Hai mươi hai chủng vi khuẩn lactic được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn tổng quát nhờ phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với độ dày mơi
trường và nồng độ E.coli thích hợp là: độ dày 3mm và nồng độ 105 tế bào/ml. Đường kính vịng kháng khuẩn được đo bao gồm cả đường kính giếng thạch (Hình 4.2 và Bảng 4.1).
Ta cĩ cơng thức tính bề rộng vành kháng khuẩn:
Bề rộng vành kháng khuẩn = [d vịng kháng – d giếng thạch]/2 (mm) Schillinger và Lucke (1989) cho rằng khi bề rộng vành kháng khuẩn > 1 mm thì khả năng kháng của các vi khuẩn lactic đối với vi sinh vật chỉ thị coi như là mạnh; khi giá trị này nằm trong khoảng 0,5 – 1 mm tương ứng khả năng kháng trung bình. Cịn theo nghiên cứu của V. Rosenfeldt Nielsen, C. N. Jacobsen, A. E. Hayford, P. L. Molller, K. F. Michaelsen, A. Perrehaard, B. Sandstrom, M. Tvede, M. Jakobsen (1999) thì bề rộng vành kháng khuẩn được xét trong khoảng 2-5mm cho khả năng kháng trung bình và trên 5mm cho khả năng kháng mạnh. Gần đây, V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy (2006) đo được bề rộng vịng kháng khuẩn 3- 5mm của Lactobacillus acidophilus đối với vi sinh vật chỉ thị E.coli. Theo bảng 4.1, bề rộng vịng kháng khuẩn đo được của chúng tơi khơng khác biệt với các tác giả nêu trên. Bề rộng vành kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ chất kháng khuẩn trong dịch ly tâm. Một số tác giả cịn cơ đặc dịch tế bào ly tâm 5, 10 lần để tăng nồng độ chất kháng khuẩn nhằm tăng bề dày vành kháng khuẩn [36]
Bảng 4.1. Đường kính vịng kháng khuẩn đo đường bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay)
Số TT Chủng Giá trị trung bình đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Giá trị trung bình bề rộng vành kháng khuẩn (mm) Phân loại hoạt tính kháng khuẩn 1 T8b 18.0 5.0 +++
2 C1 18.0 5.0 +++ 3 T1a 17.0 4.5 +++ 4 T7b 17.0 4.5 +++ 5 D3 16.0 4.0 ++ 6 N3 16.0 4.0 ++ 7 T1c 15.0 3.5 ++ 8 T3c 15.0 3.5 ++ 9 S6 15.0 3.5 ++ 10 N4 14.0 3.0 ++ 11 S2 14.0 3.0 ++ 12 S4 14.0 3.0 ++ 13 N1 13.0 2.5 + 14 T2c 13.0 2.5 + 15 N5 10.0 1.0 + 16 S1a 10.0 1.0 + 17 S1b 10.0 1.0 + 18 S3 10.0 1.0 + 19 T1b 10.0 1.0 + 20 D2 10.0 1.0 + 21 T4c 8.0 0 0 22 S5 8.0 0 0
Để tiện theo dõi và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được trong phịng thí nghiệm, chúng tơi đề nghị phân loại hoạt tính kháng khuẩn (tạm thời đối với vi khuẩn chỉ thị E.coli) như sau:
- Bề dày vành kháng khuẩn >4.0 mm tương ứng hoạt tính mạnh (+++) - Bề dày vành kháng khuẩn = 3.0mm ÷ 4.0 mm tương ứng hoạt tính
trung bình (++)
- Bề dày vành kháng khuẩn < 3.0 mm tương ứng hoạt tính yếu (+) - Bề dày vành kháng khuẩn = 0 mm tương ứng khơng cĩ hoạt tính (0) Như vậy, trong số bốn phương pháp khuếch tán trong mơi trường thạch là spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay, và well diffusion assay, thì phương pháp cuối cùng sau khi chuẩn hĩa về độ dày mơi trường và nồng độ vi sinh vật cĩ thể áp dụng để so sánh hoạt tính kháng khuẩn của các
chủng vi khuẩn nguồn gốc khác nhau qua đường kính vịng kháng. Tuy nhiên, để kết quả cĩ thể so sánh bằng phương pháp thống kê cần tăng số lần lặp lại. Chúng tơi đã áp dụng phương pháp này để so sánh hoạt tính kháng khuẩn tổng thể đối với E.coli của 22 chủng vi khuẩn lactic. Để xác định bản chất kháng khuẩn là do acid lactic, H2O2 hay bacteriocin, cần tiến hành một số phương pháp bổ sung như trung hịa dịch tế bào ly tâm, bổ sung catalase….Ngồi ra, các phương pháp khuếch tán qua mơi trường thạch chỉ cĩ thể áp dụng để sàng lọc ban đầu trong quy trình tìm kiếm các chủng cĩ hoạt tính probiotic. Để so sánh mang tính định lượng cần tìm kiếm những phương pháp cĩ độ tin cậy cao hơn.
