lactobacilli bám chặt trên tế

bào Caco2 dưới kính hiển vi độ phòng đại 100

Probiotics

Sự bám

dính

Chịu acid dạ dày

Kháng

vi sinh vật

Chịu được muối mật

Thử nghiệm

in vivo

Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác động đối

kháng với các vi khuẩn gây bệnh [47]

2.1.3.2 Khả năng chịu acid dạ dày [24], [41]

Nguyên tắc: pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như oxalicacid, butylic acid, folic acid Chính vì vậy các vi khuẩn probiotic cần phải chịu đượcđiều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày và ruột thì mới có thểphát huy được tác dụng probiotic của mình

Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotic trên môitrường MRS với điều kiện pH là 2.5 và đối chứng trên MRS thông thường Sau đó quansát mật độ vi sinh vật ở bước sóng 600nm Tiếp tục so sánh sự sống sót dưới điều kiệnnày ở các mốc thời gian, từ 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 24h

2.1.3.3 Khả năng chịu được muối mật [24], [41]

Có loại muối mật: glycochalat Natri và Taruocholat Natri Muối mật có chứcnăng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thucác vi ta min tan trong lipid như A, D, E, K Khi xuống đến hồi tràng, 95% muốimật được tái hấp thu rồi theo theo tính mạch của trở về gan và được tái bài tiết, gọi

là chu trình ruột gan Còn lại 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữnước trong phân và duy trì nhu động ruột già Chính vì khả năng này mà khả năngchịu được muối mật cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotic, đòi

hỏi các vi khuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trongruột.

Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp, cũngdùng môi trường MRS có bổ sung 0.3% muối mật và đối chứng trên MRS thôngthường Sau đó so sánh mật độ tế bào vi khuẩn ở bước sóng 600µnm

2.1.3.4 Khả năng kháng vi sinh vật

Điển hình về nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của probiotic đó chính lànghiên cứu của Schillinger và Lucke [28] Sau này phát triển thêm nhiều nghiên cứumới, tuy nhiên tất cả những nghiên cứu từ trước tới giờ đều dựa trên khả năng sinhkháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gâybệnh

Hình 2.5 sẽ cho thấy sơ đồ khái quát hóa về các phương pháp đánh giá hoạt tínhkháng vi vinh vật dựa trên dạng vật liệu khác nhau

Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá hoạt

tính kháng vi sinh vật của probiotic

Sau đây là giới thiệu chi tiết hơn về các phương pháp giới thiệu tại bảng 2.5

Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật Phương pháp Nguyên tắc sử dụng Cách thực hiện

Trong môi trường lỏng(1) Cho dịch lytâm môi trường(2) nuôi cấy LAB vào môitrường phát triển của vi khuẩn chỉ thị Sau21h đo OD ở bước sóng 600nm, so sánh %với ống đối chứng không sử dụng dịch lytâm trên

Như trên Trên môi trường agar(3) Thấm giấy vào

dịch ly tâm môi trường (2) nuôi cấy LAB.Đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường agar

đã trải vi khuẩn chỉ thị trước đó Ủ quađêm, kiểm tra vùng kháng khuẩn

well diffusion assay

Spot

on lawn

Disc diffusion assay

Agar

spot test

Dùng sản phẩm thô

(dịch nuôi cấy) Sản phẩm đã qua tinh chế (dịch nuôi cấy ly

tâm loại bỏ tế bào)

Trên môi trường agar (4) Nhỏ dịch chứa

tế bào LAB, cố định bằng 1 giọt môitrường (5) Đổ hỗn hợp vi khuẩn chỉ thịvới 7ml môi trường (5) lên, để đông, đượchai mặt kẹp của hai môi trường (4) và (5)

Ủ qua đêm, kiểm tra vùng kháng khuẩn.Agar spot test

Trên môi trường agar (3) Trải vi khuẩnchỉ thị, nhỏ giọt môi trường (2) nuôi cấyLAB Ủ qua đêm, kiểm tra vùng khángkhuẩn

Giải thích thêm:

Kiểm tra vùng kháng khuẩn là đo vòng trong suốt không có sự phát triển của vikhuẩn chỉ thị

Disc diffusion assay Spot on lawnHình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật [19]

