Vi sinh vật chỉ thị là những vi sinh vật gây bệnh rối loạn hệ tiêu hĩa cĩ nguồn gốc thực phẩm. Để chọn lọc Probiotic, người ta kiểm tra khả năng ức chế của các vi sinh vật probiotic lên sự sinh trưởng phát triển của vi sinh vật chỉ thị. Một số ví dụ về các vi sinh vật chỉ thị này là:
Bảng 2.9: Một số vi sinh vật chỉ thị điển hình sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc probiotic
Vi sinh vật chỉ thị Nguồn nghiên cứu
Bacillus cereus
Clostridium perfringens Listeria spp
Staphylococcus aureus
Carherine B. Lewus, Thomas J. Montville, USA, 1991
Listeria monocytogenes Escherichia coli
Salmonella
N. Chauteu, I. Castellanos, A.M. Deschamps. France, 1992
Helicobacter pylori Clostridium difficile Campylobacter jejuni Escherichia coli
J. Nowroozi, M. Mirzaii, M. Norouzi, Iran, 2004
Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Pediococcus acidilaticii Lactobacillus helveticus 2001 Samonella Enteritidis Escherichia coli Clostridium perfringens
Magdalena Kizerwetter-Swida, Marian Binek, Poland, 2005 Shigella dysenteriae Escherichia coli Salmonela typhi Yersinia enterocolitica V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy, 2006
Rất nhiều nghiên cứu chọn Escherichia coli là vi sinh vật chỉ thị, đặc biệt là chỉ thị cho những bệnh liên quan tới thực phẩm hay đường tiêu hĩa. Chính vì vậy, đề tài này đã thực hiện chọn lọc probiotic bằng cách kiểm tra sự ức chế sinh trưởng của probiotic lên vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli.
2.3.2. Vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột - Escherichia coli [4], [35]
2.3.2.1. Đặc điểm hình dạng, nuơi cấy và tính chất sinh hĩa
Vi khuẩn E.coli cĩ nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên cịn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
Phân loại khoa học:
Vực (Domain): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Gamma Proteobacteria Bộ (Ordo): Enterobacteriales Họ (Familia): Enterobacteriaceae Chi (Genus): Escherichia
Lồi (Species): E. coli
Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, khơng tạo bào tử, loại cĩ độc lực thì cĩ bao nang, loại khơng cĩ độc lực khơng cĩ bao nang. Kích th ước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu trịn. Một số dịng cĩ khuẩn mao (pili).
Đặc điểm nuơi cấy và sinh hĩa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng cĩ thể mọc trên 400C, pH 7,4.
- Trên mơi trường thạch dinh dưỡng TSA tạo khĩm trịn ướt (dạng S) màu trắng đục. Để lâu khĩm trở nên khơ nhăn (dạng R). Kích thước khĩm 2-3mm.
- Trên thạch máu: Cĩ chủng dung huyết á, cĩ chủng khơng dung huyết á. - Trên mơi trường chẩn đốn chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khĩm tím ánh kim.
- Trên mơi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím. - Trên mơi trường Endo, SS tạo khĩm hồng đỏ.
- Trên các mơi trường đường: Lên men lactose sinh hơi, glucose, galactose. Lên men khơng đều saccarose và khơng lên men dextrin, glycogen.
- Các phản ứng sinh hĩa: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, , Lysine decarboxylase dương tính.
E. coli 157:H7 E. coli
Hình 2.10: Giới thiệu về hình thái Escherichia coli [44], [45], [46] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2.2. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố
Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng.
Độc tố của E.coli: Loại E.coli cĩ giáp mơ (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn loại khơng giáp mơ. Kháng nguyên K cĩ 13 loại KA, KB, KL. Ví dụ cơng thức kháng nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.
Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và khơng chịu nhiệt. Cả hai loại này đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb. Loại khơng chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.
Những dịng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau nhưng thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H12, O157.
2.3.2.3. Một số bệnh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc và gia cầm [49]
Bệnh gây cho gà
Nguyên nhân: Do vi khuẩn E.coli gây ra.
Phương thức lây truyền:
Lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh. Lây qua đường hơ hấp hoặc da, niêm mạc.