4.5. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Turbidimetric assay (đo độ đục)
Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong mơi trường làm cho mơi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đĩ, thơng qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sĩng nhất định của dịch huyền phù tế bào ta cĩ thể định tính được mật độ tế bào ở điều kiện cần khảo sát.
Khi thực hiện phương pháp đo độ đục, chúng tơi cĩ thay đổi quy trình so với tài liệu tham khảo [16], [31]. Thay vì tiệt trùng dịch ly tâm bằng phương pháp lọc, chúng tơi khử trùng trước eppendorf tube dùng để ly tâm, sau ly tâm chỉ thanh trùng Pasteur ở 80o C 10 phút để tránh biến tính bacteriocin và đơn giản hĩa thao tác. Mọi thao tác cấy truyền đều được bảo đảm điều kiện vơ trùng.
Phương pháp này vẫn dựa trên nguyên tắc chung của các phương pháp phát hiện chất kháng vi sinh vật là đo khả năng ức chế tăng trưởng của vi khuẩn chỉ thị của các chất kháng khuẩn được sinh ra từ quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lên men lactic. Khơng giống như bốn phương pháp đã thực hiện ở trên, phương pháp đo độ đục dựa trên sự khuếch tán các chất kháng khuẩn trong mơi trường lỏng. Tỉ lệ phần trăm OD E. coli ủ với dịch ly tâm tế bào vi khuẩn LAB so với OD E. coli ủ với đối chứng (thay dịch ly tâm LAB bằng mơi trường MRS cùng thể tích) cho ta tỉ lệ sống sĩt của E. coli sau khi ủ với các chất kháng khuẩn trong dịch nuơi cấy tế bào LAB. Như vậy biên độ thay đổi của các giá trị đo được và tính được rộng hơn so với phương pháp well diffusion assay (Hình 4.5 và Bảng 4.2).
Cũng trên cơ sở phương pháp này cĩ nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước, ngồi việc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tổng quát, chúng tơi bước đầu tìm hiểu bản chất kháng khuẩn trong dịch nuơi cấy vi khuẩn LAB ly tâm.
Thực hiện quá trình nuơi cấy vi khuẩn lên men lactic trong MRS lỏng với điều kiện kị khí, dịch ni cấy đem phân tích hàm lượng H2O2 sinh ra.
Kết quả cho thấy H2O2 khơng được sinh ra trong q trình ni cấy kị khí, như vậy hai chất kháng khuẩn đáng quan tâm cịn lại là acid hữu cơ và bacteriocin. Để loại bỏ tác dụng của acid hữu cơ trong hoạt tính kháng
khuẩn, chúng tơi tiến hành trung hịa dịch nuơi cấy LAB rồi mới đem ly tâm tiếp đĩ tiến hành quy trình đo độ đục như trên. Kết quả cũng được trình bày trong bảng 4.2.
