3.1.4.1. Dụng cụ Ống nghiệm cĩ nắp Ống nghiệm khơng nắp Đĩa petri Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Đầu típ 100 µl, 1000 µl Ống ly tâm eppendorf Ống đục lỗ Giấy thấm
Que cấy, que gắp, que tăm bơng, que trang Thước đo cm, mm
Đũa thủy tinh
Giá để ống nghiệm, rổ nhựa Bơng thấm nước
Bơng khơng thấm nước
Bao nilon hấp, dây thun, giấy gĩi
3.1.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ sấy (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba
Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo quang (Hach)
Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo pH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)
Máy nước cất (Branstead USA)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật
Chuẩn bị giống vi khuẩn lên men lactic:
• Giống vi khuẩn lên men lactic được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị mơi trường: Pha mơi trường MRS lỏng
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy nắp hoặc làm nút bơng, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuơi cấy LAB:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa MRS lỏng. Quấn parafin quanh miệng ống nghiệm để nuơi cấy kị khí.
Đem ủ ở 370C từ 16-24h.
Chuẩn bị giống E.coli:
• Giống LAB được cung cấp từ ống nghiệm thạch nghiệm MRS agar, được bảo quản trong tủ lạnh 40C.
• Chuẩn bị mơi trường: Pha mơi trường Peptone Water
Phối vào mỗi ống nghiệm 10ml Peptone Water. Đậy nắp hoặc làm nút bơng, cho vào bịch hấp
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave1200C, 15 phút, 1 atm • Nuơi cấy E.coli tăng sinh khối:
Mọi thao tác được thực hiện sau khi đã sát trùng dụng cụ, tủ cấy, vào tháo tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
Lấy sinh khối, cấy chuyển vào ống nghiệm chứa Peptone Water. Đem ủ hiếu khí 24h, 370C
Sử dụng E.coli sau khi nuơi cấy qua đêm pha lỗng 10-2 ( tương đương 10-5
tb/ml) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic.
3.2.2. Chuẩn bị mơi trường test
Mơi trường BHI agar (2%), Mơi trường MRS agar (2%): Pha mơi trường thêm agar 2% trên mỗi lít mơi trường. Đun sơi mơi trường cho agar tan đều, cho vào bình Erlen. Làm nút bơng, bịt lại bằng nilon hoặc giấy bạc.
Đĩa petri, rửa sạch, sấy khơ, gĩi giấy, bỏ bịch.
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Đổ đĩa khi mơi trường ở 60-700C, mỗi đĩa đổ khoảng 15ml
Để agar đơng, bỏ vào tủ ủ qua đêm để kiểm tra và loại bỏ đĩa bị nhiễm.
Bảo quản trong tủ lạnh 40C.
Trước khi sử dụng bỏ vào sấy 600C, 15p
Mơi trường BHI lỏng (0.7%)
Pha mơi trường thêm agar 0.7 % trên mỗi lít mơi trường. Đun sơi mơi trường cho agar tan đều.
Phối vào 7ml/ ống nghiệm.
Làm nút bơng hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
Mơi trường peptone water Pha mơi trường
Phối 8ml/ống nghiệm
Làm nút bơng hoặc đậy nắp ống nghiệm
Đem hấp khử trùng bằng Autoclave, 1200C, 15 phút, 1 atm. Để nguội, bảo quản ở tủ lạnh 40C.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
3.2.3.1. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Nguyên tắc: dựa vào sự đối kháng trực tiếp giữa vi khuẩn lên men lactic và vi khuẩn chỉ thị. Tạo điều kiện mơi trường thích hợp cho cả hai vi khuẩn phát triển.
Chuẩn bị: Dịch nuơi cấy E.coli qua 21h. Pha lỗng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuơi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa mơi trường MRS agar, sấy khơ ở 600C.
Mơi trường BHI (0.7% agar) giữ ở nhiệt độ 500C Thước đo vịng kháng (cm, mm)
Cách thực hiện như sau: Đổ đĩa mt MRS (2% agar) Nhỏ 10µl LAB (nuơi cấy kị khí 24h,
370C) lên mặt thạch ủ (1)
E.coli nuơi cấy tăng sinh qua 21h Hút 1ml dịch nuơi cấy vào 7ml
BHI (0.7% agar). (2)
Đổ hỗn hợp VK chỉ thị + BHI agar (2) lên bề mặt thạch MRS (1)
Ủ hiếu khí 24-48h, 370C
Kiểm tra sự tạo vịng kháng. Đo đường kính vịng kháng
Đối chứng: thay vì giọt dịch chứa LAB, giọt MRS lỏng. Làm đối chứng khơng cĩ sự đối kháng.