2.1.3.5. Thử nghiệm in vivo [10], [41]

Đây là khâu quan trọng trong quá trình hình thành nên một chế phẩm Probiotic

Vì nó thể hiện được tính an toàn của sản phẩm cũng như là vấn đề về đạo đức Một chếphẩm probiotic trước khi trở thành thành phẩm để sản xuất và tiêu thụ, phải trải qua

công đoạn thử nghiệm in vivo nhằm kiểm tra ảnh hưởng của chế phẩm lên cơ thể tiếp

nhận Tức là kiểm tra độc tính hay những biến đổi xấu lên cơ thể tiếp nhận khi sử dụng

chế phẩm này Qui trình kiểm tra này có thể bắt đầu với thử nghiệm in vivo trên chuột

hoặc thỏ, sau đó mới được thử nghiệm trực tiếp trên cơ thể tiếp nhận như gia súc giacầm với chế phẩm trong chăn nuôi Đặc biệt nếu là chế phẩm dành cho người thì việcthử nghiệm càng phải gắt gao và đòi hỏi tính chính xác, tính an toàn cao

2.1.4 Ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi [1], [3]

Phương pháp chăn nuôi hiện đại trong đó bao gồm các điều kiện và chế độ ăn gây

ra stress và có thể gây ra những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật mà làmcho vật nuôi giảm sự đề kháng đối với bệnh tật

Probiotic được bổ sung vào thức ăn để tăng cường tốc độ tăng trưởng của vậtnuôi và cải thiện sức khỏe của chúng bằng cách tăng sự đề kháng Mục đích củaphương pháp tiếp cận probiotic là để cân bằng lại hệ vi sinh vật và phục hồi sức đềkháng của động vật Sự điều trị như vậy không đưa bất cứ hóa chất vào bên trong cơ thểđộng vật Giảm nguy cơ nhiễm bệnh và không đưa hóa chất độc hại vào trong chuỗithức ăn

Nó được giả định rằng probiotic đã tác dụng đến cả vùng dạ dày và tác dụng lênbệnh tiêu chảy và các bệnh nhiễm trùng khác Tuy nhiên, gần đây có những nghiên cứutại một số quốc gia khác nhau đã chỉ ra rằng các tác động này có thể được tổng quáthơn Các kết quả thu được đã chứng tỏ rằng một số vi khuẩn được sử dụng trongprobiotic (lactobacilli) có khả năng kích thích hệ miễn dịch Điều này được đặt ra hoàntoàn mới đối với những ảnh hưởng của probiotics đã biết, trong đó nó có thể tác độngtới tình hình bệnh dịch về đường ruột, cũng như phòng chống các bệnh về đường ruột

Probiotic hiện nay đã thay thế các hóa chất tăng trưởng vẫn thường quảng bá chocác nông trại chăn nuôi và sự yêu cầu tăng khả năng kháng bệnh cũng được thực hiện.Yêu cầu về lợi ích mà probiotic mang lại trong chăn nuôi gia súc như sau:

 Tăng trưởng nhanh

 Nâng cao khả năng sinh sản

 Nâng cao sức đề kháng bệnh tật

 Nâng cao năng suất và chất lượng sữa

 Nâng cao sản xuất trứng

Probiotic không phải là một thực thể đơn lẻ, những chế phẩm probiotic khác nhauchứa đựng hệ vi sinh vật khác nhau thì có tác động khác nhau Ngay cả những chủngkhác nhau của cùng một loài có thể có hoạt động trao đổi chất khác nhau sẽ ảnh hưởngđến kết quả khi chúng được sử dụng như probiotic Kết quả tiêu cực có thể được giảithích ở những vật nuôi có sức đề kháng yếu hay do giai đoạn tăng trưởng của vật nuôi,liều lượng sử dụng, các điều kiện vệ sinh chuồng trại

Với những điều ngạc nhiên mang lại, cũng như những kết quả chưa như mongmuốn của probiotic, nhưng thực tế là những kết quả đạt được rất có ý nghĩa, bằng cách

sử dụng probiotic hợp lý, theo đúng các điều kiện và sử dụng đúng phương pháp sẽmang lại nhiều lợi ích cho việc bổ sung nguồn dinh dưỡng trong chăn nuôi

2.1.4.1. Trong chăn nuôi gia cầm [4]

Trong quá trình cải tiến di truyền, năng suất của gà thịt đã được cải thiện đáng kể.Khi mà điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, việc tăng mật độ nuôi và lúc đó thìthách thức bệnh tật gia tăng gây cho gia cầm dễ nhiễm các loại nguồn bệnh khác nhau,