Ống nghiệm bên phải: Dịch nuơi cấy C1 ly tâm (khơng trung hịa) ủ
với E. coli
Ống nghiệm bên phải: Dịch nuơi cấy C1 ly tâm (sau khi trung hịa) ủ
với E. coli
Ống nghiệm bên trái : đối chứng (thay dịch nuơi cấy C1 bằng mơi trường MRS cùng thể tích)
Hình 4.5: Kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp đo đơ đục
Bảng 4.2. Tỉ lệ sống sĩt của E. coli sau khi ủ với dịch nuơi cấy LABly tâm ly tâm Số TT Chủng vi khuẩn lactic Tỉ lệ sống sĩt của E.coli (%) khi ủ với dịch ly tâm khơng trung hịa Tỉ lệ sống sĩt của E.coli (%) khi ủ với dịch ly tâm sau
khi trung hịa
1 T8b 4.6 56.1
2 C1 4.1 52.7
3 T1a 3.2 62.1
4 T7b 4.5 57.1
6 N3 4.2 63.2 7 T1c 48.2 74.3 8 T3c 20.0 68.8 9 S6 34.3 63.4 10 N4 41.9 67.9 11 S2 12.3 76.8 12 S4 34.0 54.3 13 N1 15.8 55.8 14 T2c 63.2 63.5 15 N5 48.1 65.6 16 S1a 45.7 58.0 17 S1b 85.1 76.0 18 S3 46.5 58.1 19 T1b 92.6 80.3 20 D2 57.0 57.6 21 T4c 89.5 77.5 22 S5 53.2 73.5
Từ bảng 4.2 ta cĩ thể thấy rằng tỉ lệ sống sĩt của E. coli càng thấp thì hoạt tính kháng vi sinh vật càng cao. Như vậy để so sánh trực tiếp khả năng ức chế tăng trưởng E. coli của các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn LAB, chúng tơi sử dụng đại lượng (100% – tỉ lệ % số sĩt của E. coli) và biểu diễn trên đồ thị 4.1.
Đồ thị 4.1: Tỉ lệ ức chế tăng trưởng E. coli của dịch nuơi cấy vi khuẩn lactic ly tâm khơng trung hịa và sau khi trung hịa
Đồ thị 4.1 cho thấy:
- Tỉ lệ ức chế tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị của dịch nuơi cấy LAB ly tâm khơng trung hịa thường lớn hơn mẫu tương ứng sau khi trung hịa (19/22 trường hợp) Điều này hợp lý vì trung hịa nhằm loại bỏ tác dụng của acid hữu cơ trong hoạt tính kháng khuẩn. Trường hợp S1b, T1b và T4c cho kết quả ngược lại. Tuy nhiên các chủng này khơng gây chú ý đặc biệt vì tỉ lệ ức chế E. coli cao nhất xấp xỉ 20%, thuộc loại thấp nhất so với các chủng cịn lại.
- Nhiều chủng cĩ thể ức chế trên 80% tăng trưởng của E. coli
khi khơng trung hịa (T8b, C1, T1a, N3, S2, N1), nhưng sau khi loại bỏ tác dụng của acid hữu cơ tạo thành thì khả năng ức chế cịn lại trên dưới 40%. Nhiều chủng hoạt tính kháng E. coli lại khơng phải do acid hữu cơ tạo thành mà chủ yếu do yếu tố khác, rất nhiều khả năng là do bacteriocin (T2c, N5, S1a, D2) và hoạt tính này cũng xấp xỉ 40%.
