Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng.
Độc tố của E.coli: Loại E.coli cĩ giáp mơ (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn loại khơng giáp mơ. Kháng nguyên K cĩ 13 loại KA, KB, KL. Ví dụ cơng thức kháng nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.
Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và khơng chịu nhiệt. Cả hai loại này đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb. Loại khơng chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.
Những dịng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau nhưng thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H12, O157.
2.3.2.3. Một số bệnh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc và gia cầm [49]
Bệnh gây cho gà
Nguyên nhân: Do vi khuẩn E.coli gây ra.
Phương thức lây truyền:
Lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh. Lây qua đường hơ hấp hoặc da, niêm mạc.
Lây qua vỏ trứng do nhiễm bẩn từ phân hoặc mơi trường của chuồng trại bị nhiễm trùng.
Lây qua thức ăn, nước uống bị nhiễm trùng.
Triệu chứng và bệnh tích:
Gà con mới nở: Rốn viêm, ướt, cĩ màu xanh. Bụng sưng to, lịng đỏ khơng tiêu. Tiêu chảy.
Gà con từ 1-5 tuần tuổi: gà sốt cao, uống nhiều nước, khĩ thở, bỏ ăn, sưng mặt, viêm kết mạc mắt. Viêm màng bao tim, viêm màng bụng, viêm màng quanh gan làm cho bao tim đục, màng bụng cĩ dịch viêm, quanh gan thường phủ một lớp Fibrin màu trắng đục. Viêm túi khí. Viêm phổi
Gà đẻ: giảm tỷ lệ đẻ, gà ăn kém, gầy ốm dần, một số con cĩ dấu hiệu viêm khớp. Mổ khám cho thấy: ống dẫn trứng bị viêm, lách và gan thường sưng to và sung huyết
Gan sưng to sung huyết Viêm phổi Hình 2.11: Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà [49]
Bệnh gây cho heo:
Bệnh nhiễm trùng huyết do E.coli ở heo con
Nguyên nhân : thường xảy ra ở các đàn khơng ấm áp, vệ sinh kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, nước uống khơng tốt, sữa mẹ kém làm giảm hoặc mất nhu động ruột, cĩ thể do thiếu máu, thiếu vitamin (A, PP, B5…). Vi khuẩn E.coli sẽ xâm nhập và nhân lên trong ruột, vào máu và gây nhiễm trùng máu.
Triệu chứng:Heo bị nhiễm bệnh trong vịng 12h sau khi sanh và cĩ thể chết trong vịng 48 giờ với các biểu hiện sau: Heo bệnh lười vận động, đứng riêng ra khỏi đàn, ủ rũ, đuơi rũ xuống hơng. Đơi khi ĩi mửa, run rẩy và cĩ thể chết sau khi hơn mê, co giật (tỷ lệ chết cĩ thể 80-90%).
Bệnh tích: Viêm màng ngồi và van tim, sung huyết thận, lá lách, cĩ thể viêm da và khớp.
Bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con: Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn heo con sơ sinh đến giai đoạn cai.
Nguyên nhân: Bệnh xảy ra ở các đàn úm khơng đủ ấm, vệ sinh chuồng và thức ăn nước uống kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, sữa mẹ kém, thiếu máu, thiếu vitamin. Bệnh thường kết hợp nhiệt độ quá thấp, mưa lạnh, ẩm ướt, stress…
Triệu chứng:Heo tiêu chảy phân màu vàng trắng, trắng xám, về sau cĩ màu vàng xanh, mùi hơi. Heo mất nước, gầy sút nhanh, bú kém, đi lại khơng vững và nơn ra sữa đơng khơng tiêu. Heo con bệnh yếu đi rất nhanh nếu khơng điều trị kiệp thời thì heo yếu dần, lơng xù và chết (tỷ lệ chết cĩ thể lên đến 80-90%).
Bệnh tích: Cơ thể mất nước, ốm, phân dính bết vào hậu mơn. Mạch máu ruột và hạch ruột sung huyết cấp tính. Ít thấy viêm dạ dày ruột xuất huyết, dạ dày chứa sữa khơng tiêu.
