Vi khuẩn lên men lactic đồng hình
Lên men acid lactic đồng hình lượng acid lactic tạo nên chiếm trên 80% và được biểu diễn tĩm tắt bằng phương trình:
C6H12O6 2CH3-CHOH-COOH
Sự hình thành nên acid lactic trải qua hàng hoạt các giai đoạn trung gian với sự tham gia của các enzyme tương ứng. Giai đoạn đầu xảy ra quá trình hoạt hĩa hexose được phân cắt để hình thành triosephotphate. Chất này được chuyển thành acid pryruvic rồi thành acid lactic
Trong lên men lactic dị hình, tạo sản phẩm đa dạng ngồi acid lactic cịn cĩ hàng loạt sản phẩm phụ khác, các sản phẩm phụ và acid lactic được sinh ra với số lượng phân tử gam như nhau. Cụ thể là: acid lactic 40%, acid succinic và rượu etylic 20%, acid acetic 10% và các chất khí cịn lại 20%.
Sự đa dạng của sản phẩm tạo thành khi lên men lactic dị hình vì vi khuẩn thuộc nhĩm này cĩ nhiều hệ enzyme nên quá trình chuyển hĩa đường phức tạp hơn ở vi khuẩn lactic đồng hình
Khi nồng độ của acid lactic đạt 2-3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh khác, kể cả E.Coli.
Hình 2.8: Quá trình lên men lactic của LAB. (A): Lên men lactic đồng hình. (B): Lên men lactic dị hình [37]
Các enzyme trong quá trình: 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-dịposphate aldolase; 3. Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phophoketolase; 9. Acetaldhyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogennase.
2.2.3. Khả năng tổng hợp enzyme
Các vi khuẩn lactic cĩ khả năng tổng hợp một số lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thích hệ thống tiêu hĩa như: enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase.
Proteolysis (khả năng phân giải protein): vi sinh vật tổng hợp protease giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản cĩ thể tiêu hĩa được. Hoạt tính này của
Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ cĩ thể tiêu thu dễ dàng.
Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành những hợp chất đơn giản. Điều này cĩ thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli cĩ thể phân hủy Cholesterol.
Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic cĩ enzyme -galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase cs thể sản sinh acid lactic từ lactose. Acid lactic cĩ những lợi ích như sau:
• Chữa trị bệnh khơng dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡng lactose.
• Tăng cường khả năng tiêu hĩa protein trong sữa bằng việc làm đơng tụ protein trong sữa.
• Tăng cường việc sử dụng Calci, Phospho, Sắt. • Kích thích sự bài tiết.
• Kích thích sự tiêu hĩa trong dạ dày.
• Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hơ hấp.
2.2.4. Khả năng tổng hợp vitamin và các chất trao đổi cĩ lợi chosự tăng trưởng sự tăng trưởng
Vi khuẩn lên men lactic dùng làm probiotic đĩng vai trị nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin như: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K.
2.2.5. Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn
2.2.5.1. Bacteriocin [12], [13], [21], [38], [43]
Bacteriocin là những hợp chất cĩ bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và cĩ khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác cĩ liên hệ gần với giống
sản xuất. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:
• Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome • Tế bào chủ miễn dịch với chúng
• Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ cĩ khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn cĩ liên hệ gần với chủng sản xuất.
Cĩ rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đĩ lactic acid bacteria (LAB) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB cĩ phổ kháng khuẩn rộng và cĩ tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm.
Bacteriocin được LAB tổng hợp chia thành 4 lớp:
Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những amino acid hiếm và một số amino acid khử nước. Chịu được nhiệt, hoạt động ổn định trên cấu trúc màng. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phĩng thích phân tử peptide hoạt hĩa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, khơng chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp này được chia làm ba nhĩm:
IIA: peptides hoạt động chống lại Listeria spp. Trong nhĩm này cĩ pediocin PA-1.
IIB: hình thành bởi một phức tạp của hai peptide riêng biệt. Trong nhĩm này cĩ lactococcin G và plantaricins.
IIc: peptides nhỏ, bền với nhiệt, được vận chuyển của leader-peptides. Trong nhĩm này được tìm thấy loại bacteriocins: divergicin A và B. acidocin
Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) cĩ hoạt tính sinh lý của bacteriocin. Bacteriocin dạng này được thu nhận từ một số giống Lactobacillus .
Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngồi protein cịn cĩ thêm thành phần lipid và carbohydrate. Hiện nay vẫn cịn nhiều điều chưa biết về câu trúc và chứng năng của bacteriocin thuộc lớp này bì chưa cĩ phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch.
Hình 2.9: cơ chế kháng khuẩn của một số loại Bacteriocin [48] Giải thích:
Lớp I (Nisin): Dạng A Lanthibiotics gồm những phân tử lưỡng tính dài cĩ thể tiêu diệt các tế bào mẫn cảm bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất.
Lớp II (sakasin): Chúng mang điện dương trong mơi trường trung tính và chúng chứa một vùng kỵ nước và/hoặc một vùng lưỡng cực. Chúng cĩ thể làm thấm màng sinh chất tế bào đích.
Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào.
Bảng 2.7: Một số Bacteriocin và đặc điểm của chúng [22]
Lồi Bateriocin Phổ tác động Đặc điểm
Lactococcus lactis
subsp. lactis Nisin Vi khuẩn gram dương Lớp I: lantibiotic, 3.5 kDa, 34amino acids, Lacticin 3147 Clostridium sp
Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
Lớp I: cấu thành từ 2 lantibiotic, 4.2 kDa, bền với nhiệt.
Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Lactococcus lactis
subsp. cremoris Lactococcin B Lactobacillus Lớp II: khoảng 5 kDa, phổ tácđộng hẹp.
Lactobacillus acidphilus
Acidocin CH5 Vi khuẩn gram dương
Lactobacillus
Lớp II: cấu thành từ các phân tử khối lượng lớn.
Lactacin F Lactobacillus fermentum Enterococcus faecalis Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus
Lớp II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chịu được nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
Lactacin B Lactobacillus debrweckii Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis
Lớp III: 6.3 kDa, chịu được nhiệt, chỉ được tổng hợp khi nuơi cấy ở điều kiện pH 5.0-6.0
Lactobacillus
amylovorus Lactobin A Lactobacillus acidophilusLactobacillus debrweckii Lớp II: 4.8 kDa, 50 amino acid,phổ tác động hẹp.
Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogens
Lactobacillus plantarum Lớp II: cấu thành từ 2bacteriocin (mỗi bacteriocin 3.4 kDA, 33 amino acid) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus Enterococcus faecalis Listeria mơncytogenes
Lớp II: 3.9 kDa, 37 amino acid, ổn định ở pH thấp, chịu được 1000C ở 20 phút.
Leuconostoc
mesenteroides MesentericinY105 Enterococcus faecalisListeria monocytogenes Lớp II: 3.8 kDa, 37 amino acid,chịu được nhiệt độ 600C trong 120 phút ở pH 4.5
Peliococcus acidilactici
Pediocin F vi khuẩn gram dương Lớp II: 4.5 kDa, thuộc enzyme proteolytic, bền với nhiệt, hịa tan chất hữu cơ, hoạt động ở khoảng pH rộng.
Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Lớp II: 4.6 kDA, 44 amino acid.
Pediocin AcH Vi khuẩn gram âm và
gram dương Lớp II: 4.6 kDa, 44 amino acid,phổ tác động rộng.
Pediococcus
pentosaceous Pediocin A LactobacillusLactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum
Lớp II: 2.7 kDa, thuộc enzyme proteolytic, tồn tại ở 1000C trong 10 phút.
Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus
Lớp I: 3.7 kDa, hoạt động ở pH 4.5-7.5
Sakacin P Listeria monocytogenes Lớp II: 4.4 kDa, chịu nhiệt
Lactobacillus curvatus
Curvacin A Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis
Lớp II: 4.3 kDa
Lactobacillus
helveticus Helveticin J Lactobacillus bulgaricusLactococcus lactis Lớp III: 37 kDa, phổ tác độnghẹp, giảm hoạt động sau 30 phút ở 1000C
2.2.5.2. Các chất cĩ khả năng kháng khuẩn khác
Các LAB cũng cĩ khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thơng qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác ngồi bacteriocin nhu: hydrogen peroxide, cacbon dioxide và diacetyl, acid hữu cơ chủ yếu là acid lactic.
