Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật của vi khẩn lên men LACTIC để chọn chủng tiềm năng PROBIOTIC

Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuầnlà làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làmbớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B

Chương 1: Mở Đầu

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay công nghệ sinh học là một lĩnh vực đang phát triển và có nhiềutiềm năng lớn Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển côngnghệ sinh học, đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong côngnghiệp

Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học.Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý vàhiệu quả mà nó thể hiện Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuầnlà làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làmbớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzymetiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dịch; ngănchặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảmcholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăngtrọng nhanh…

Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đangchiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác Vì tính hiệu quả củaprobiotic (tính trị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh,tồn dư tác hại trong sinh vật chủ Mà với sự khắt khe của con người thì điều nàylà số một

Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất khángsinh trong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó manglại như:

 Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 1

vi trùng.

 Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

Tuy nhiên, thế giới đã nhanh chóng nhận ra những tác động xấu do việclàm này mang lại Sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng khôngđúng cách trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chấtkích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tănghiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vậtnuôi Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đãbiến vật nuôi thành nơi để một số loài vi khuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tácdụng của các loại kháng sinh Hậu quả của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn vềkinh tế rất lớn Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không phải là chính yếumà vấn đề đáng lo ngại là không chỉ vật nuôi mà ngay cả loài người đang đứngtrước hiểm hoạ xẩy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốc gây ramà không thể kiểm soát được

Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotic vào cuộc sống là mộtcông việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa Có như vậy mới tiếp tụchoàn thiện probiotic đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày đượccao hơn, an toàn hơn đáp ứng nhu cầøu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta.Có thể nói đây là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở

ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn

Khoa hóc cođng ngheô luođn phaùt trieơn nhaỉm ñeơ ñaùp öùng lái nhu caău ngaøycaøng cao cụa con ngöôøi Tređn phöông trình taíng tieân naøy, con ngöôøi ñoøi hoûi khaĩtkhe hôn veă chaât löôïng cụa mói loái sạn phaơm ñaịc bieôt laø söï an toaøn veă söùc khoẹcụa chính bạn thađn hó Maø chính nhöõng nhu caău naøy laø kích thích toâ tröïc tieâpthuùc ñaơy khoa hóc phaùt trieơn “ Probiotic” laø moôt phaăn cụa söï phaùt trieơn aây.Ñeơ coù theơ coù moôt cheâ phaơm probiotic coù ñaăy ñụ nhöõng hoát tính caăn thieât,khađu chón lóc chụng vi khuaơn ñeơ laøm probiotic laø cöïc kì quan tróng Bôûi vì ngaytái khađu naøy seõ quyeât ñònh vai troø vaø taùc dúng cụa cheâ phaơm leđn ñoâi töôïng caănquan tađm Tuy nhieđn, trong phám vi nhoû hép cụa nghieđn cöùu naøy, tođi chư thöïchieôn ñeă taøi ôû böôùc kieơm tra hoát tính khaùng vi sinh vaôt vì thôøi gian thöïc hieôn ñeătaøi chư trong 12 tuaăn khođng cho pheùp tođi thöïc hieôđn hoaøn chưnh taât cạ caùc tieđu chí

tuyeơn chón Probiotic Chính vì theẩ tođi ñaõ chón ñeă taøi “THÖÛ NGHIEÔM VAØ SO SAÙNH CAÙC PHÖÔNG PHAÙP ÑO HOÁT TÍNH KHAÙNG VI SINH VAÔT CỤA VI KHUAƠN LEĐN MEN LACTIC ÑEƠ CHÓN CHỤNG TIEĂM NAÍNG

PROBIOTIC”

1.2 Múc tieđu nghieđn cöùu

Thöû nghieôm vaø so saùnh caùc phöông phaùp ño hoát tính khaùng vi sinh vaôt cụa

vi khuaơn leđn men lactic

Chón lóc vi khuaơn leđn men lactic coù hoát tính probiotic

1.3 Ñoâi töôïng nghieđn cöùu

Vì thời gian hán hép, ñeă taøi chư taôp trung ôû những ñoâi töôïng sau :

- Vi khuaơn leđn men lactic coù nguoăn goâc töø thöïc phaơm leđn men ( caø muoâi,döa muoâi, nem, söõa leđn men) vaø coù nguoăn goâc töø caùc cheâ phaơm döôïc

- Vi sinh vaôt chư thò Escherichia coli.

SVTH: Ñoê Queđ Mi Höông

MSSV: 105111016 Trang 3

lọc này, tôi đã xem xét và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tàicủa mình.