3.2.3.2. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch)
Nguyên tắc: Dựa trên sự đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lên men lactic với vi khuẩn chỉ thị ngay tại vị trí nhỏ vi khuẩn lên men lactic.
Chuẩn bị: Dịch nuơi cấy E.coli qua 21h. Pha lỗng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuơi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Đĩa mơi trường BHI agar, sấy khơ ở 600C.
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli mơi trường BHI agar (2%) Nhỏ 10µl dịch nuơi cấy LAB lên bề mặt đĩa
Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h
Kiểm tra sự tạo vịng kháng. Đo đường kính vịng kháng
Đối chứng: nhỏ giọt mơi trường MRS lỏng lên đĩa, đánh dấu vị trí. So sánh với các vị trí giọt chứa LAB.
3.2.3.3. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng
phương pháp disc diffusion assay (khuếch tán qua vịng giấy lọc)
Chuẩn bị: Giấy lọc đường kính 8mm
Mơi trường Peptone water 8ml mỗi ống nghiệm
Dịch nuơi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha lỗng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuơi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C Cách thực hiện:
Đổ đĩa mt BHI agar (2%) Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli
Ly tâm dịch nuơi cấy LAB Cho 20µl dịch ly tâm Đặt giấy thấm
Ủ hiếu khí 24h, 370C
Kiểm tra sự tạo vịng kháng. Đo đường kính vịng kháng
LAB sau khi nuơi cấy trong MRS lỏng qua đêm 18-24h, lấy 1,2ml dịch nuơi cấy cho vào ống effendorf, đem ly tâm 14000prm trong 10 phút.
Đặt năm miếng giấy thấm trên bề mặt agar.
Đối chứng: miếng ở trung tâm chỉ thấm vào MRS broth Giấy thấm phải được khử trùng trước khi sử dụng.
Dùng kẹp khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn để gắp giấy thấm.
3.2.3.4. Thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng bằng
phương pháp Agar well diffusion assay (khuếch tán qua giếng thạch)
Chuẩn bị: Dịch nuơi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha lỗng 10-1, 10-2 được nồng độ sử dụng là 105-106 tế bào/ml. Khảo sát hai nồng độ này
Dịch nuơi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C. Đem ly tâm 14000 vịng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Khảo sát độ dày mơi trường là 5mm tương ứng với 25ml mơi trường/đĩa, 3mm tương ứng với 15ml mơi trường/đĩa.
Cách thực hiện:
Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli mơi trường BHI agar (2%) Đục lổ trên thạch đường kính 8mm
Lấy 0.1ml dịch nuơi cấy LAB (nuơi cấy kị khí 24h, 370C) vào lỗ. Ủ hiếu khí, 370C, 18-24h
Kiểm tra sự tạo vịng kháng. Đo đường kính vịng kháng Quá trình đục lỗ: Mở nắp đĩa petri, dùng ống đồng đường kính 8mm, khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, đục 5 lỗ trên thạch. Lấy que gắp, khử trùng, để nguội, gắp thạch ra khỏi tạo giếng thạch. Hơ khử trùng nắp petri, đậy nắp petri.
Đối chứng: giếng ở trung tâm đĩa, cho 0.1ml MRS broth để đối chứng.
3.2.3.4 Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phươngpháp Turbidometricassay (đo độ đục) pháp Turbidometricassay (đo độ đục)
Nguyên tắc của phương pháp đo độ đục: Bằng máy quang phổ đo mật độ tế bào vi sinh vật cĩ trong dịch nuơi cấy ở bước sĩng 600nm.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị
E.coli bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
Nghiệm thức 2: xác định hoạt tính trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị
E.coli bằng các chất được sinh ra trong quá trình phát triển của các chủng LAB nhưng đã loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hịa bằng dung dịch NaOH 1N.
Chuẩn bị: Dịch nuơi cấy E.coli (21h, 370C) . Pha lỗng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ml
Dịch nuơi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C.
Nghiệm thức 1: Đem ly tâm dịch nuơi cấy LAB 14000 vịng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Nghiệm thức 2: Trung hịa dịch nuơi cấy về pH 6 bằng NaOH 1N, tiến hành thanh trùng 800C trong 10 phút. Đem ly tâm 14000 vịng/ phút, trong 10 phút. Loại bỏ sinh khối.