So sánh với kết quả phương pháp khuếch tán trong giếng thạch (well diffusion assay) nhìn chung ta cĩ thể phân biệt những chủng cĩ hoạt tính mạnh
và yếu bằng cả hai phương pháp, ví dụ một số chủng được đánh giá là cĩ hoạt tính mạnh trong well diffusion assay ức chế trên 90% tăng trưởng E. coli
(mẫu khơng trung hịa). Ngược lại nhiều chủng làm giảm độ đục E.coli tương tự nhưng bề dày vành kháng khuẩn lại nhỏ (T3c, S2, N1). Cĩ vẻ rằng những chủng ức chế tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị càng mạnh do tác động của acid hữu cơ thì bề dày vành kháng khuẩn càng lớn. Cĩ thể đĩ là do khả năng khuếch tán của bacteriocin trong mơi trường thạch kém hơn acid hữu cơ. Đồ thị 4.2 biểu diễn tương quan giữa tỉ lệ sống sĩt E. coli (A%) theo phương pháp đo độ đục theo bề rộng vành kháng khuẩn (mm) với số liệu xử lý và đồ thị vẽ bằng phần mềm Statgraphics.
Đồ thị 4.2: Sự tương quan giữa phương pháp đo độ đục (turbidimetric assay method) và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay)
Phương trình biểu diễn tương quan là:
A(%) = 24.2 + 14.7 D được thiết lập với hệ số tương quan (correlation coefficient) là 0.8366 và R2 = 66.3 %.
Như vậy, về mặt thống kê coi như khơng cĩ sự tương quan giữa kết quả của hai phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đo độ đục.
Tĩm lại, phương pháp khuếch tán qua giếng thạch chỉ cho kết quả định tính lại tốn nhiều thời gian và cơng phu, cịn phương pháp đo độ đục cho kết quả mang tính định lượng hơn vì vậy cĩ thể dễ dàng sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các thành phần chất kháng khuẩn. Chúng tơi đề nghị phát triển phương pháp này trong Phịng thí nghiệm trong cơng việc tuyển chọn các chủng LAB làm probiotics hay sản xuất bacteriocin.
Chương 5: Kết Luận & Kiến Nghị 5.1. Kết Luận
Để chọn lọc các chủng cĩ tiềm năng probiotics, tuyển chọn khả năng kháng vi sinh vật đĩng vai trị quan trọng nhất và là hàng rào tuyển chọn đầu tiên cần áp dụng.
Trong bốn phương pháp thử nghiệm trên mơi trường thạch là spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay và well diffusion assay thì phương pháp thứ tư là cho kết quả trong phịng thí nghiệm của chúng tơi. Phương pháp này dùng để đánh giá hoạt tính tổng hợp các chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sinh ra trong quá trình trao đổi chất.
Để thực hiện các phương pháp này đã tối ưu hĩa điều kiện là:
Sử dụng mơi trường thạch dày 3mm tương ứng với 15ml mơi trường.
Sử dụng E.coli nồng độ 105 tế bào/ml dùng cho tất cả các phương pháp kiểm tra sự đối kháng.
Trong các phương pháp sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật chỉ cĩ phương pháp đo độ đục (turbidometric assay method) cho kết quả định lượng. Áp dụng phương pháp này cĩ thể đánh giá ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kháng vi sinh vật chỉ thị.
Bằng phương pháp well diffusion assay chúng tơi xác định được năm chủng cĩ vịng kháng khuẩn tốt nhất là: C1, T8b, T1a, T7b, N3. Trong đĩ C1 và N3 cĩ nguồn gốc từ thực phẩm là cà muối và nem. Cịn T8b, T1a, T7b cĩ nguồn gốc từ dược phẩm, là các chế phẩm Biolactyl, Probio và Ybio.
Bằng phương pháp đo độ đục chúng tơi xác định được năm chủng cĩ khả năng tạo chất kháng khuẩn, ức chế sự tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị
E.coli cho kết quả tốt nhất là : T1a, C1, N3, T7b, T8b, tương ứng với thí
nghiệm kiểm tra vịng kháng khuẩn.