Tôi xin đề xuất sơ đồ tiến hành nghiên cứu như sau:

Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu

Tổng hợp biên tập tài liệu

Phân tích các nghiên cứu liên quan

Tiến hành thử nghiệm các phương pháp Trao đổi ý kiến với giáo viên hướng dẫn

Phân tích ưu điểm – khuyết điểm của các phương pháp

Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành chọn lọc probiotic

Đưa ra kết quả nghiên cứu

1.4.2 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn

Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình, độlệch chuẩn, vè đồ thị tương quan

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Tìm hiểu về các phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật chỉ thịcủa các vi khuẩn lên men lactic

Tạo tiền đề cho các nghiên cứu liên quan sau này tại phòng thí nghiệm.Góp phần chọn lọc được chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tínhprobiotic

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 5

khi con người biết đến sữa lên men Việt nghiên cứu được bắt đầu từMetchnikoff làm việc ở viện Pasteur Paris Ông ta cho rằng vi sinh vật trongruột có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này cóthể được cải thiện bởi việc sử dụn sữa chua Ông đã trích dẫn các quan sát vềnông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa chua và có tuổi thọ rất cao Ông

phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là “Bulgarian bacillus” và sử

dụng chúng trong các thử nghiệm Những sinh vật này được xác định và được

biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L delbrueckii subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và sản

xuất yoghurt Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứunày chuyển về USA Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng

các L acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này 34

Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa khác nhau, nó được sử dụnglần đầu tiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi mộtprotozoan để kích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác Đến năm 1974,Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật vàchất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột.Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “ một bổ sung vi sinhvật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện cânbằng vi sinh vật đường ruột” 33

Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩnprobiotic (T Mattila-Sandholm, M Saarela, Probiotic functional foods)

Dạng sản

phẩm

Tên sản phẩm Công ty

Vi Khuẩn probiotic bổ sung (10 7 -10 8 LAB/ml) Nơi sản xuất

France,Belgium,Spain,Switzerland,Portugal,Italy,Germany,UK

Fermented

milk drink Yakult Yakult L casei Shirota strain

Nertherlands,UK,GermanyCultures

yoghurt-style

product

Yoghurt

ActimelCholesterolControl

Fermented

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 7

2.1.1.2. Hiệu quả sử dụng probiotic

Đã có rất nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi được

đăng kí bảo hộ sáng chế Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobacillus spp hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces

boulardii, hay Bacillus subtilis Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể là

trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột.Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụng được biết tới như sau: 2, [3],

5, 25, 32, 33

 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến

 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa

 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạplactose

 Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh

 Kích thích hệ thống miễn dịch

 Giảm nhiễm trùng đường niệu

 Tăng trọng (5%) ở gia cầm

 Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm

 Giảm tiêu chảy ở dộng vật non

 Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh

Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảngdưới đây:

Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15]

Chủng Tác dụng lâm sàng trên người

Lactibacillus rhamnosus GG

(ATCC 53103)

Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy

do kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòngrotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị

tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile,

kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứngviêm da không điển hình ở trẻ em

Lactobacillus johnsonii

(acidophilus) LJ-1 (La1)

Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng

cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter

pylori Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy

do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinhvật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón,kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứngviêm da không điển hình ở trẻ em

Lactobacillus reuteri

(BioGaia Biologics)

Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ởtrẻ em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, antoàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởngthành HIV dương tính

Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm

hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cựcđối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổtử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịchSVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 9

dưỡng qua ốngChủng trong sữa chua

Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinhvật đường ruột này Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ănđã thúc đẩy tăng trưởng của vật nuôi Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnhhưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đườngruột này và cách thức mà nó tác động lên vật chủ Thứ hai, càng ngày càng cónhiều vật nuôi bị bệnh, cung cấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong

đường ruột bởi những vật chủ có sẵn Và cuối cùng cho thấy rằng L acidophilus không là vi khuẩn lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật

khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics Những nghiên cứu tiếpsau đó cho thấy có khoảng 1014 vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồntại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy việc nghiên cứu vềnhững sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được mở rộng [30]Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật cóthể sử dụng làm probiotic Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo

2.1.1.3. Các thành phần của Probiotics

Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al 2001) [5]

Bacillus cereus var Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii

2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34]

Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩnnhư:

 Tiêu chuẩn về an toàn

 Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng

Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành choprobiotic, ta có thể tổng kết lại như sau:

 Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:

 Có định danh chính xác

 Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người

 Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh

 Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 11

nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động họccủa chủng probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ.Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded AsSafe)

Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15]

Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở

các bệnh nhân suy giảm miễn dịch (AIDS)

Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S thermophilus được sử dụng

trong các sản phẩm sữa

Enterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng

kháng sinh

Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics

Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở

người

Propionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotic

Saccheromyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở

ngườiPhần lớn những vi sinh vật sử dụng làm probiotic cho người đều phải đạtnhững yêu cầu khắc khe như đã nêu trên Còn đối với vật nuôi ta có thể nớilỏng những yêu cầu này, tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sửdụng của nó

 Trước khi một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng thường phải có những đặc điểm sau: [2], [4], [23]

 Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệđể có thể đưa vào sản xuất dễ nuôi cấy

 Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sảnphẩm

 Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm

 Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng Để tồntại được nó phải có đặc tính sau:

Có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vịcủa người

Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng đểprobiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non)

 Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ

 Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vậtchủ có thể sử dụng

 Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gâyviêm

 Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đốikháng với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột

 Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin,hydrogen peroxide, acid hữu cơ)

 Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư

Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụnglàm probiotic

 Khả năng bám dính [1], [2], [10]

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 13

niêm mạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho, điều này sẽ kích thích tính miễndịch tại chỗ và toàn bộ cơ thể Do đó người ta cho rằng chỉ có những chủngprobiotic có khả năng bám dính mới tạo được hiệu quả cảm ứng miễn dịch vàlàm ổn định hàng rào bảo vệ niêm mạc ruột.

Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn kết vàobiểu mô ruột, giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic Qua một số thử

nghiệm, đều cho thấy Lactobacillus acidophilus còn sống hay đã chết do nhiệt

đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh

Trong thử nghiệm về khả năng bám dính của probiotic người ta thườngkiểm tra trên những dòng tế bào ung thư trực tràng như HT-29 và Caco-2 Haidòng tế bào này được biệt hóa thành tế bào ruột, được sử dụng như là một môhình cho biểu mô ruột non Những thử nghiệm này cho ta biết được sự khác biệtvề khả năng bám dính của những chủng probiotic khác nhau

Ngoài sử dụng hai dòng tế bào trên, người ta còn có thể nghiên cứu bằngkỹ thuật sinh thiết, bằng cách sinh thiết một mẫu mô sau một thời gian sử dụngprobiotic Kỹ thuật này được xem là cho kết quả chính xác nhất về khả năngbám dính của probiotic Tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều hạn chế trong vấn đề vềđạo đức của việc lấy mô, đòi hỏi người thực hiện có chuyên môn cao, và có thểmắc sai số

 Khả năng điều hòa miễn dịch [1], [2]

Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotic có thể được trình bày theo 3cách sau:

1 Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của

sv hay hạt carbon

2 Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM vàinterferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu)

3 Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột, thường là IgA

 Khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh [2], [5]

Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quantrọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằngcách tiết ra các kháng sinh hay là những chất cạnh tranh

Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng mà ức chế cả vi khuẩn Gramdương và Gram âm Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinhvật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chấtcủa vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố

Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ởcác chủng probiotic là:

 Khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư [2], [5], [18]

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 15

(nitroreductase, β-glucuronidase ) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ungthư thánh chất gây ung thư trong trực tràng

Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch

Những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay in vivo, việc mở

rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn đang là vấn đề còn nhiều tranh cãi

2.1.2 Qui trình chọn lọc các chủng Probiotic

Quá trình chọn lọc chủng probiotic xây dựng theo hình 2.2 và 2.3 được trình bày sau đây:

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

Trên động vật

Dánh giá độ an toàn

In vitro và trên động vật

Trên người: pha 1

Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu

nhiên gồm nhóm thử nghiệm và nhóm

đối chứng uống thuốc vờ (DBPC) để

xác định tính công hiệu của chủng

hoặc sản phẩm

Tốt nhất nên thử nghiệm DBPC độc lập lần 2 để khẳng định kết quả

Dán nhãn

Tên chi, loài, ký hiệu chủngSố lượng tối thiểu vi khuẩn sống

PROBIOTIC

Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người

So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng

probiotic với phương pháp điều trị thông thường

Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn Probiobic

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 17

Phân lập các dòng vi khuẩn

Sàng lọc in vitro

Sàng lọc in vivo quy mô nhỏ

Kiểm tra khả năng gây bệnh đối với vật chủ

Không đạt

OK

? Đạt

Đạt

Thử nghiệm in vivo quy mô pilot

Hình 2.2 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic

2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật

Probiotics

Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotics đều dự trên

cơ sở sự ức chế tăng trường vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, được kháiquát như sau:

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

Kháng

vi sinh

Chịu được

Thử nghiệm

Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vậtCác chỉ tiêu và phương pháp trên sẽ được giới thiệu kĩ hơn ở phần tiếptheo.

2.1.3.1 Khả năng bám dính (Adhesion assay) [9], [24], [41]

Nguyên tắc: dựa trên mối quan hệ tương tác giữa probiotic và bề mặt niêmmạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho Ngoài ra sự bám dính của probiotic tạonên khả năng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô ruột giữavi khuẩn gây bệnh vàprobiotic

Tế bào Caco2 ở nội tạng thường được sử dụng trong nghiên cứu in vitro dựa trên hệ thống tế bào bám dính của Lactobacilli không gêy bệnh Chuỗi tế

bào này được sử dụng để kiểm tra hện thống tế bào bám dính và sự xâm nhậpcủa các vi sinh vật chỉ thị

Tế bào Caco2 được nuôi cấy tăng sinh khối tế bào trong Eagle’s minimumessential medium (MEM) Hỗn hợp chứa vi khuẩn khoảng 108tb/ml và 240µlMEM được sử dụng để ủ với tế bào Caco2 Sau khi nuôi ủ, sinh khối tế bàođược nhuộm với dung dịch màu Giema Lúc này quan sát được các tế bào

Lactobacilli bám chặt trên tế bào Caco2 dưới kính hiển vi độ phòng đại 100.