Cơng thức tính như sau: %OD=ODODdc×100
Với: OD: là giá trị đo OD của ống cĩ chứa hợp chất kháng khuẩn.
ODdc: là giá trị đo OD của ống đối chứng khơng cĩ chứa hợp chất kháng khuẩn.
Cách thực hiện:
tăng sinh qua 24h, pha lỗng 10-2
Lấy 1ml 1ml dịch ly tâm LAB
Cho vào 8ml BHI+1ml MRS Broth Ủ hiếu khí 24h, 370C
Đo OD
Cho vào 8ml BHI Ủ hiếu khí 24h, 370C Đo OD So sánh độ đục, kết luận Cĩ thể lập theo bảng sau: Nghiệm Thức 1 Nghiệm Thức 2 Ống kiểm tra hoạt tính
1ml dịch nuơi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml.
+
1ml dịch ly tâm mơi trường nuơi cấy LAB sau 18-24h.
+
8ml mơi trường peptone water.
1ml dịch nuơi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml.
+
1ml dịch ly tâm đã trung hịa acid bằng NaOH 1N.
+
8ml mơi trường peptone water. Ống
đối chứng
1ml dịch nuơi cấy E.coli qua 21h, nồng độ 105 tế bào/ml. +
1ml MRS lỏng +
Chương 4: Kết Quả và Biện Luận
4.1. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
Phương pháp này cĩ dạng giống chiếc bánh Sandwich với 2 mặt kẹp là mơi trường MRS agar và BHI agar, khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp giữa chúng với vi khuẩn lactic. Theo nghiên cứu của Carherine B. Lewus và Thomas J. Montville (1991) vịng kháng khuẩn thể hiện rất rõ ràng với khả năng lặp lại cao và nhanh chĩng. Cho đến gần đây, Bilge H. Cadirci và Sumru Citak (2005) nhận đđịnh rằng phương pháp này dường như cho kết quả tốt nhất. Tuy nhiên, hoạt tính kháng vi sinh vật ở đây là hoạt tính tổng hợp của tất cả các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic như: acid lactic, acid acetic, diacetyl, bacteriocin…Vì vậy, để xác định hoạt tính riêng của từng chất kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic cần cĩ các phương pháp bổ sung. Khi thực hiện phương pháp này một số khĩ khăn thường gặp là:
- Để thực hiện kiểm tra, ta phải trải một lớp mỏng mơi trường MRS, rồi nhỏ một lượng nhỏ vi khuẩn LAB lên trên bề mặt agar. Sau đĩ, nhỏ tiếp 1 giọt mơi trường BHI (0,7% agar) lên trên vi khuẩn lactic để cố định chúng trên bề mặt thạch. Nếu lượng mơi trường BHI nhỏ lên quá lớn sẽ rửa trơi vi khuẩn lactic.
- Để trải một lớp mỏng mơi trường BHI 0,7 % agar chứa vi khuẩn chỉ thị E. coli lên trên bề mặt MRS agar đã nhỏ vi khuẩn lactic, ta cần hĩa lỏng mơi trường BHI ở nhiệt độ 500 C. Ở nhiệt độ này, E.coli dễ bị tổn thương và BHI dễ hịa lẫn với MRS agar. Ngược lại, nếu hạ nhiệt độ thấp hơn, mơi trường dễ đơng, khơng tạo được lớp mỏng đều trên MRS agar như mong muốn.
- BHI agar từ ống nghiệm được chuyển sang đĩa petri bằng cách rĩt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn hay bào tử từ khơng khí rất cao.
- MRS agar sau khi đổ đĩa sấy khơ 15 phút để bề mặt đĩa khơ, khơng bị đọng nước tránh bị nhiễm do nước.
Qua thử nghiệm phương pháp này, vì những khĩ khăn gặp phải cũng như điều kiện tại phịng thí nghiệm khơng thuận lợi để thực hiện, phương pháp này bị tạm ngưng để tiến hành phương pháp khác.
4.2. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test (khuếch tán trên bề mặt thạch)
Tương tự như phương pháp trên, đây là phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp giữa chúng với vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, ở đây mơi trường BHI được trải trước lên đĩa Petri và cấy giống vi sinh vật chỉ thị. Ngày hơm sau vi khuẩn lactic nuơi trước trong mơi trường MRS mới được nhỏ lên mặt thạch sẽ tạo vịng kháng khuẩn xung quanh giọt vi khuẩn lactic. Tương tự như phương pháp thứ nhất, phương pháp này cũng nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tất cả các sản phẩm của quá trình trao đổi chất nhưng quy trình thử nghiệm đơn giản hơn. Tuy nhiên vẫn gặp khĩ khăn là:
- Khi lượng vi khuẩn lactic quá ít sẽ khơng đủ ức chế vi sinh vật chỉ thị - Lượng vi khuẩn lactic quá lớn sẽ tràn trên mặt thạch hịa lẫn với
E.coli nên khơng nhận được kết quả kháng.