đặc biệt là vi khuẩn đường ruột như E.coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens và

Campylobacter spp…

Sự nhạy cảm với mầm bệnh dẫn đến việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởngchống vi khuẩn – các chất vốn căn bản được sử dụng để tăng sức khoẻ cho đường ruột

và kiểm soát các kích thích phụ lâm sàng

Với ý thức ngày càng tăng của xã hội về sự kháng thuốc của vi khuẩn, thì việc sửdụng kháng sinh trong các liều thuốc chữa bệnh hoặc phòng bệnh cho gia cầm đã đượchạn chế một cách nghiêm ngặt thậm chí bị loại bỏ hẳn ở rất nhiều quốc gia

Từ lâu đã có nhiều quan tâm đến việc tìm ra một loại chất để thay thế kháng sinhtrong chăn nuôi gia cầm Vi khuẩn sống trong ống tiêu hóa của gia cầm có ảnh hưởngsâu sắc đến một vài quá trình sinh lý của vật chủ (gia cầm) Với suy nghĩ đó, điều quantrọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi khuẩn đường ruột gia cầm nhằm tìm ra các chất thaythế thuốc kháng sinh Trong bối cảnh bình thường, thì trong đường ruột có một sự cânbằng tinh tế giữa các vi khuẩn có lợi và gây bệnh Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác

và quan hệ cộng sinh và cạnh tranh Cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máytiêu hoá mà còn tăng khả năng sản xuất trong động vật chủ

Sử dụng Probiotic và Prebiotic là hai phương pháp đã được nghiên cứu và có tiềmnăng giảm bớt nguồn dịch bệnh đối với chăn nuôi gia cầm và đồng thời nâng cao năngsuất của chúng Các chất này mới được đề nghị dùng để hỗ trợ bảo vệ nhiễm bệnh của

thịt và cải tiến phản ứng miễn dịch cho gà ( Theo Huang và cộng tác viên - 2004) Thựcphẩm Probiotics và Prebiotics vào thức ăn không còn là những phương pháp mới, màthực tế, chúng đã được sử dụng trong hàng thế kỷ như là một thành phần tự nhiên củathức ăn hoặc như thức ăn lên men, thí dụ như sữa chua (yoghurt).

Bệnh đường ruột có ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi gia cầm Chúng làm giảmnăng suất, tăng tỷ lệ chết và cũng là nguồn nhiễm tiềm năng cho các sản phẩm gia cầm,

và gây nên mất an toàn thực phẩm cho con người Việc sử dụng các thuốc kháng sinhtrong thức ăn gia cầm đã được giảm bớt do vấn đề kháng kháng thuốc của vi khuẩn.Các chất thay thế cho kháng sinh trong dinh dưỡng gia cầm cần được đánh giá nghiêmtúc trên thực địa Probiotics và Prebiotics là các “thí sinh” thay thế khả quan

2.1.4.2. Trong chăn nuôi gia súc [4]

Gần đây, nhiều báo cáo nghiên cứu chứng minh hiệu quả rõ ràng của probiotictrên heo, bao gồm:

- Lactobacillus spp và Bifidobacteria spp làm tăng trọng lượng và giảm tỉ lệ chết

non

Lactobacillus casei cải thiện tăng trưởng của heo con và giảm bệnh tiêu chảy, tác dụng

của nó hiệu quả hơn so với việc dùng kháng sinh liều thấp

- Enteracide, một probiotic chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus

faecium thêm vào thức ăn cho heo con cai sữa kích thích sự tăng trưởng và hoạt động

của hệ thống tiêu hóa Sự thêm Streptococcus faecium vào khẩu phần ăn cho heo con

làm tăng trọng lượng và tăng hiệu quả thức ăn

- Hỗn hợp Lactobacillus spp và Streptococcus spp tăng sự sinh trưởng và chức

năng miễn dịch ở heo con

- Bột tế bào vi khuẩn tiêu hóa từ Brevibacterium lactofermentum giảm sự tác động

và sự nguy hiểm của bệnh tiêu chảy ở heo con

- Heo con ăn Bacillus coagulans có tỉ lệ chết giảm và cải thiện việc tăng trọng

lượng, sự chuyển hóa thức ăn tốt hơn heo con không có ăn bổ sung cũng như so với heodùng kháng sinh liều thấp