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 19

Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác

động đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh [47]

2.1.3.2 Khả năng chịu acid dạ dày [24], [41]

Nguyên tắc: pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra nhưoxalic acid, butylic acid, folic acid Chính vì vậy các vi khuẩn probiotic cầnphải chịu được điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dàyvà ruột thì mới có thể phát huy được tác dụng probiotic của mình

Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotic trênmôi trường MRS với điều kiện pH là 2.5 và đối chứng trên MRS thông thường.Sau đó quan sát mật độ vi sinh vật ở bước sóng 600nm Tiếp tục so sánh sự sốngsót dưới điều kiện này ở các mốc thời gian, từ 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và24h

2.1.3.3 Khả năng chịu được muối mật [24], [41]

Có loại muối mật: glycochalat Natri và Taruocholat Natri Muối mật cóchức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéotheo sự hấp thu các vi ta min tan trong lipid như A, D, E, K Khi xuống đếnhồi tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo theo tính mạch của trở vềgan và được tái bài tiết, gọi là chu trình ruột gan Còn lại 5% muối mậtđược đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhuđộng ruột già Chính vì khả năng này mà khả năng chịu được muối mậtcũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotic, đòi hỏi các vikhuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trong ruột.Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp,cũng dùng môi trường MRS có bổ sung 0.3% muối mật và đối chứng trên MRSthông thường Sau đó so sánh mật độ tế bào vi khuẩn ở bước sóng 600µnm

2.1.3.4 Khả năng kháng vi sinh vật

Điển hình về nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của probiotic đó chínhlà nghiên cứu của Schillinger và Lucke [28] Sau này phát triển thêm nhiềunghiên cứu mới, tuy nhiên tất cả những nghiên cứu từ trước tới giờ đều dựa trênkhả năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triểncủa các vi sinh vật gây bệnh

Hình 2.5 sẽ cho thấy sơ đồ khái quát hóa về các phương pháp đánh giáhoạt tính kháng vi vinh vật dựa trên dạng vật liệu khác nhau

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 21

Turbidometric assay method

well diffusion assay

Spot

on lawn

Disc diffusion assay

Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá

hoạt tính kháng vi sinh vật của probiotic

Sau đây là giới thiệu chi tiết hơn về các phương pháp giới thiệu tại bảng 2.5

Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật

Phương pháp Nguyên tắc sử

Trong môi trường lỏng(1) Cho dịch lytâm môi trường(2) nuôi cấy LAB vàomôi trường phát triển của vi khuẩn chỉthị Sau 21h đo OD ở bước sóng600nm, so sánh % với ống đối chứngkhông sử dụng dịch ly tâm trên

Disc diffusion

assay

(khuếch tán qua

vòng giấy lọc)

[7], [11], [19],

[31]

Như trên Trên môi trường agar(3) Thấm giấy

vào dịch ly tâm môi trường (2) nuôicấy LAB Đặt giấy thấm lên bề mặtmôi trường agar đã trải vi khuẩn chỉthị trước đó Ủ qua đêm, kiểm travùøng kháng khuẩn

Well diffusion

assay

Như trên Trên môi trường agar (3) Trải vi

khuẩn chỉ thị, đục lỗ đường kính 8mm

(khuếch tán qua

Đấu tranh trựctiếp của Probioticvới vi khuẩn chỉthị

Giống như trên Tuy nhiên sử dụngtrực tiếp dịch nuôi cấy LAB Ủ quađêm, kiểm tra vùøng kháng khuẩn

Spot on lawn

[12], [11], [31],

Đấu tranh trựctiếp của Probioticvới vi khuẩn chỉthị

Trên môi trường agar (4) Nhỏ dịchchứa tế bào LAB, cố định bằng 1 giọtmôi trường (5) Đổ hỗn hợp vi khuẩnchỉ thị với 7ml môi trường (5) lên, đểđông, được hai mặt kẹp của hai môitrường (4) và (5) Ủ qua đêm, kiểm travùøng kháng khuẩn

Agar spot test

(khuếch tán trên

bề mặt thạch)

[27], [19], [5]

Đấu tranh trựctiếp của Probioticvới vi khuẩn chỉthị

Trên môi trường agar (3) Trải vikhuẩn chỉ thị, nhỏ giọt môi trường (2)nuôi cấy LAB Ủ qua đêm, kiểm travùøng kháng khuẩn

Giải thích thêm:

Kiểm tra vùng kháng khuẩn là đo vòng trong suốt không có sự phát triểncủa vi khuẩn chỉ thị

