Vi khuẩn lên men lactic do sinh viên Nguyễn Thị Bích Thùy cung cấp từ kết quả của đồ án tốt nghiệp khóa 05 - lớp 05DSH - Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học – Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM: “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”
Vi khuẩn E.coli M15 được cung cấp từ Đại Học Y dược TP HCM. Bảng 3.1: Các chủng được kiểm tra hoạt tính probiotic
Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân
lập
Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1a, S1b
Sữa để chua tự nhiên 2 S2
Sữa để chua tự nhiên 3 S3
Sữa để chua tự nhiên 4 S4
Kefir lên men từ PTN 1 S5
Kefir lên men từ PTN 2 S6
Nem Nem 1 N1
Nem 3 N3
Nem 4 N4
Nem 5 N5
Dưa muối Dưa muối 2 D2
Dưa muối 3 D3
Cà muối chua Cà muối C1
Chế phẩm dược Biolactyl T1a,T1b, T1c Biosubtyl DL T2c L-Bio-M T3c Lactomin plus T4c Probio T7b Ybio T8b
- Thành phần vi sinh trong 1 gói chế phẩm gồm: + L-Bio: Lactobacillus acidophilus
+ Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic.
+ L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis.
+ Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus.
+ Probio: Lactobacillus acidophilus.
+ Ybio: Lactobacillus acidophilus.
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Môi trường
Môi trường Pepton Water: tăng sinh khối vi khuẩn E.coli
Môi trường TSA (Tripton soya agar): giữ giống vi khuẩn E.coli
Môi trường BHI (Brain Heart Infusion ): môi trường phát triển của E.coli
sử dụng trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB BHI Broth 1000ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Beef heart infusion...250.0g Calf brain in fusion...200.0g Proteose peptone...10.0g NaCl...5.0g Na2HPO4.12H2O...2.5g Glucose...2.0g
pH 7.4 ± 0.2, 250C BHI thạch, bổ sung 2% agar
Môi trường MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) Broth: môi trường tăng sinh LAB MRS Broth 1000ml Glucose...20.0g Peptone...10.0g Beef extract...8.0g Yeast extract...4.0g CH3COONa...3.0g K2HPO4.3H2O...2,623g Mg2SO4.7H2O...0.2g MnSO4.4H2O...0.03786g Triamonium citrate...4.0g Tween 80...1ml Môi trường MRS thạch: môi trường trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn của LAB: MRS lỏng bổ sung 2% agar.
3.1.3.2. Hóa chất
Cồn 700, 960
Các hóa chất pha môi trường dinh dưỡng
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị3.1.4.1. Dụng cụ 3.1.4.1. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Ống nghiệm không nắp Đĩa petri Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Đầu típ 100 µl, 1000 µl Ống ly tâm eppendorf Ống đục lỗ Giấy thấm
Que cấy, que gắp, que tăm bông, que trang Thước đo cm, mm
Đũa thủy tinh
Giá để ống nghiệm, rổ nhựa Bông thấm nước
Bông không thấm nước
Bao nilon hấp, dây thun, giấy gói
3.1.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ sấy (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba
Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo quang (Hach)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo pH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)
Máy nước cất (Branstead USA)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật
Chuẩn bị giống vi khuẩn lên men lactic:
• Giống vi khuẩn lên men lactic được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường MRS lỏng
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy LAB:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa MRS lỏng. Quấn parafin quanh miệng ống nghiệm để nuôi cấy kị khí.
Đem ủ ở 370C từ 16-24h.
Chuẩn bị giống E.coli:
• Giống LAB được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường Peptone Water
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml Peptone Water. Đậy nắp hoặc làm nút bông, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuôi cấy E.coli tăng sinh khối:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa Peptone Water. Đem ủ hiếu khí 24h, 370C
Sử dụng E.coli sau khi nuôi cấy qua đêm pha loãng 10-2 ( tương đương 10-5
tb/ml) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic.