- Bacillus licheniformis cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh

tiêu chảy, tỉ lệ chết non

- Biomate 2B plus (B.licheniformis và B subtilis) tăng hiệu quả thức ăn và tăng

trưởng của heo con hơn dùng kháng sinh

- Heo con ăn probiotic Bacillus toyoi hoặc hỗn hợp Saccharomyces cerevisae,

Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium làm tăng trọng lượng đáng kể so

với việc dùng kháng sinh

- Heo con ăn thức ăn bổ sung nấm men (Saccharomyces cerevisae) có khuynh

hướng tiêu thụ nhiều thức ăn và tăng trọng hơn

- Enterococcus faecium 18C23 ngăn chặn sự bám dính của E.coli tạo độc tố đường

ruột vào lớp màng nhầy ruột non của heo

Ngoài việc trị bệnh ở heo con, còn có một số nghiên cứu cho thấy các lactobacilli

cũng có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở trâu

bò Theo Trovatelli và Matteuzzi (1976) do quá trình biến đổi của trâu bò ( do mật độquá đông, sự sợ hãi, thiếu thức ăn, sự di chuyển quá mức) và trong nguồn thức ăn thiếucác vi khuẩn có lợi nên sức đề kháng của trâu bò bị suy giảm Đo đó, người ta thườngcung cấp thức ăn dạng lên men để tạo môi trường mới trong ruột vật nuôi nhằm miễnnhiễm với vi sinh vật gây bệnh, đồng thời giúp tăng trọng và tăng khả năng chuyển hóathức ăn

Fastrack, một sản phẩm dùng cho động vật nhai lại, chứa Lactobacillus acidophilus

và Streptococcus faecium, tạo ra acid lactic, nấm men giúp bổ sung vitamin B và những

enzyme tiêu hóa Ở bê, Fastrack cải thiện tăng trọng, giảm bệnh tiêu chảy và những xáotrộn tiêu hóa khác; tăng sản lượng sữa và sự thèm ăn ở bò; tăng lượng thức ăn ở cừu vàdê

2.2 Vi khuẩn lên men lactic

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn [1], [8], [22], [29], [37]

Đầu tiên xin giới thiệu vị trí của vi khuẩn lactic trong hệ thống phn loại:

Vi khuẩn lactic thuộc lãnh giới vi khuẩn, ngành Firmicutes, Cùng vớingành Actinobacteria, chúng tạo thành nhóm các vi khuẩn Gram dương Tuynhiên so sánh về tỉ lệ base G+C thì ngành Firmicutes có tỉ lệ thấp trái vớiActinobacteria có tỉ lệ G + C cao Các chi (giống) chủ yếu của vi khuẩn lactic là

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc và Lactobacillus Ngoài ra chúng còn

có các chi khác như Carnobacterium, Aerococcus, Enterococcus, Vagococcus, Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, và Weissella Ngoài ra Bifidobacterium

trước kia được phân loại thuộc chi Lactobacillus (Lactobacillus bifidum) nay tách ra thành chi Bifidobacterium Chúng có nhiều đặc điểm riêng biệt mặc dù có ứng dụng làm probiotics giống chi Lactobacillus và một số Enterococcus, Lactococcus

Các vi khuẩn lactic thường được ứng dụng làm probiotics đó là Lactobacillus

acidophilus, L plantarum, L casei, L casei rhamnosus, L delbrueckii bulgaricus, L fermentum, L reuteri, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Bifidobacterium bifidum, B infantis, B adolecentis, B longum, B breve, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium

Hình 2.7: Vi khuẩn lên men lactic trong hệ thống phân loại

Bảng 2.6: Một số đặc điểm của các chi vi khuẩn lactic [37]

Vì phạm vi đồ án cịn hạn chế nên chỉ thực hiện nghiên cứu trong phạm vi các vi

khuẩn thuộc chi Lactobacillus Sau đây là đặt điểm chung của chi Lactobacillus:

Tế bào hình que, thường cĩ nhiều dạng: dài, mảnh và ngắn (dạng trực cầu khuẩncoccobacilli) Kích thước tế bào 0.5 – 1.2 x 1.0 – 10.0 µm Trong quá trình sinh trưởng,

tế bào thường tạo thành chuỗi ở phase log Khơng di động, di động khi cĩ sự hiện diệncủa tiên mao Khơng tạo bào tử, ở dạng gram dương khi tế bào cịn non, và gram âmkhi tế bào già