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 23

Agar spot test Well diffusion assay

Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật [19]

2.1.3.5. Thử nghiệm in vivo [10], [41]

Đây là khâu quan trọng trong quá trình hình thành nên một chế phẩmProbiotic Vì nó thể hiện được tính an toàn của sản phẩm cũng như là vấn đề vềđạo đức Một chế phẩm probiotic trước khi trở thành thành phẩm để sản xuất và

tiêu thụ, phải trải qua công đoạn thử nghiệm in vivo nhằm kiểm tra ảnh hưởng

của chế phẩm lên cơ thể tiếp nhận Tức là kiểm tra độc tính hay những biến đổixấu lên cơ thể tiếp nhận khi sử dụng chế phẩm này Qui trình kiểm tra này có

thể bắt đầu với thử nghiệm in vivo trên chuột hoặc thỏ, sau đó mới được thử

nghiệm trực tiếp trên cơ thể tiếp nhận như gia súc gia cầm với chế phẩm trong

chăn nuôi Đặc biệt nếu là chế phẩm dành cho người thì việc thử nghiệm càngphải gắt gao và đòi hỏi tính chính xác, tính an toàn cao.

2.1.4 Ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi [1], [3]

Phương pháp chăn nuôi hiện đại trong đó bao gồm các điều kiện và chế độăn gây ra stress và có thể gây ra những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinhvật mà làm cho vật nuôi giảm sự đề kháng đối với bệnh tật

Probiotic được bổ sung vào thức ăn để tăng cường tốc độ tăng trưởng củavật nuôi và cải thiện sức khỏe của chúng bằng cách tăng sự đề kháng Mục đíchcủa phương pháp tiếp cận probiotic là để cân bằng lại hệ vi sinh vật và phục hồisức đề kháng của động vật Sự điều trị như vậy không đưa bất cứ hóa chất vàobên trong cơ thể động vật Giảm nguy cơ nhiễm bệnh và không đưa hóa chấtđộc hại vào trong chuỗi thức ăn

Nó được giả định rằng probiotic đã tác dụng đến cả vùng dạ dày và tácdụng lên bệnh tiêu chảy và các bệnh nhiễm trùng khác Tuy nhiên, gần đây cónhững nghiên cứu tại một số quốc gia khác nhau đã chỉ ra rằng các tác động nàycó thể được tổng quát hơn Các kết quả thu được đã chứng tỏ rằng một số vikhuẩn được sử dụng trong probiotic (lactobacilli) có khả năng kích thích hệmiễn dịch Điều này được đặt ra hoàn toàn mới đối với những ảnh hưởng củaprobiotics đã biết, trong đó nó có thể tác động tới tình hình bệnh dịch về đườngruột, cũng như phòng chống các bệnh về đường ruột

Probiotic hiện nay đã thay thế các hóa chất tăng trưởng vẫn thường quảngbá cho các nông trại chăn nuôi và sự yêu cầu tăng khả năng kháng bệnh cũngđược thực hiện Yêu cầu về lợi ích mà probiotic mang lại trong chăn nuôi giasúc như sau:

 Tăng trưởng nhanh

 Nâng cao khả năng sinh sản

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 25

khác nhau sẽ ảnh hưởng đến kết quả khi chúng được sử dụng như probiotic Kếtquả tiêu cực có thể được giải thích ở những vật nuôi có sức đề kháng yếu hay

do giai đoạn tăng trưởng của vật nuôi, liều lượng sử dụng, các điều kiện vệ sinhchuồng trại

Với những điều ngạc nhiên mang lại, cũng như những kết quả chưa nhưmong muốn của probiotic, nhưng thực tế là những kết quả đạt được rất có ýnghĩa, bằng cách sử dụng probiotic hợp lý, theo đúng các điều kiện và sử dụngđúng phương pháp sẽ mang lại nhiều lợi ích cho việc bổ sung nguồn dinh dưỡngtrong chăn nuôi

2.1.4.1. Trong chăn nuôi gia cầm [4]

Trong quá trình cải tiến di truyền, năng suất của gà thịt đã được cải thiệnđáng kể Khi mà điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, việc tăng mật độnuôi và lúc đó thì thách thức bệnh tật gia tăng gây cho gia cầm dễ nhiễm các

loại nguồn bệnh khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn đường ruột như E.coli,

Salmonella spp, Clostridium perfringens và Campylobacter spp…

Sự nhạy cảm với mầm bệnh dẫn đến việc sử dụng các chất kích thích sinhtrưởng chống vi khuẩn – các chất vốn căn bản được sử dụng để tăng sức khoẻcho đường ruột và kiểm soát các kích thích phụ lâm sàng

Với ý thức ngày càng tăng của xã hội về sự kháng thuốc của vi khuẩn, thìviệc sử dụng kháng sinh trong các liều thuốc chữa bệnh hoặc phòng bệnh chogia cầm đã được hạn chế một cách nghiêm ngặt thậm chí bị loại bỏ hẳn ở rấtnhiều quốc gia.