Lây qua vỏ trứng do nhiễm bẩn từ phân hoặc mơi trường của chuồng trại bị nhiễm trùng.
Lây qua thức ăn, nước uống bị nhiễm trùng.
Triệu chứng và bệnh tích:
Gà con mới nở: Rốn viêm, ướt, cĩ màu xanh. Bụng sưng to, lịng đỏ khơng tiêu. Tiêu chảy.
Gà con từ 1-5 tuần tuổi: gà sốt cao, uống nhiều nước, khĩ thở, bỏ ăn, sưng mặt, viêm kết mạc mắt. Viêm màng bao tim, viêm màng bụng, viêm màng quanh gan làm cho bao tim đục, màng bụng cĩ dịch viêm, quanh gan thường phủ một lớp Fibrin màu trắng đục. Viêm túi khí. Viêm phổi
Gà đẻ: giảm tỷ lệ đẻ, gà ăn kém, gầy ốm dần, một số con cĩ dấu hiệu viêm khớp. Mổ khám cho thấy: ống dẫn trứng bị viêm, lách và gan thường sưng to và sung huyết
Gan sưng to sung huyết Viêm phổi Hình 2.11: Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà [49]
Bệnh gây cho heo:
Bệnh nhiễm trùng huyết do E.coli ở heo con
Nguyên nhân : thường xảy ra ở các đàn khơng ấm áp, vệ sinh kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, nước uống khơng tốt, sữa mẹ kém làm giảm hoặc mất nhu động ruột, cĩ thể do thiếu máu, thiếu vitamin (A, PP, B5…). Vi khuẩn E.coli sẽ xâm nhập và nhân lên trong ruột, vào máu và gây nhiễm trùng máu.
Triệu chứng:Heo bị nhiễm bệnh trong vịng 12h sau khi sanh và cĩ thể chết trong vịng 48 giờ với các biểu hiện sau: Heo bệnh lười vận động, đứng riêng ra khỏi đàn, ủ rũ, đuơi rũ xuống hơng. Đơi khi ĩi mửa, run rẩy và cĩ thể chết sau khi hơn mê, co giật (tỷ lệ chết cĩ thể 80-90%).
Bệnh tích: Viêm màng ngồi và van tim, sung huyết thận, lá lách, cĩ thể viêm da và khớp.
Bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con: Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn heo con sơ sinh đến giai đoạn cai.
Nguyên nhân: Bệnh xảy ra ở các đàn úm khơng đủ ấm, vệ sinh chuồng và thức ăn nước uống kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, sữa mẹ kém, thiếu máu, thiếu vitamin. Bệnh thường kết hợp nhiệt độ quá thấp, mưa lạnh, ẩm ướt, stress…
Triệu chứng:Heo tiêu chảy phân màu vàng trắng, trắng xám, về sau cĩ màu vàng xanh, mùi hơi. Heo mất nước, gầy sút nhanh, bú kém, đi lại khơng vững và nơn ra sữa đơng khơng tiêu. Heo con bệnh yếu đi rất nhanh nếu khơng điều trị kiệp thời thì heo yếu dần, lơng xù và chết (tỷ lệ chết cĩ thể lên đến 80-90%).
Bệnh tích: Cơ thể mất nước, ốm, phân dính bết vào hậu mơn. Mạch máu ruột và hạch ruột sung huyết cấp tính. Ít thấy viêm dạ dày ruột xuất huyết, dạ dày chứa sữa khơng tiêu.
Heo con bị tiêu chảy phân trắng Heo con yếu dần rồi chết Hình 2.12: Aûnh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con [49]
Bệnh phù thủng trên heo cai sữa: Bệnh thường xảy ra trên
heo cai sữa hoặc sau cai sữa 1-3 tuần tuổi. Bệnh thường xảy ra trên những con lớn nhất đàn sau lây qua những con khác.
Nguyên nhân: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do chuồng trại vệ sinh không tốt, ẩm thấp.
E.coli có sẵn trong cơ thể kết hợp với stress khi tách mẹ thì sẽ nhân lên nhanh trong ruột. Thay đổi thức ăn đột ngột, heo con không còn được bú do đó sẽ ăn quá nhiều thức ăn dẫn đến không tiêu hóa hết thức ăn.