Hình dạng khuẩn lạc trên thạch: dạng lồi, mép trịn, màu trắng đục, thường cĩđường kính 2-5 mm Ít tạo sắc tố, cĩ thể tạo sắc tố vàng, cam hay màu gỉ sắt và màu đỏgạch

Kị khí tùy nghi đơi khi hiếu khí Phát triển mạnh trên mơi trường thạch, kị khí cĩ5-10% CO2, catalase, cytochrome và benzidine âm tính

Sản phẩm của quá trình chuyển hĩa carbohydrate hơn 50% là lactate, cịn lại làacetate, formate, succinate, CO2 , ethanol Khơng tạo acid dễ bay hơi cĩ số nguyên tửcarbon hơn hai Khả năng khử nitrate kém và tạo pH dưỡi 6.0 khơng hĩa lỏng gelatin.Khơng phân hủy casein nhưng vài chủng cĩ thể tạo một lượng nhỏ đạm hịa tan Khơngtạo indole và H2S

Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp: amino acid, peptide, các dẫn xuất acid nucleic,vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồn carbonhydrate và đặc trưng theo lồi Nhiệt độ phát triển 5-530C, nhiệt độ tối ưu 30-400C

Cĩ thể phát triển tốt ở pH khoảng 5 và pH tối ưu là 5.5-5.8

Được tìm thấy trong các sản phẩm sữa, hạt, sản phẩm thịt, nước giải khát, bia,rượu, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua, trong nước thải, trong hệ tiêu hĩa người vànhiều lồi động vật Là những sinh vật ít gây bệnh, cĩ tác dụng tốt với đường tiêu hĩa

2.2.2 Quá trình lên men lactic [1], [37]

 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình

Lên men acid lactic đồng hình lượng acid lactic tạo nên chiếm trên 80% và đượcbiểu diễn tĩm tắt bằng phương trình:

C6H12O6  2CH3-CHOH-COOH

Sự hình thành nên acid lactic trải qua hàng hoạt các giai đoạn trung gian với sựtham gia của các enzyme tương ứng Giai đoạn đầu xảy ra quá trình hoạt hĩa hexoseđược phân cắt để hình thành triosephotphate Chất này được chuyển thành acid pryruvicrồi thành acid lactic

 Vi khuẩn lên men lactic dị hình

Trong lên men lactic dị hình, tạo sản phẩm đa dạng ngoài acid lactic còn có hàngloạt sản phẩm phụ khác, các sản phẩm phụ và acid lactic được sinh ra với số lượngphân tử gam như nhau Cụ thể là: acid lactic 40%, acid succinic và rượu etylic 20%,acid acetic 10% và các chất khí còn lại 20%.

Sự đa dạng của sản phẩm tạo thành khi lên men lactic dị hình vì vi khuẩn thuộcnhóm này có nhiều hệ enzyme nên quá trình chuyển hóa đường phức tạp hơn ở vikhuẩn lactic đồng hình

 Khi nồng độ của acid lactic đạt 2-3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh khác, kể cả E.Coli.

Hình 2.8: Quá trình lên men lactic của LAB (A): Lên men lactic đồng hình (B):

Lên men lactic dị hình [37]

Các enzyme trong quá trình: 1 Glucokinase; 2 Fructose-1,6-dịposphate aldolase;

3 Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 Pyruvate kinase; 5 Lactatedehydrogenase; 6 Glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7 6-phosphogluconatedehydrogenase; 8 Phophoketolase; 9 Acetaldhyde dehydrogenase; 10 Alcoholdehydrogennase

2.2.3 Khả năng tổng hợp enzyme

Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một số lượng lớn các enzyme ngoại bàokích thích hệ thống tiêu hóa như: enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lacticdehydrogenase

Proteolysis (khả năng phân giải protein): vi sinh vật tổng hợp protease giúp phânhủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được Hoạt tính này của

Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có thể tiêu thu dễ dàng.

Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành

những hợp chất đơn giản Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăndinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng bệnh Nhiều thí

nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể phân hủy Cholesterol.

Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme -galactosidase,

glycolase và lactic dehydrogenase cs thể sản sinh acid lactic từ lactose Acid lactic cónhững lợi ích như sau:

 Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡnglactose

 Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụprotein trong sữa

 Tăng cường việc sử dụng Calci, Phospho, Sắt

 Kích thích sự bài tiết

 Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày

 Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp

2.2.4 Khả năng tổng hợp vitamin và các chất trao đổi có lợi cho

Bacteriocin là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và

có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống

sản xuất Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm và gram dương.Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:

 Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome

 Tế bào chủ miễn dịch với chúng

 Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt nhữngchủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó lactic acidbacteria (LAB) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩnrộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dượcphẩm

Bacteriocin được LAB tổng hợp chia thành 4 lớp:

Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những aminoacid hiếm và một số amino acid khử nước Chịu được nhiệt, hoạt động ổn định trên cấutrúc màng Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ởđầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tửpeptide hoạt hóa

Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tửpeptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ khángkhuẩn hẹp Lớp này được chia làm ba nhóm:

IIA: peptides hoạt động chống lại Listeria spp Trong nhóm này có

Bacteriocin dạng này được thu nhận từ một số giống Lactobacillus

Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phầnlipid và carbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về câu trúc và chứng năngcủa bacteriocin thuộc lớp này bì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch

Hình 2.9: cơ chế kháng khuẩn của một số loại Bacteriocin [48]

Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào

Bảng 2.7: Một số Bacteriocin và đặc điểm của chúng [22]

Lactococcus lactis

subsp lactis

Nisin Vi khuẩn gram dương Lớp I: lantibiotic, 3.5 kDa, 34

amino acids, Lacticin 3147 Clostridium sp

Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

Lớp I: cấu thành từ 2 lantibiotic, 4.2 kDa, bền với nhiệt.

Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Lactococcus lactis

subsp cremoris Lactococcin B Lactobacillus Lớp II: khoảng 5 kDa, phổ tácđộng hẹp.

Lớp II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chịu được nhiệt độ 121 0 C trong

15 phút.

Lactacin B Lactobacillus debrweckii

Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis

Lớp III: 6.3 kDa, chịu được nhiệt, chỉ được tổng hợp khi nuôi cấy ở điều kiện pH 5.0-6.0

Lactobacillus

amylovorus Lactobin A Lactobacillus acidophilus Lactobacillus debrweckii Lớp II: 4.8 kDa, 50 amino acid,phổ tác động hẹp.

Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogens

Lactobacillus plantarum

Lớp II: cấu thành từ 2 bacteriocin (mỗi bacteriocin 3.4 kDA, 33 amino acid)

Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus

Enterococcus faecalis Listeria môncytogenes

Lớp II: 3.9 kDa, 37 amino acid,

Pediocin F vi khuẩn gram dương Lớp II: 4.5 kDa, thuộc enzyme

proteolytic, bền với nhiệt, hòa tan chất hữu cơ, hoạt động ở khoảng pH rộng.

Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Lớp II: 4.6 kDA, 44 amino

acid.

Pediocin AcH Vi khuẩn gram âm và

gram dương Lớp II: 4.6 kDa, 44 amino acid,phổ tác động rộng.

Pediococcus

pentosaceous

Pediocin A Lactobacillus

Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum

Lớp II: 2.7 kDa, thuộc enzyme proteolytic, tồn tại ở 100 0 C trong 10 phút.

Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus

Leuconostoc Pediococcus

Lớp I: 3.7 kDa, hoạt động ở pH 4.5-7.5

Sakacin P Listeria monocytogenes Lớp II: 4.4 kDa, chịu nhiệt

2.2.5.2. Các chất có khả năng kháng khuẩn khác

Các LAB cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnhthông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác ngoài bacteriocin nhu: hydrogenperoxide, cacbon dioxide và diacetyl, acid hữu cơ chủ yếu là acid lactic

Quá trình biến dưỡng của LAB có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinhvật có hại các dạng hoạt động khác của chúng Được thể hiện rõ qua bảng sau:

Bảng 2.8: Kiểu hoạt động đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng

CO2 Ức chế quá trình decarboxylation, giảm tính thấm qua

màng ( khử Carboxyl)

Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine

Hydrogen peroxide

Lactoperoxide

Oxy hóa các protein cơ bản

Acid lactic Acid lactic không bị phân hủy mà thấm vào màng làm

giảm pH nội bào Nó cũng liên quan tới quá trình biếndường như: phosphoryl oxy hóa