Từ lâu đã có nhiều quan tâm đến việc tìm ra một loại chất để thay thếkháng sinh trong chăn nuôi gia cầm Vi khuẩn sống trong ống tiêu hóa của giacầm có ảnh hưởng sâu sắc đến một vài quá trình sinh lý của vật chủ (gia cầm).Với suy nghĩ đó, điều quan trọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi khuẩn đườngruột gia cầm nhằm tìm ra các chất thay thế thuốc kháng sinh Trong bối cảnhbình thường, thì trong đường ruột có một sự cân bằng tinh tế giữa các vi khuẩncó lợi và gây bệnh Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác và quan hệ cộng sinh vàcạnh tranh Cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hoá mà còntăng khả năng sản xuất trong động vật chủ

Sử dụng Probiotic và Prebiotic là hai phương pháp đã được nghiên cứu vàcó tiềm năng giảm bớt nguồn dịch bệnh đối với chăn nuôi gia cầm và đồng thờinâng cao năng suất của chúng Các chất này mới được đề nghị dùng để hỗ trợbảo vệ nhiễm bệnh của thịt và cải tiến phản ứng miễn dịch cho gà ( TheoHuang và cộng tác viên - 2004) Thực phẩm Probiotics và Prebiotics vào thứcăn không còn là những phương pháp mới, mà thực tế, chúng đã được sử dụngtrong hàng thế kỷ như là một thành phần tự nhiên của thức ăn hoặc như thức ănlên men, thí dụ như sữa chua (yoghurt)

Bệnh đường ruột có ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi gia cầm Chúng làmgiảm năng suất, tăng tỷ lệ chết và cũng là nguồn nhiễm tiềm năng cho các sảnphẩm gia cầm, và gây nên mất an toàn thực phẩm cho con người Việc sử dụngcác thuốc kháng sinh trong thức ăn gia cầm đã được giảm bớt do vấn đề khángkháng thuốc của vi khuẩn Các chất thay thế cho kháng sinh trong dinh dưỡng

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 27

chết non.

Lactobacillus casei cải thiện tăng trưởng của heo con và giảm bệnh tiêu chảy,

tác dụng của nó hiệu quả hơn so với việc dùng kháng sinh liều thấp

- Enteracide, một probiotic chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus

faecium thêm vào thức ăn cho heo con cai sữa kích thích sự tăng trưởng và hoạt

động của hệ thống tiêu hóa Sự thêm Streptococcus faecium vào khẩu phần ăn

cho heo con làm tăng trọng lượng và tăng hiệu quả thức ăn

- Hỗn hợp Lactobacillus spp và Streptococcus spp tăng sự sinh trưởng và

chức năng miễn dịch ở heo con

- Bột tế bào vi khuẩn tiêu hóa từ Brevibacterium lactofermentum giảm sự tác

động và sự nguy hiểm của bệnh tiêu chảy ở heo con

- Heo con ăn Bacillus coagulans có tỉ lệ chết giảm và cải thiện việc tăng

trọng lượng, sự chuyển hóa thức ăn tốt hơn heo con không có ăn bổ sung cũngnhư so với heo dùng kháng sinh liều thấp

- Bacillus licheniformis cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm

bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non

- Biomate 2B plus (B.licheniformis và B subtilis) tăng hiệu quả thức ăn và

tăng trưởng của heo con hơn dùng kháng sinh

- Heo con ăn probiotic Bacillus toyoi hoặc hỗn hợp Saccharomyces cerevisae,

Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium làm tăng trọng lượng đáng

kể so với việc dùng kháng sinh

- Heo con ăn thức ăn bổ sung nấm men (Saccharomyces cerevisae) có

khuynh hướng tiêu thụ nhiều thức ăn và tăng trọng hơn

- Enterococcus faecium 18C23 ngăn chặn sự bám dính của E.coli tạo độc tố

đường ruột vào lớp màng nhầy ruột non của heo

Ngoài việc trị bệnh ở heo con, còn có một số nghiên cứu cho thấy các

lactobacilli cũng có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây

bệnh đường ruột ở trâu bò Theo Trovatelli và Matteuzzi (1976) do quá trìnhbiến đổi của trâu bò ( do mật độ quá đông, sự sợ hãi, thiếu thức ăn, sự dichuyển quá mức) và trong nguồn thức ăn thiếu các vi khuẩn có lợi nên sức đềkháng của trâu bò bị suy giảm Đo đó, người ta thường cung cấp thức ăn dạnglên men để tạo môi trường mới trong ruột vật nuôi nhằm miễn nhiễm với vi sinhvật gây bệnh, đồng thời giúp tăng trọng và tăng khả năng chuyển hóa thức ăn