3.2.2. Chuẩn bị môi trường test
Môi trường BHI agar (2%), Môi trường MRS agar (2%): Pha môi trường thêm agar 2% trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều, cho vào bình Erlen. Làm nút bông, bịt lại bằng nilon hoặc giấy bạc.
Đĩa petri, rửa sạch, sấy khô, gói giấy, bỏ bịch.
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Đổ đĩa khi môi trường ở 60-700C, mỗi đĩa đổ khoảng 15ml
Để agar đông, bỏ vào tủ ủ qua đêm để kiểm tra và loại bỏ đĩa bị nhiễm.
Bảo quản trong tủ lạnh 40C.
Trước khi sử dụng bỏ vào sấy 600C, 15p
Môi trường BHI lỏng (0.7%)
Pha môi trường thêm agar 0.7 % trên mỗi lít môi trường. Đun sôi môi trường cho agar tan đều.
Phối vào 7ml/ ống nghiệm.
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
Môi trường peptone water Pha môi trường
Phối 8ml/ống nghiệm
Làm nút bông hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
3.2.3.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Nguyên tắc: dựa vào sự đối kháng trực tiếp giữa vi khuẩn lên men lactic và vi khuẩn chỉ thị. Tạo điều kiện môi trường thích hợp cho cả hai vi khuẩn phát triển.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa môi trường MRS agar, sấy khô ở 600C.
Môi trường BHI (0.7% agar) giữ ở nhiệt độ 500C Thước đo vòng kháng (cm, mm)
Cách thực hiện như sau: Đổ đĩa mt MRS (2% agar) Nhỏ 10µl LAB (nuôi cấy kị khí 24h, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
370C) lên mặt thạch ủ (1)
E.coli nuôi cấy tăng sinh qua 21h Hút 1ml dịch nuôi cấy vào 7ml
BHI (0.7% agar). (2)
Đổ hỗn hợp VK chỉ thị + BHI agar (2) lên bề mặt thạch MRS (1)
Ủ hiếu khí 24-48h, 370C
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
Đối chứng: thay vì giọt dịch chứa LAB, giọt MRS lỏng. Làm đối chứng không có sự đối kháng.
3.2.3.2. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch)
Nguyên tắc: Dựa trên sự đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lên men lactic với vi khuẩn chỉ thị ngay tại vị trí nhỏ vi khuẩn lên men lactic.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa môi trường BHI agar, sấy khô ở 600C.
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli môi trường BHI agar (2%) Nhỏ 10µl dịch nuôi cấy LAB lên bề mặt đĩa
Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
Đối chứng: nhỏ giọt môi trường MRS lỏng lên đĩa, đánh dấu vị trí. So sánh với các vị trí giọt chứa LAB.
3.2.3.3. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng
phương pháp disc diffusion assay (khuếch tán qua vòng giấy lọc)
Chuẩn bị: Giấy lọc đường kính 8mm
Môi trường Peptone water 8ml mỗi ống nghiệm
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Cách thực hiện:
Đổ đĩa mt BHI agar (2%) Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli
Ly tâm dịch nuôi cấy LAB Cho 20µl dịch ly tâm Đặt giấy thấm
Ủ hiếu khí 24h, 370C
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng
LAB sau khi nuôi cấy trong MRS lỏng qua đêm 18-24h, lấy 1,2ml dịch nuôi cấy cho vào ống effendorf, đem ly tâm 14000prm trong 10 phút.
Đặt năm miếng giấy thấm trên bề mặt agar.
Đối chứng: miếng ở trung tâm chỉ thấm vào MRS broth Giấy thấm phải được khử trùng trước khi sử dụng.
Dùng kẹp khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn để gắp giấy thấm.