Sự sinh bệnh: vi khuẩn E.coli gây bệnh phát triển trong niêm mạc ruột làm sản sinh độc tố phá hủy mao mạch dẫn đến phù thủng khắp cơ thể.
Triệu chứng:
- Bệnh thường xảy ra đột ngột ở giai đoạn vài ngày đến một tuần sau cai sữa và trên heo lớn trội của bầy.
- Lúc mới nhiễm bệnh heo có dấu hiệu kém ăn, kém linh hoạt.
- Thể quá cấp heo chết đột ngột và trước khi chết có triệu chứng phù.
- Ở thể cấp tính, bệnh diễn biến 2-3 ngày. Ngày đầu heo bỏ ăn, sang ngày thứ 2 hoặc ngày thứ 3 có triệu chứng phù.
- Triệu chứng phù thủng xuất hiện chủ yếu ở vùng đầu như: mí mắt, vùng hầu, gốc tai, đôi khi sưng cả mặt.
- Phù não, não bị chèn ép bởi dịch thoát ra từ mạch máu nên gây nhũn não dẫn đến triệu chứng thần kinh như: co giật kiểu bơi chèo, đi xiêu vẹo, hay đâm đầu vào tường, đi lại không định hướng.
- Do thủy thủng ở thanh quản nên hay kêu khàn giống tiếng chim.
- Nhiệt độ không tăng, sung huyết ở niêm mạc và xanh tím ở tai, mõm, chóp đuôi…Heo rất khó thở trước khi chết.
Bệnh tích:
- Vùng mỡ liên kết dưới da bị thủy thủng.
- Hạch vùng bẹn, hạch ruột bị thủy thủng, xoang bụng chứa dịch phù, phù thủng ở màng trong ruột.
- Thủy thủng mí mắt, lỗ tai, ở quanh tim, thanh quản.
Bầy heo bệnh chỉ nằm và có tư thế ngồi kiểu chó
Phù thủng ở kết tràng và chứa nhiều dịch thủy thủng
Xuất huyết ruột non, phù màng treo ruột và sưng hạch màng treo ruột Hình 2.13: Aûnh hưởng của bệnh phù thủng trên heo cai sữa [49]
Chương 3: Vật Liệu & Phương Pháp Nghiên Cứu 3.1. Vật liệu
3.1.1. Địa điểm thực hiện đồ án
Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Phòng 15: phòng thí nghiệm hóa Phòng 14: phòng thí nghiệm vi sinh Phòng 9 : phòng thí nghiệm thực vật
3.1.2. Giống vi sinh vật
Vi khuẩn lên men lactic do sinh viên Nguyễn Thị Bích Thùy cung cấp từ kết quả của đồ án tốt nghiệp khóa 05 - lớp 05DSH - Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học – Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM: “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”
Vi khuẩn E.coli M15 được cung cấp từ Đại Học Y dược TP HCM. Bảng 3.1: Các chủng được kiểm tra hoạt tính probiotic
Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân
lập
Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1a, S1b
Sữa để chua tự nhiên 2 S2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sữa để chua tự nhiên 3 S3
Sữa để chua tự nhiên 4 S4
Kefir lên men từ PTN 1 S5
Kefir lên men từ PTN 2 S6
Nem Nem 1 N1
Nem 3 N3
Nem 4 N4
Nem 5 N5
Dưa muối Dưa muối 2 D2
Dưa muối 3 D3
Cà muối chua Cà muối C1
Chế phẩm dược Biolactyl T1a,T1b, T1c Biosubtyl DL T2c L-Bio-M T3c Lactomin plus T4c Probio T7b Ybio T8b
- Thành phần vi sinh trong 1 gói chế phẩm gồm: + L-Bio: Lactobacillus acidophilus
+ Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic.
+ L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus.
+ Probio: Lactobacillus acidophilus.
+ Ybio: Lactobacillus acidophilus.