Fastrack, một sản phẩm dùng cho động vật nhai lại, chứa Lactobacillus

acidophilus và Streptococcus faecium, tạo ra acid lactic, nấm men giúp bổ sung

vitamin B và những enzyme tiêu hóa Ở bê, Fastrack cải thiện tăng trọng, giảmbệnh tiêu chảy và những xáo trộn tiêu hóa khác; tăng sản lượng sữa và sự thèmăn ở bò; tăng lượng thức ăn ở cừu và dê

2.2 Vi khuẩn lên men lactic

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn [1], [8], [22], [29], [37]

Đầu tiên xin giới thiệu vị trí của vi khuẩn lactic trong hệ thống phân loại:

Vi khuẩn lactic thuộc lãnh giới vi khuẩn, ngành Firmicutes, Cùng vớingành Actinobacteria, chúng tạo thành nhóm các vi khuẩn Gram dương Tuynhiên so sánh về tỉ lệ base G+C thì ngành Firmicutes có tỉ lệ thấp trái với

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 29

biệt mặc dù có ứng dụng làm probiotics giống chi Lactobacillus và một số

Enterococcus, Lactococcus

Các vi khuẩn lactic thường được ứng dụng làm probiotics đó là

Lactobacillus acidophilus, L plantarum, L casei, L casei rhamnosus, L delbrueckii bulgaricus, L fermentum, L reuteri, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Bifidobacterium bifidum, B infantis, B adolecentis,

B longum, B breve, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium

Hình 2.7: Vi khuẩn lên men lactic trong hệ thống phân loạiSVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 31

Vì phạm vi đồ án còn hạn chế nên chỉ thực hiện nghiên cứu trong phạm vi

các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus Sau đây là đặt điểm chung của chi

Lactobacillus:

Tế bào hình que, thường có nhiều dạng: dài, mảnh và ngắn (dạng trực cầukhuẩn coccobacilli) Kích thước tế bào 0.5 – 1.2 x 1.0 – 10.0 µm Trong quátrình sinh trưởng, tế bào thường tạo thành chuỗi ở phase log Không di động, diđộng khi có sự hiện diện của tiên mao Không tạo bào tử, ở dạng gram dươngkhi tế bào còn non, và gram âm khi tế bào già

Hình dạng khuẩn lạc trên thạch: dạng lồi, mép tròn, màu trắng đục, thườngcó đường kính 2-5 mm Ít tạo sắc tố, có thể tạo sắc tố vàng, cam hay màu gỉ sắtvà màu đỏ gạch

Kị khí tùy nghi đôi khi hiếu khí Phát triển mạnh trên môi trường thạch, kịkhí có 5-10% CO2, catalase, cytochrome và benzidine âm tính

Sản phẩm của quá trình chuyển hóa carbohydrate hơn 50% là lactate, cònlại là acetate, formate, succinate, CO2 , ethanol Không tạo acid dễ bay hơi cósố nguyên tử carbon hơn hai Khả năng khử nitrate kém và tạo pH dưỡi 6.0.không hóa lỏng gelatin Không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo mộtlượng nhỏ đạm hòa tan Không tạo indole và H2S

Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp: amino acid, peptide, các dẫn xuất acidnucleic, vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồn carbonhydrate và đặctrưng theo loài.

Nhiệt độ phát triển 5-530C, nhiệt độ tối ưu 30-400C

Có thể phát triển tốt ở pH khoảng 5 và pH tối ưu là 5.5-5.8

Được tìm thấy trong các sản phẩm sữa, hạt, sản phẩm thịt, nước giải khát,bia, rượu, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua, trong nước thải, trong hệ tiêu hóangười và nhiều loài động vật Là những sinh vật ít gây bệnh, có tác dụng tốt vớiđường tiêu hóa

2.2.2 Quá trình lên men lactic [1], [37]

 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình

Lên men acid lactic đồng hình lượng acid lactic tạo nên chiếm trên 80% vàđược biểu diễn tóm tắt bằng phương trình:

C6H12O6  2CH3-CHOH-COOH

Sự hình thành nên acid lactic trải qua hàng hoạt các giai đoạn trung gianvới sự tham gia của các enzyme tương ứng Giai đoạn đầu xảy ra quá trình hoạthóa hexose được phân cắt để hình thành triosephotphate Chất này được chuyểnthành acid pryruvic rồi thành acid lactic

 Vi khuẩn lên men lactic dị hình

Trong lên men lactic dị hình, tạo sản phẩm đa dạng ngoài acid lactic còncó hàng loạt sản phẩm phụ khác, các sản phẩm phụ và acid lactic được sinh ravới số lượng phân tử gam như nhau Cụ thể là: acid lactic 40%, acid succinic vàrượu etylic 20%, acid acetic 10% và các chất khí còn lại 20%

Sự đa dạng của sản phẩm tạo thành khi lên men lactic dị hình vì vi khuẩnthuộc nhóm này có nhiều hệ enzyme nên quá trình chuyển hóa đường phức tạphơn ở vi khuẩn lactic đồng hình

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 33

Hình 2.8: Quá trình lên men lactic của LAB (A): Lên men lactic đồng

hình (B): Lên men lactic dị hình [37]

Các enzyme trong quá trình: 1 Glucokinase; 2 Fructose-1,6-dịposphatealdolase; 3 Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 Pyruvate kinase; 5.Lactate dehydrogenase; 6 Glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8 Phophoketolase; 9 Acetaldhydedehydrogenase; 10 Alcohol dehydrogennase.