Heo con bị tiêu chảy phân trắng Heo con yếu dần rồi chết Hình 2.12: Aûnh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con [49]
Bệnh phù thủng trên heo cai sữa: Bệnh thường xảy ra trên
heo cai sữa hoặc sau cai sữa 1-3 tuần tuổi. Bệnh thường xảy ra trên những con lớn nhất đàn sau lây qua những con khác.
Nguyên nhân:
Do chuồng trại vệ sinh không tốt, ẩm thấp.
E.coli có sẵn trong cơ thể kết hợp với stress khi tách mẹ thì sẽ nhân lên nhanh trong ruột. Thay đổi thức ăn đột ngột, heo con không còn được bú do đó sẽ ăn quá nhiều thức ăn dẫn đến không tiêu hóa hết thức ăn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự sinh bệnh: vi khuẩn E.coli gây bệnh phát triển trong niêm mạc ruột làm sản sinh độc tố phá hủy mao mạch dẫn đến phù thủng khắp cơ thể.
Triệu chứng:
- Bệnh thường xảy ra đột ngột ở giai đoạn vài ngày đến một tuần sau cai sữa và trên heo lớn trội của bầy.
- Lúc mới nhiễm bệnh heo có dấu hiệu kém ăn, kém linh hoạt.
- Thể quá cấp heo chết đột ngột và trước khi chết có triệu chứng phù.
- Ở thể cấp tính, bệnh diễn biến 2-3 ngày. Ngày đầu heo bỏ ăn, sang ngày thứ 2 hoặc ngày thứ 3 có triệu chứng phù.
- Triệu chứng phù thủng xuất hiện chủ yếu ở vùng đầu như: mí mắt, vùng hầu, gốc tai, đôi khi sưng cả mặt.
- Phù não, não bị chèn ép bởi dịch thoát ra từ mạch máu nên gây nhũn não dẫn đến triệu chứng thần kinh như: co giật kiểu bơi chèo, đi xiêu vẹo, hay đâm đầu vào tường, đi lại không định hướng.
- Do thủy thủng ở thanh quản nên hay kêu khàn giống tiếng chim.
- Nhiệt độ không tăng, sung huyết ở niêm mạc và xanh tím ở tai, mõm, chóp đuôi…Heo rất khó thở trước khi chết.
Bệnh tích:
- Vùng mỡ liên kết dưới da bị thủy thủng.
- Hạch vùng bẹn, hạch ruột bị thủy thủng, xoang bụng chứa dịch phù, phù thủng ở màng trong ruột.
- Thủy thủng mí mắt, lỗ tai, ở quanh tim, thanh quản.
Bầy heo bệnh chỉ nằm và có tư thế ngồi kiểu chó
Phù thủng ở kết tràng và chứa nhiều dịch thủy thủng
Xuất huyết ruột non, phù màng treo ruột và sưng hạch màng treo ruột Hình 2.13: Aûnh hưởng của bệnh phù thủng trên heo cai sữa [49]
Chương 3: Vật Liệu & Phương Pháp Nghiên Cứu 3.1. Vật liệu
3.1.1. Địa điểm thực hiện đồ án
Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Phòng 15: phòng thí nghiệm hóa Phòng 14: phòng thí nghiệm vi sinh Phòng 9 : phòng thí nghiệm thực vật
3.1.2. Giống vi sinh vật
Vi khuẩn lên men lactic do sinh viên Nguyễn Thị Bích Thùy cung cấp từ kết quả của đồ án tốt nghiệp khóa 05 - lớp 05DSH - Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học – Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM: “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”
Vi khuẩn E.coli M15 được cung cấp từ Đại Học Y dược TP HCM. Bảng 3.1: Các chủng được kiểm tra hoạt tính probiotic
Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân
lập
Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1a, S1b
Sữa để chua tự nhiên 2 S2
Sữa để chua tự nhiên 3 S3
Sữa để chua tự nhiên 4 S4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kefir lên men từ PTN 1 S5
Kefir lên men từ PTN 2 S6
Nem Nem 1 N1
Nem 3 N3
Nem 4 N4
Nem 5 N5
Dưa muối Dưa muối 2 D2
Dưa muối 3 D3
Cà muối chua Cà muối C1
Chế phẩm dược Biolactyl T1a,T1b, T1c Biosubtyl DL T2c L-Bio-M T3c Lactomin plus T4c Probio T7b Ybio T8b
- Thành phần vi sinh trong 1 gói chế phẩm gồm: + L-Bio: Lactobacillus acidophilus
+ Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic.