5.2. Kiến nghị
Kiến nghị tại phịng thí nghiệm Đại Học Kỹ Thuật Cơng Nghệ nên triển khai phương pháp turbidometric assay trong nghiên cứu chọn lọc chủng tiềm năng probiotic. Để thực hiện hồn chỉnh phương pháp này cần phải điều chỉnh, tối ưu hĩa một số điều kiện như sau:
• Việc chuẩn hĩa này được thực hiện dựa trên dựng đường chuẩn về nồng độ tế bào vi khuẩn, kiểm sốt và cố định nồng độ tế bào vi khuẩn lên men lactic sử dụng trong phương pháp.
• Kiểm sốt và cố định nồng độ tế bào E.coli sử dụng trong phương pháp
• Trích ly và định lượng bacteriocin và xử lý dịch ly tâm bằng proteinase K để xác định các hợp chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn cĩ bản chất là protein hay khơng.
• Tiếp tục tiến hành các kiểm tra hoạt tính Probiotic của vi khuẩn lactic với các tiêu chí về: khả năng bám dính cạnh tranh với vi khuẩn chỉ
thị, khả năng chịu được pH hoặc dung hịa với acid, khả năng chịu được nồng độ muối mật cao, kiểm tra khả năng đối kháng trực tiếp với vi khuẩn chỉ thị trong điều kiện in vivo.
PHỤ LỤC 1: CÁC PHẦN XỬ LÝ SỐ LIỆU
1. Phân tích kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar Well Diffusion Assay (khuếch tán qua giếng thạch)
Summary Statistics for Vong khang khuan
Chung Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximu m Rang e Stnd. skewness C1 2 18.0 0.0 0.0% 18.0 18.0 0.0 D2 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 D3 2 16.0 0.0 0.0% 16.0 16.0 0.0 N1 2 13.0 1.41421 10.8786% 12.0 14.0 2.0 N3 2 16.0 0.0 0.0% 16.0 16.0 0.0 N4 2 14.0 0.0 0.0% 14.0 14.0 0.0 N5 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 S1a 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 S1b 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 S2 2 14.0 0.0 0.0% 14.0 14.0 0.0 S3 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 S4 2 14.0 0.0 0.0% 14.0 14.0 0.0 S5 2 8.0 0.0 0.0% 8.0 8.0 0.0 S6 2 15.0 1.41421 9.42809% 14.0 16.0 2.0 T1a 2 17.0 1.41421 8.3189% 16.0 18.0 2.0 T1b 2 10.0 0.0 0.0% 10.0 10.0 0.0 T1c 2 15.0 1.41421 9.42809% 14.0 16.0 2.0 T2c 2 13.0 1.41421 10.8786% 12.0 14.0 2.0 T3c 2 15.0 1.41421 9.42809% 14.0 16.0 2.0 T4c 2 8.0 0.0 0.0% 8.0 8.0 0.0 T7b 2 17.0 1.41421 8.3189% 16.0 18.0 2.0 T8b 2 18.0 0.0 0.0% 18.0 18.0 0.0 Total 44 13.2273 3.234 24.4495% 8.0 18.0 10.0 -0.251915 The StatAdvisor
This table shows various statistics for Vong khang khuan for each of the 22 levels of Chung. The one-way analysis of variance is primarily intended to compare the means of the different levels, listed here under the Average column. Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically.
WARNING: There is more than a 3 to 1 difference between the smallest standard deviation and the largest. This may cause problems since the analysis of variance assumes that the standard deviations at all levels are equal. Select Variance Check from the list of Tabular Options to run a formal statistical test for differences among the sigmas. You may want to consider transforming the values of Vong khang khuan to remove any dependence of the standard deviation on the mean.
ANOVA Table for Vong khang khuan by Chung
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 435.727 21 20.7489 32.61 0.0000
Within groups 14.0 22 0.636364
Total (Corr.) 449.727 43
The StatAdvisor
The ANOVA table decomposes the variance of Vong khang khuan into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 32.6054, is a ratio of the between-group estimate