2.2.3 Khả năng tổng hợp enzyme

Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một số lượng lớn các enzymengoại bào kích thích hệ thống tiêu hóa như: enzyme amylase, protease, lipase,glycolase và lactic dehydrogenase

Proteolysis (khả năng phân giải protein): vi sinh vật tổng hợp protease giúpphân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được Hoạt tính

này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có thể

tiêu thu dễ dàng

Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp

thành những hợp chất đơn giản Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra cáckhẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng

bệnh Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể phân hủy

Cholesterol

Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme β-galactosidase,

glycolase và lactic dehydrogenase cs thể sản sinh acid lactic từ lactose Acidlactic có những lợi ích như sau:

 Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biếndưỡng lactose

 Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đôngtụ protein trong sữa

 Tăng cường việc sử dụng Calci, Phospho, Sắt

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 35

bằng việc tổng hợp vitamin như: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H),vitamin K.

2.2.5 Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn

2.2.5.1. Bacteriocin [12], [13], [21], [38], [43]

Bacteriocin là những hợp chất có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổnghợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệgần với giống sản xuất Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gramâm và gram dương Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm chủ yếâu sau:

 Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome

 Tế bào chủ miễn dịch với chúng

 Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệtnhững chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó lactic acidbacteria (LAB) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ khángkhuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứngdụng trong dược phẩm

Bacteriocin được LAB tổng hợp chia thành 4 lớp:

Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa nhữngamino acid hiếm và một số amino acid khử nước Chịu được nhiệt, hoạt động ổnđịnh trên cấu trúc màng Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với

trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởngthành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa.

Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm nhữngphân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bềnnhiệt, phổ kháng khuẩn hẹp Lớp này được chia làm ba nhóm:

IIA: peptides hoạt động chống lại Listeria spp Trong nhóm này có

leader-Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồmnhững enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của

bacteriocin Bacteriocin dạng này được thu nhận từ một số giống Lactobacillus

Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thànhphần lipid và carbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về câu trúcvà chứng năng của bacteriocin thuộc lớp này bì chưa có phân tử nào thuộc lớpnày được tinh sạch

SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 37

Hình 2.9: cơ chế kháng khuẩn của một số loại Bacteriocin [48]

Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào

Bảng 2.7: Một số Bacteriocin và đặc điểm của chúng [22]

Loài Bateriocin Phổ tác động Đặc điểm

Lactococcus lactis

subsp lactis

Nisin Vi khuẩn gram dương Lớp I: lantibiotic, 3.5 kDa, 34

amino acids, Lacticin 3147 Clostridium sp

Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus

dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans

Lớp I: cấu thành từ 2 lantibiotic, 4.2 kDa, bền với nhiệt.

Lớp II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chịu được nhiệt độ 121 0 C trong 15 phút.

Lactacin B Lactobacillus debrweckii

Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis

Lớp III: 6.3 kDa, chịu được nhiệt, chỉ được tổng hợp khi nuôi cấy ở điều kiện pH 5.0- 6.0

Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus

Enterococcus faecalis Listeria môncytogenes

Lớp II: 3.9 kDa, 37 amino acid, ổn định ở pH thấp, chịu được 100 0 C ở 20 phút.

Leuconostoc

mesenteroides

Mesentericin Y105

Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes

Lớp II: 3.8 kDa, 37 amino acid, chịu được nhiệt độ 60 0 C trong 120 phút ở pH 4.5

Peliococcus

acidilactici

Pediocin F vi khuẩn gram dương Lớp II: 4.5 kDa, thuộc enzyme

proteolytic, bền với nhiệt, hòa tan chất hữu cơ, hoạt động ở SVTH: Đỗ Quê Mi Hương

MSSV: 105111016 Trang 39

Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus

Leuconostoc Pediococcus

Lớp I: 3.7 kDa, hoạt động ở

2.2.5.2. Các chất có khả năng kháng khuẩn khác

Các LAB cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gâybệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác ngoài bacteriocin nhu:hydrogen peroxide, cacbon dioxide và diacetyl, acid hữu cơ chủ yếu là acidlactic

Quá trình biến dưỡng của LAB có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các

vi sinh vật có hại các dạng hoạt động khác của chúng Được thể hiện rõ quabảng sau:

Bảng 2.8: Kiểu hoạt động đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng

Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng

CO2 Ức chế quá trình decarboxylation, giảm tính