+ L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus.
+ Probio: Lactobacillus acidophilus.
+ Ybio: Lactobacillus acidophilus.
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Môi trường
Môi trường Pepton Water: tăng sinh khối vi khuẩn E.coli
Môi trường TSA (Tripton soya agar): giữ giống vi khuẩn E.coli
Môi trường BHI (Brain Heart Infusion ): môi trường phát triển của E.coli
sử dụng trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB BHI Broth 1000ml
Beef heart infusion...250.0g Calf brain in fusion...200.0g Proteose peptone...10.0g NaCl...5.0g Na2HPO4.12H2O...2.5g Glucose...2.0g
pH 7.4 ± 0.2, 250C BHI thạch, bổ sung 2% agar
Môi trường MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) Broth: môi trường tăng sinh LAB MRS Broth 1000ml Glucose...20.0g Peptone...10.0g Beef extract...8.0g Yeast extract...4.0g CH3COONa...3.0g K2HPO4.3H2O...2,623g Mg2SO4.7H2O...0.2g MnSO4.4H2O...0.03786g Triamonium citrate...4.0g Tween 80...1ml Môi trường MRS thạch: môi trường trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB: MRS lỏng bổ sung 2% agar.
3.1.3.2. Hóa chất
Cồn 700, 960
Các hóa chất pha môi trường dinh dưỡng
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị3.1.4.1. Dụng cụ 3.1.4.1. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Ống nghiệm không nắp Đĩa petri Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Đầu típ 100 µl, 1000 µl Ống ly tâm eppendorf Ống đục lỗ Giấy thấm
Que cấy, que gắp, que tăm bông, que trang Thước đo cm, mm
Đũa thủy tinh
Giá để ống nghiệm, rổ nhựa Bông thấm nước
Bông không thấm nước
Bao nilon hấp, dây thun, giấy gói
3.1.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ sấy (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba
Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo quang (Hach)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo pH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)
Máy nước cất (Branstead USA)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật
Chuẩn bị giống vi khuẩn lên men lactic:
• Giống vi khuẩn lên men lactic được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường MRS lỏng
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy LAB:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa MRS lỏng. Quấn parafin quanh miệng ống nghiệm để nuôi cấy kị khí.
Đem ủ ở 370C từ 16-24h.
Chuẩn bị giống E.coli:
• Giống LAB được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường Peptone Water
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml Peptone Water. Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy E.coli tăng sinh khối:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa Peptone Water. Đem ủ hiếu khí 24h, 370C
Sử dụng E.coli sau khi nuôi cấy qua đêm pha loãng 10-2 ( tương đương 10-5
tb/ml) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2. Chuẩn bị môi trường test
Môi trường BHI agar (2%), Môi trường MRS agar (2%): Pha môi trường thêm agar 2% trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều, cho vào bình Erlen. Làm nút bông, bịt lại bằng nilon hoặc giấy bạc.
Đĩa petri, rửa sạch, sấy khô, gói giấy, bỏ bịch.
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Đổ đĩa khi môi trường ở 60-700C, mỗi đĩa đổ khoảng 15ml
Để agar đông, bỏ vào tủ ủ qua đêm để kiểm tra và loại bỏ đĩa bị nhiễm.
Bảo quản trong tủ lạnh 40C.
Trước khi sử dụng bỏ vào sấy 600C, 15p
Môi trường BHI lỏng (0.7%)
Pha môi trường thêm agar 0.7 % trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều.
Phối vào 7ml/ ống nghiệm.