3.2.3.4. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phương pháp Agar well diffusion assay (khuếch tán qua giếng thạch)
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha loãng 10-1, 10-2 được nồng độ sử dụng là 105-106 tế bào/ml. Khảo sát hai nồng độ này
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C. Đem ly tâm 14000 vòng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Khảo sát độ dày môi trường là 5mm tương ứng với 25ml môi trường/đĩa, 3mm tương ứng với 15ml môi trường/đĩa.
Cách thực hiện:
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli môi trường BHI agar (2%) Đục lổ trên thạch đường kính 8mm
Lấy 0.1ml dịch nuôi cấy LAB (nuôi cấy kị khí 24h, 370C) vào lỗ. Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h
Kiểm tra sự tạo vòng kháng. Đo đường kính vòng kháng Quá trình đục lỗ: Mở nắp đĩa petri, dùng ống đồng đường kính 8mm, khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, đục 5 lỗ trên thạch. Lấy que gắp, khử trùng, để nguội, gắp thạch ra khỏi tạo giếng thạch. Hơ khử trùng nắp petri, đậy nắp petri.
Đối chứng: giếng ở trung tâm đĩa, cho 0.1ml MRS broth để đối chứng.
3.2.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phươngpháp Turbidometricassay (đo độ đục) pháp Turbidometricassay (đo độ đục)
Nguyên tắc của phương pháp đo độ đục: Bằng máy quang phổ đo mật độ tế bào vi sinh vật có trong dịch nuôi cấy ở bước sóng 600nm.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị
E.coli bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
Nghiệm thức 2: xác định hoạt tính trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị
E.coli bằng các chất được sinh ra trong quá trình phát triển của các chủng LAB nhưng đã loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C.
Nghiệm thức 1: Đem ly tâm dịch nuôi cấy LAB 14000 vòng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Nghiệm thức 2: Trung hòa dịch nuôi cấy về pH 6 bằng NaOH 1N, tiến hành thanh trùng 800C trong 10 phút. Đem ly tâm 14000 vòng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Công thức tính như sau: %OD=ODODdc×100
Với: OD: là giá trị đo OD của ống có chứa hợp chất kháng khuẩn.
ODdc: là giá trị đo OD của ống đối chứng không có chứa hợp chất kháng khuẩn.
Cách thực hiện:
tăng sinh qua 24h, pha loãng 10-2
Lấy 1ml 1ml dịch ly tâm LAB
Cho vào 8ml BHI+1ml MRS Broth Ủ hiếu khí 24h, 370C
Đo OD
Cho vào 8ml BHI Ủ hiếu khí 24h, 370C Đo OD So sánh độ đục, kết luận Có thể lập theo bảng sau: Nghiệm Thức 1 Nghiệm Thức 2 Ống kiểm tra hoạt tính
1ml dịch nuôi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+
1ml dịch ly tâm môi trường nuôi cấy LAB sau 18-24h.
+
8ml môi trường peptone water.
1ml dịch nuôi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml.
+
1ml dịch ly tâm đã trung hòa acid bằng NaOH 1N.
+
8ml môi trường peptone water. Ống
đối chứng
1ml dịch nuôi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml. +
1ml MRS lỏng +
Chương 4: Kết Quả và Biện Luận
4.1. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Phương pháp này có dạng giống chiếc bánh Sandwich với 2 mặt kẹp là môi trường MRS agar và BHI agar, khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp giữa chúng với vi khuẩn lactic. Theo nghiên cứu của Carherine B. Lewus và Thomas J. Montville (1991) vòng kháng khuẩn thể hiện rất rõ ràng với khả năng lặp lại cao và nhanh chóng. Cho đến gần đây, Bilge H. Cadirci và Sumru Citak (2005) nhận đđịnh rằng phương pháp này dường như cho kết quả tốt nhất. Tuy nhiên, hoạt tính kháng vi sinh vật ở đây là hoạt tính tổng hợp của tất cả các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic như: acid lactic, acid acetic, diacetyl, bacteriocin…Vì vậy, để xác định hoạt tính riêng của từng chất kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic cần có các phương pháp bổ sung. Khi thực hiện phương pháp này một số khó khăn thường gặp là:
- Để thực hiện kiểm tra, ta phải trải một lớp mỏng môi trường MRS, rồi nhỏ một lượng nhỏ vi khuẩn LAB lên trên bề mặt agar. Sau đó, nhỏ tiếp 1 giọt môi trường BHI (0,7% agar) lên trên vi khuẩn lactic để cố định chúng trên bề mặt thạch. Nếu lượng môi trường BHI nhỏ lên quá lớn sẽ rửa trôi vi khuẩn lactic.