2.3 Vi sinh vật chỉ thị

2.3.1 Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị (indicator strains)

Vi sinh vật chỉ thị là những vi sinh vật gây bệnh rối loạn hệ tiêu hóa có nguồn gốcthực phẩm Để chọn lọc Probiotic, người ta kiểm tra khả năng ức chế của các vi sinhvật probiotic lên sự sinh trưởng phát triển của vi sinh vật chỉ thị Một số ví dụ về các visinh vật chỉ thị này là:

Bảng 2.9: Một số vi sinh vật chỉ thị điển hình sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc

Christopher, I Sankara Reddy, 2006

Rất nhiều nghiên cứu chọn Escherichia coli là vi sinh vật chỉ thị, đặc biệt là chỉ

thị cho những bệnh liên quan tới thực phẩm hay đường tiêu hóa Chính vì vậy, đề tài này đã thực hiện chọn lọc probiotic bằng cách kiểm tra sự ức chế sinh trưởng của

probiotic lên vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli.

2.3.2. Vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột - Escherichia coli [4], [35]

2.3.2.1. Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa

Vi khuẩn E.coli có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc.

Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng

Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Chúng trở nên gây bệnh

khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng

Phân loại khoa học:

Loài (Species): E coli

Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm maoquanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có bao nang, loại không có độc lựckhông có bao nang Kích th ước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn Một số dòng cókhuẩn mao (pili)

Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi Nhiệt độthích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng TSA tạo khóm tròn ướt (dạng S) màutrắng đục Để lâu khóm trở nên khô nhăn (dạng R) Kích thước khóm 2-3mm.

- Trên thạch máu: Có chủng dung huyết á, có chủng không dung huyết á

- Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạokhóm tím ánh kim

- Trên môi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím.

- Trên môi trường Endo, SS tạo khóm hồng đỏ

- Trên các môi trường đường: Lên men lactose sinh hơi, glucose, galactose.Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen

- Các phản ứng sinh hóa: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR)dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, ,Lysine decarboxylase dương tính

Hình 2.10: Giới thiệu về hình thái Escherichia coli [44], [45], [46]

2.3.2.2. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố

Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tốgây tan huyết và phù thủng.

Độc tố của E.coli: Loại E.coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh

hơn loại không giáp mô Kháng nguyên K có 13 loại KA, KB, KL Ví dụ công thức

kháng nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.

Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt Cả hai loại này

đều gây tiêu chảy Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb Loại

không chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.

Những dòng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác

nhau nhưng thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H12, O157

2.3.2.3. Một số bệnh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc và gia cầm [49]

Bệnh gây cho gà

 Nguyên nhân: Do vi khuẩn E.coli gây ra.

 Phương thức lây truyền:

Lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh

Lây qua đường hô hấp hoặc da, niêm mạc

Lây qua vỏ trứng do nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường của chuồng trại

Gà đẻ: giảm tỷ lệ đẻ, gà ăn kém, gầy ốm dần, một số con có dấu hiệuviêm khớp Mổ khám cho thấy: ống dẫn trứng bị viêm, lách và gan thường sưng to vàsung huyết

Gan söng to sung huyeát Vieâm phoåi

Hình 2.11: Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà [49]

Bệnh gây cho heo:

 Bệnh nhiễm trùng huyết do E.coli ở heo con

 Nguyên nhân : thường xảy ra ở các đàn không ấm áp, vệ sinh kém, thiếu hoặc ítsữa đầu, nước uống không tốt, sữa mẹ kém làm giảm hoặc mất nhu động ruột, có thể dothiếu máu, thiếu vitamin (A, PP, B5…) Vi khuẩn E.coli sẽ xâm nhập và nhân lên trongruột, vào máu và gây nhiễm trùng máu

 Triệu chứng: Heo bị nhiễm bệnh trong vòng 12h sau khi sanh và có thể chết trong

vòng 48 giờ với các biểu hiện sau: Heo bệnh lười vận động, đứng riêng ra khỏi đàn, ủ

rũ, đuôi rũ xuống hông Đôi khi ói mửa, run rẩy và có thể chết sau khi hôn mê, co giật(tỷ lệ chết có thể 80-90%)