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
Môi trường peptone water Pha môi trường
Phối 8ml/ống nghiệm
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
3.2.3.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Nguyên tắc: dựa vào sự đối kháng trực tiếp giữa vi khuẩn lên men lactic và vi khuẩn chỉ thị. Tạo điều kiện môi trường thích hợp cho cả hai vi khuẩn phát triển.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa môi trường MRS agar, sấy khô ở 600C.
Môi trường BHI (0.7% agar) giữ ở nhiệt độ 500C Thước đo vòng kháng (cm, mm)
Cách thực hiện như sau: Đổ đĩa mt MRS (2% agar) Nhỏ 10µl LAB (nuôi cấy kị khí 24h,
370C) lên mặt thạch ủ (1)
E.coli nuôi cấy tăng sinh qua 21h Hút 1ml dịch nuôi cấy vào 7ml
BHI (0.7% agar). (2)
Đổ hỗn hợp VK chỉ thị + BHI agar (2) lên bề mặt thạch MRS (1)
Ủ hiếu khí 24-48h, 370C
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
Đối chứng: thay vì giọt dịch chứa LAB, giọt MRS lỏng. Làm đối chứng không có sự đối kháng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.3.2. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch)
Nguyên tắc: Dựa trên sự đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lên men lactic với vi khuẩn chỉ thị ngay tại vị trí nhỏ vi khuẩn lên men lactic.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa môi trường BHI agar, sấy khô ở 600C.
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli môi trường BHI agar (2%) Nhỏ 10µl dịch nuôi cấy LAB lên bề mặt đĩa
Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
Đối chứng: nhỏ giọt môi trường MRS lỏng lên đĩa, đánh dấu vị trí. So sánh với các vị trí giọt chứa LAB.
3.2.3.3. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng
phương pháp disc diffusion assay (khuếch tán qua vòng giấy lọc)
Chuẩn bị: Giấy lọc đường kính 8mm
Môi trường Peptone water 8ml mỗi ống nghiệm
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Cách thực hiện:
Đổ đĩa mt BHI agar (2%) Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli
Ly tâm dịch nuôi cấy LAB Cho 20µl dịch ly tâm Đặt giấy thấm
Ủ hiếu khí 24h, 370C
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
LAB sau khi nuôi cấy trong MRS lỏng qua đêm 18-24h, lấy 1,2ml dịch nuôi cấy cho vào ống effendorf, đem ly tâm 14000prm trong 10 phút.
Đặt năm miếng giấy thấm trên bề mặt agar.
Đối chứng: miếng ở trung tâm chỉ thấm vào MRS broth Giấy thấm phải được khử trùng trước khi sử dụng.
Dùng kẹp khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn để gắp giấy thấm.
3.2.3.4. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng
phương pháp Agar well diffusion assay (khuếch tán qua giếng thạch)
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha loãng 10-1, 10-2 được nồng độ sử dụng là 105-106 tế bào/ml. Khảo sát hai nồng độ này
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C. Đem ly tâm 14000 vòng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Khảo sát độ dày môi trường là 5mm tương ứng với 25ml môi trường/đĩa, 3mm tương ứng với 15ml môi trường/đĩa.
Cách thực hiện:
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli môi trường BHI agar (2%) Đục lổ trên thạch đường kính 8mm
Lấy 0.1ml dịch nuôi cấy LAB (nuôi cấy kị khí 24h, 370C) vào lỗ. Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng Quá trình đục lỗ: Mở nắp đĩa petri, dùng ống đồng đường kính 8mm, khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, đục 5 lỗ trên thạch. Lấy que gắp, khử trùng, để nguội, gắp thạch ra khỏi tạo giếng thạch. Hơ khử trùng nắp petri, đậy nắp petri.
Đối chứng: giếng ở trung tâm đĩa, cho 0.1ml MRS broth để đối chứng.
3.2.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phươngpháp Turbidometricassay (đo độ đục) pháp Turbidometricassay (đo độ đục)
Nguyên tắc của phương pháp đo độ đục: Bằng máy quang phổ đo mật độ tế bào vi sinh vật có trong dịch nuôi cấy ở bước sóng 600nm.