Quá trình biến dưỡng của LAB cĩ ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinh vật cĩ hại các dạng hoạt động khác của chúng. Được thể hiện rõ qua bảng sau:
Bảng 2.8: Kiểu hoạt động đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng
Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng
CO2 Ức chế quá trình decarboxylation, giảm tính thấm qua màng ( khử Carboxyl).
Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine. Hydrogen peroxide
Lactoperoxide
Oxy hĩa các protein cơ bản.
Acid lactic Acid lactic khơng bị phân hủy mà thấm vào màng làm giảm pH nội bào. Nĩ cũng liên quan tới quá trình biến dường như: phosphoryl oxy hĩa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3. Vi sinh vật chỉ thị
2.3.1. Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị (indicator strains)
Vi sinh vật chỉ thị là những vi sinh vật gây bệnh rối loạn hệ tiêu hĩa cĩ nguồn gốc thực phẩm. Để chọn lọc Probiotic, người ta kiểm tra khả năng ức chế của các vi sinh vật probiotic lên sự sinh trưởng phát triển của vi sinh vật chỉ thị. Một số ví dụ về các vi sinh vật chỉ thị này là:
Bảng 2.9: Một số vi sinh vật chỉ thị điển hình sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc probiotic
Vi sinh vật chỉ thị Nguồn nghiên cứu
Bacillus cereus
Clostridium perfringens Listeria spp
Staphylococcus aureus
Carherine B. Lewus, Thomas J. Montville, USA, 1991
Listeria monocytogenes Escherichia coli
Salmonella
N. Chauteu, I. Castellanos, A.M. Deschamps. France, 1992
Helicobacter pylori Clostridium difficile Campylobacter jejuni Escherichia coli
J. Nowroozi, M. Mirzaii, M. Norouzi, Iran, 2004
Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Pediococcus acidilaticii Lactobacillus helveticus 2001 Samonella Enteritidis Escherichia coli Clostridium perfringens
Magdalena Kizerwetter-Swida, Marian Binek, Poland, 2005 Shigella dysenteriae Escherichia coli Salmonela typhi Yersinia enterocolitica V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy, 2006
Rất nhiều nghiên cứu chọn Escherichia coli là vi sinh vật chỉ thị, đặc biệt là chỉ thị cho những bệnh liên quan tới thực phẩm hay đường tiêu hĩa. Chính vì vậy, đề tài này đã thực hiện chọn lọc probiotic bằng cách kiểm tra sự ức chế sinh trưởng của probiotic lên vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli.
2.3.2. Vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột - Escherichia coli [4], [35]
2.3.2.1. Đặc điểm hình dạng, nuơi cấy và tính chất sinh hĩa
Vi khuẩn E.coli cĩ nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên cịn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
Phân loại khoa học:
Vực (Domain): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Gamma Proteobacteria Bộ (Ordo): Enterobacteriales Họ (Familia): Enterobacteriaceae Chi (Genus): Escherichia
Lồi (Species): E. coli
Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, khơng tạo bào tử, loại cĩ độc lực thì cĩ bao nang, loại khơng cĩ độc lực khơng cĩ bao nang. Kích th ước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu trịn. Một số dịng cĩ khuẩn mao (pili).
Đặc điểm nuơi cấy và sinh hĩa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng cĩ thể mọc trên 400C, pH 7,4.
- Trên mơi trường thạch dinh dưỡng TSA tạo khĩm trịn ướt (dạng S) màu trắng đục. Để lâu khĩm trở nên khơ nhăn (dạng R). Kích thước khĩm 2-3mm.
- Trên thạch máu: Cĩ chủng dung huyết á, cĩ chủng khơng dung huyết á. - Trên mơi trường chẩn đốn chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khĩm tím ánh kim.
- Trên mơi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím. - Trên mơi trường Endo, SS tạo khĩm hồng đỏ.
- Trên các mơi trường đường: Lên men lactose sinh hơi, glucose, galactose. Lên men khơng đều saccarose và khơng lên men dextrin, glycogen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các phản ứng sinh hĩa: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, , Lysine decarboxylase dương tính.
E. coli 157:H7 E. coli
Hình 2.10: Giới thiệu về hình thái Escherichia coli [44], [45], [46]
2.3.2.2. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố
Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng.
Độc tố của E.coli: Loại E.coli cĩ giáp mơ (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn loại khơng giáp mơ. Kháng nguyên K cĩ 13 loại KA, KB, KL. Ví dụ cơng thức kháng nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.
Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và khơng chịu nhiệt. Cả hai loại này đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb. Loại khơng chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.
Những dịng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau nhưng thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H12, O157.
2.3.2.3. Một số bệnh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc và gia cầm [49]
Bệnh gây cho gà
Nguyên nhân: Do vi khuẩn E.coli gây ra.
Phương thức lây truyền:
Lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh. Lây qua đường hơ hấp hoặc da, niêm mạc.
Lây qua vỏ trứng do nhiễm bẩn từ phân hoặc mơi trường của chuồng trại bị nhiễm trùng.
Lây qua thức ăn, nước uống bị nhiễm trùng.
Triệu chứng và bệnh tích:
Gà con mới nở: Rốn viêm, ướt, cĩ màu xanh. Bụng sưng to, lịng đỏ khơng tiêu. Tiêu chảy.
Gà con từ 1-5 tuần tuổi: gà sốt cao, uống nhiều nước, khĩ thở, bỏ ăn, sưng mặt, viêm kết mạc mắt. Viêm màng bao tim, viêm màng bụng, viêm màng quanh gan làm cho bao tim đục, màng bụng cĩ dịch viêm, quanh gan thường phủ một lớp Fibrin màu trắng đục. Viêm túi khí. Viêm phổi
Gà đẻ: giảm tỷ lệ đẻ, gà ăn kém, gầy ốm dần, một số con cĩ dấu hiệu viêm khớp. Mổ khám cho thấy: ống dẫn trứng bị viêm, lách và gan thường sưng to và sung huyết
Gan sưng to sung huyết Viêm phổi Hình 2.11: Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà [49]
Bệnh gây cho heo:
Bệnh nhiễm trùng huyết do E.coli ở heo con
Nguyên nhân : thường xảy ra ở các đàn khơng ấm áp, vệ sinh kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, nước uống khơng tốt, sữa mẹ kém làm giảm hoặc mất nhu động ruột, cĩ thể do thiếu máu, thiếu vitamin (A, PP, B5…). Vi khuẩn E.coli sẽ xâm nhập và nhân lên trong ruột, vào máu và gây nhiễm trùng máu.
Triệu chứng:Heo bị nhiễm bệnh trong vịng 12h sau khi sanh và cĩ thể chết trong vịng 48 giờ với các biểu hiện sau: Heo bệnh lười vận động, đứng riêng ra khỏi đàn, ủ rũ, đuơi rũ xuống hơng. Đơi khi ĩi mửa, run rẩy và cĩ thể chết sau khi hơn mê, co giật (tỷ lệ chết cĩ thể 80-90%).
Bệnh tích: Viêm màng ngồi và van tim, sung huyết thận, lá lách, cĩ thể viêm da và khớp.
Bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con: Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn heo con sơ sinh đến giai đoạn cai.
Nguyên nhân: Bệnh xảy ra ở các đàn úm khơng đủ ấm, vệ sinh chuồng và thức ăn nước uống kém, thiếu hoặc ít sữa đầu, sữa mẹ kém, thiếu máu, thiếu vitamin. Bệnh thường kết hợp nhiệt độ quá thấp, mưa lạnh, ẩm ướt, stress…
Triệu chứng:Heo tiêu chảy phân màu vàng trắng, trắng xám, về sau cĩ màu vàng xanh, mùi hơi. Heo mất nước, gầy sút nhanh, bú kém, đi lại khơng vững và nơn ra sữa đơng khơng tiêu. Heo con bệnh yếu đi rất nhanh nếu khơng điều trị kiệp thời thì heo yếu dần, lơng xù và chết (tỷ lệ chết cĩ thể lên đến 80-90%).
Bệnh tích: Cơ thể mất nước, ốm, phân dính bết vào hậu mơn. Mạch máu ruột và hạch ruột sung huyết cấp tính. Ít thấy viêm dạ dày ruột xuất huyết, dạ dày chứa sữa khơng tiêu.
Heo con bị tiêu chảy phân trắng Heo con yếu dần rồi chết Hình 2.12: Aûnh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con [49] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bệnh phù thủng trên heo cai sữa: Bệnh thường xảy ra trên
heo cai sữa hoặc sau cai sữa 1-3 tuần tuổi. Bệnh thường xảy ra trên những con lớn nhất đàn sau lây qua những con khác.