- Để trải một lớp mỏng môi trường BHI 0,7 % agar chứa vi khuẩn chỉ thị E. coli lên trên bề mặt MRS agar đã nhỏ vi khuẩn lactic, ta cần hóa lỏng môi trường BHI ở nhiệt độ 500 C. Ở nhiệt độ này, E.coli dễ bị tổn thương và BHI dễ hòa lẫn với MRS agar. Ngược lại, nếu hạ nhiệt độ thấp hơn, môi trường dễ đông, không tạo được lớp mỏng đều trên MRS agar như mong muốn.
- BHI agar từ ống nghiệm được chuyển sang đĩa petri bằng cách rót trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn hay bào tử từ không khí rất cao.
- MRS agar sau khi đổ đĩa sấy khô 15 phút để bề mặt đĩa khô, không bị đọng nước tránh bị nhiễm do nước.
Qua thử nghiệm phương pháp này, vì những khó khăn gặp phải cũng như điều kiện tại phòng thí nghiệm không thuận lợi để thực hiện, phương pháp này bị tạm ngưng để tiến hành phương pháp khác.
4.2. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch)
Tương tự như phương pháp trên, đây là phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp giữa chúng với vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, ở đây môi trường BHI được trải trước lên đĩa Petri và cấy giống vi sinh vật chỉ thị. Ngày hôm sau vi khuẩn lactic nuôi trước trong môi trường MRS mới được nhỏ lên mặt thạch sẽ tạo vòng kháng khuẩn xung quanh giọt vi khuẩn lactic. Tương tự như phương pháp thứ nhất, phương pháp này cũng nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tất cả các sản phẩm của quá trình trao đổi chất nhưng quy trình thử nghiệm đơn giản hơn. Tuy nhiên vẫn gặp khó khăn là:
- Khi lượng vi khuẩn lactic quá ít sẽ không đủ ức chế vi sinh vật chỉ thị - Lượng vi khuẩn lactic quá lớn sẽ tràn trên mặt thạch hòa lẫn với
E.coli nên không nhận được kết quả kháng.
Như vậy đối với phương pháp 1 và 2 nồng độ vi khuẩn lactic trong dung dịch MRS và nồng độ vi sinh vật chỉ thị cần được tối ưu hóa để đạt kết quả thử nghiệm mong muốn.
C1
Dịch nhỏ LAB bị tràn trên bề mặt thạch N3
Lượng nhỏ LAB quá ít
T7b
Lượng nhỏ LAB quá ít (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
T8b
Dịch nhỏ LAB bị trần trên bề mặt thạch Hình 4.1: Thử nghiệm không thành công phương pháp Agar spot test Như vậy, tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ, phương pháp này bị tạm ngưng để tiến hành phương pháp khác.
4.3. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc diffusion assay (khuếch tán qua vòng giấy lọc)
Khác với hai phương pháp trên, trong phương pháp này vi khuẩn lactic không đối kháng trực tiếp vi sinh vật chỉ thị mà chỉ có sản phẩm trao đổi
chất của chúng khuếch tán qua môi trường thạch ảnh hưởng lên tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị. Trong tài liệu phương pháp này thường được tiến hành song song với một trong những phương pháp trên.
Áp dụng phương pháp này ta có thể tách rời ảnh hưởng của từng