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Môi trường
Môi trường Pepton Water: tăng sinh khối vi khuẩn E.coli
Môi trường TSA (Tripton soya agar): giữ giống vi khuẩn E.coli
Môi trường BHI (Brain Heart Infusion ): môi trường phát triển của E.coli
sử dụng trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB BHI Broth 1000ml
Beef heart infusion...250.0g Calf brain in fusion...200.0g Proteose peptone...10.0g NaCl...5.0g Na2HPO4.12H2O...2.5g Glucose...2.0g
pH 7.4 ± 0.2, 250C BHI thạch, bổ sung 2% agar
Môi trường MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) Broth: môi trường tăng sinh LAB MRS Broth 1000ml Glucose...20.0g Peptone...10.0g Beef extract...8.0g Yeast extract...4.0g CH3COONa...3.0g K2HPO4.3H2O...2,623g Mg2SO4.7H2O...0.2g MnSO4.4H2O...0.03786g Triamonium citrate...4.0g Tween 80...1ml Môi trường MRS thạch: môi trường trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB: MRS lỏng bổ sung 2% agar.
3.1.3.2. Hóa chất
Cồn 700, 960 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các hóa chất pha môi trường dinh dưỡng
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị3.1.4.1. Dụng cụ 3.1.4.1. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Ống nghiệm không nắp Đĩa petri Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Đầu típ 100 µl, 1000 µl Ống ly tâm eppendorf Ống đục lỗ Giấy thấm
Que cấy, que gắp, que tăm bông, que trang Thước đo cm, mm
Đũa thủy tinh
Giá để ống nghiệm, rổ nhựa Bông thấm nước
Bông không thấm nước
Bao nilon hấp, dây thun, giấy gói
3.1.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ sấy (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba
Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo quang (Hach)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo pH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)
Máy nước cất (Branstead USA)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật
Chuẩn bị giống vi khuẩn lên men lactic:
• Giống vi khuẩn lên men lactic được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường MRS lỏng
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy LAB:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa MRS lỏng. Quấn parafin quanh miệng ống nghiệm để nuôi cấy kị khí.
Đem ủ ở 370C từ 16-24h.
Chuẩn bị giống E.coli:
• Giống LAB được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường Peptone Water
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml Peptone Water. Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy E.coli tăng sinh khối:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa Peptone Water. Đem ủ hiếu khí 24h, 370C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng E.coli sau khi nuôi cấy qua đêm pha loãng 10-2 ( tương đương 10-5
tb/ml) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic.
3.2.2. Chuẩn bị môi trường test
Môi trường BHI agar (2%), Môi trường MRS agar (2%): Pha môi trường thêm agar 2% trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều, cho vào bình Erlen. Làm nút bông, bịt lại bằng nilon hoặc giấy bạc.
Đĩa petri, rửa sạch, sấy khô, gói giấy, bỏ bịch.
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Đổ đĩa khi môi trường ở 60-700C, mỗi đĩa đổ khoảng 15ml
Để agar đông, bỏ vào tủ ủ qua đêm để kiểm tra và loại bỏ đĩa bị nhiễm.
Bảo quản trong tủ lạnh 40C.
Trước khi sử dụng bỏ vào sấy 600C, 15p
Môi trường BHI lỏng (0.7%)
Pha môi trường thêm agar 0.7 % trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều.
Phối vào 7ml/ ống nghiệm.
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
Môi trường peptone water Pha môi trường
Phối 8ml/ống nghiệm
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
3.2.3.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Nguyên tắc: dựa vào sự đối kháng trực tiếp giữa vi khuẩn lên men lactic và vi khuẩn chỉ thị. Tạo điều kiện môi trường thích hợp cho cả hai vi khuẩn phát triển.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa môi trường MRS agar, sấy khô ở 600C.
Môi trường BHI (0.7% agar) giữ ở nhiệt độ 500C Thước đo vòng kháng (cm, mm)
Cách thực hiện như sau: Đổ đĩa mt MRS (2% agar) Nhỏ 10µl LAB (nuôi cấy kị khí 24h,
370C) lên mặt thạch ủ (1)
E.coli nuôi cấy tăng sinh qua 21h Hút 1ml dịch nuôi cấy vào 7ml
BHI (0.7% agar). (2)
Đổ hỗn hợp VK chỉ thị + BHI agar (2) lên bề mặt thạch MRS (1)
Ủ hiếu khí 24-48h, 370C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
Đối chứng: thay vì giọt dịch chứa LAB, giọt MRS lỏng. Làm đối chứng