Như vậy đối với phương pháp 1 và 2 nồng độ vi khuẩn lactic trong dung dịch MRS và nồng độ vi sinh vật chỉ thị cần được tối ưu hĩa để đạt kết quả thử nghiệm mong muốn.
C1
Dịch nhỏ LAB bị tràn trên bề mặt thạch N3
Lượng nhỏ LAB quá ít
T7b
Lượng nhỏ LAB quá ít
T8b
Dịch nhỏ LAB bị trần trên bề mặt thạch Hình 4.1: Thử nghiệm khơng thành cơng phương pháp Agar spot test Như vậy, tại phịng thí nghiệm trường Đại Học Kỹ Thuật Cơng Nghệ, phương pháp này bị tạm ngưng để tiến hành phương pháp khác.
4.3. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc diffusion assay (khuếch tán qua vịng giấy lọc)
Khác với hai phương pháp trên, trong phương pháp này vi khuẩn lactic khơng đối kháng trực tiếp vi sinh vật chỉ thị mà chỉ cĩ sản phẩm trao đổi
chất của chúng khuếch tán qua mơi trường thạch ảnh hưởng lên tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị. Trong tài liệu phương pháp này thường được tiến hành song song với một trong những phương pháp trên.
Áp dụng phương pháp này ta cĩ thể tách rời ảnh hưởng của từng yếu tố kháng khuẩn. Ví dụ như tác dụng kháng khuẩn của acid hữu cơ cĩ thể loại trừ nhờ trung hịa dịch nuơi cấy sau khi ly tâm loại bỏ tế bào; tác dụng của H2O2 được loại trừ nhờ xử lý dịch ly tâm với enzyme catalase…. Bằng cách đĩ cĩ thể đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp.
Khuếch tán qua vịng giấy lọc (disc diffusion assay) tương tự phương pháp của Kirby Bauer thường được sử dụng để kiểm tra tính mẫn của vi sinh vật đối với kháng sinh [9]. Vịng giấy thấm được đặt lên bề mặt đĩa Petri đã cấy vi sinh vật chỉ thị rồi thấm dịch nuơi cấy vi khuẩn lactic li tâm rồi. Tuy nhiên, khi thử nghiệm phương pháp này đã khơng thành cơng. Kết quả thể hiện theo như hình 4.4.
C1 T7b
Hình 4.2. Thử ngiệm khơng thành cơng phương pháp Disc diffusion assay Từ kết quả này cĩ một số nhận xét như sau:
Độ hấp thụ các chất kháng khuẩn thu được từ dịch ly tâm bị hạn chế ở mức 20µl, cho thấy lượng chất được dùng để thử hoạt tính là quá ít.
Các chất kháng khuẩn được thấm trong giấy lọc cĩ sự khuếch tán lên mơi trường thạch là khơng cao.
Cả hai nhận định này đều giải thích cho kết quả khơng thành cơng. Tuy phương pháp này cĩ khả năng tách riêng kiểm tra định tính các chất kháng khuẩn (acid lactic, H2O2, bacteriocin…), nhưng qua thử nghiệm nhận thấy nồng độ chất kháng khuẩn được sinh ra là khơng cao, và phương pháp này hạn chế về thể tích đưa vào giấy lọc. Vì vậy phương pháp khơng mang lại ý nghĩa cao trong việc tách riêng định tính từng chất.
Như vậy, tại phịng thí nghiệm trường Đại Học Kỹ Thuật Cơng Nghệ, phương pháp này bị tạm ngưng để tiến hành thử nghiệm phương pháp khác.
4.4. Kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar Well Diffusion Assay (khuếch tán qua giếng thạch)
Phương pháp Agar well diffusion assay hay cịn gọi là phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, vi sinh vật chỉ thị được trải một lớp mỏng trên bề mặt mơi trường BHI agar, cho dịch nuơi cấy LAB (cĩ thể lấy dịch ly tâm) vào giếng, ngay tại giếng chứa LAB phát triển và tiết các chất đối kháng