 Bệnh tích: Viêm màng ngoài và van tim, sung huyết thận, lá lách, có thể viêm da

và khớp

 Bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con: Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn

heo con sơ sinh đến giai đoạn cai

 Nguyên nhân: Bệnh xảy ra ở các đàn úm không đủ ấm, vệ sinh chuồng và thức ănnước uống kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, sữa mẹ kém, thiếu máu, thiếu vitamin Bệnhthường kết hợp nhiệt độ quá thấp, mưa lạnh, ẩm ướt, stress…

 Triệu chứng: Heo tiêu chảy phân màu vàng trắng, trắng xám, về sau có màu vàng

xanh, mùi hôi Heo mất nước, gầy sút nhanh, bú kém, đi lại không vững và nôn ra sữađông không tiêu Heo con bệnh yếu đi rất nhanh nếu không điều trị kiệp thời thì heoyếu dần, lông xù và chết (tỷ lệ chết có thể lên đến 80-90%)

 Bệnh tích: Cơ thể mất nước, ốm, phân dính bết vào hậu môn Mạch máu ruột và

hạch ruột sung huyết cấp tính Ít thấy viêm dạ dày ruột xuất huyết, dạ dày chứa sữakhông tiêu

Heo con bị tiêu chảy phân trắng Heo con yếu dần rồi chết

Hình 2.12: Aûnh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con [49]

 Bệnh phù thủng trên heo cai sữa: Bệnh thường xảy ra trên

heo cai sữa hoặc sau cai sữa 1-3 tuần tuổi Bệnh thường xảy ra trên nhữngcon lớn nhất đàn sau lây qua những con khác

 Nguyên nhân:

Do chuồng trại vệ sinh không tốt, ẩm thấp

E.coli có sẵn trong cơ thể kết hợp với stress khi tách mẹ thì sẽ nhân

lên nhanh trong ruột Thay đổi thức ăn đột ngột, heo con không còn đượcbú do đó sẽ ăn quá nhiều thức ăn dẫn đến không tiêu hóa hết thức ăn

 Sự sinh bệnh: vi khuẩn E.coli gây bệnh phát triển trong niêm mạc ruột

làm sản sinh độc tố phá hủy mao mạch dẫn đến phù thủng khắp cơ thể

 Triệu chứng:

- Bệnh thường xảy ra đột ngột ở giai đoạn vài ngày đến một tuần saucai sữa và trên heo lớn trội của bầy

- Lúc mới nhiễm bệnh heo có dấu hiệu kém ăn, kém linh hoạt

- Thể quá cấp heo chết đột ngột và trước khi chết có triệu chứngphù

- Ở thể cấp tính, bệnh diễn biến 2-3 ngày Ngày đầu heo bỏ ăn, sangngày thứ 2 hoặc ngày thứ 3 có triệu chứng phù

- Triệu chứng phù thủng xuất hiện chủ yếu ở vùng đầu như: mí mắt,vùng hầu, gốc tai, đôi khi sưng cả mặt

- Phù não, não bị chèn ép bởi dịch thoát ra từ mạch máu nên gâynhũn não dẫn đến triệu chứng thần kinh như: co giật kiểu bơi chèo, đi xiêuvẹo, hay đâm đầu vào tường, đi lại không định hướng.

- Do thủy thủng ở thanh quản nên hay kêu khàn giống tiếng chim

- Nhiệt độ không tăng, sung huyết ở niêm mạc và xanh tím ở tai, mõm,chóp đuôi…Heo rất khó thở trước khi chết

 Bệnh tích:

- Vùng mỡ liên kết dưới da bị thủy thủng

- Hạch vùng bẹn, hạch ruột bị thủy thủng, xoang bụng chứa dịch phù,phù thủng ở màng trong ruột

- Thủy thủng mí mắt, lỗ tai, ở quanh tim, thanh quản

Bầy heo bệnh chỉ nằm và có tư thế ngồi kiểu chó

Phù thủng ở kết tràng và chứa

nhiều dịch thủy thủng

Xuất huyết ruột non, phù màng treoruột và sưng hạch màng treo ruộtHình 2.13: Aûnh hưởng của bệnh phù thủng trên heo cai sữa [49]

Chương 3: Vật Liệu & Phương Pháp Nghiên Cứu 3.1 Vật liệu

3.1.1 Địa điểm thực hiện đồ án

Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa MôiTrường và Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Kỹ Thuật Công NghệThành Phố Hồ Chí Minh

Hệ thống phòng gồm có: