Bài giảng: công nghệ lên men

Bài giảng: công nghệ lên men

Công nghệ lên men

CDGD: Bùi Hồng Quân Biên soạn: Nguyễn Minh Hiền

Tài liệu tham khảo

Công nghệ vi sinh vật tập 2, 3 PGS-TS Nguyễn Đức Lượng

Công nghệ vi sinh ứng dụng, PGS-TS Trần Minh Tâm

Công nghệ lên men ứng dụng trong CNTP, Bùi Ái

Công nghệ sản xuất malt và bia, Hoàng Đình Hòa

Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, PGS – TS Nguyễn

Đình Thưởng, Nguyễn Thị Thanh Hằng

Enzyme vi sinh vật, PGS – TS Lê Ngọc Tú

Food microbiology, William C.Frazier

Applications of biotechnology to traditional fermented foods

( http://www.nap.edu/catalog/1993.html )

………

Tài liệu tham khảo (tt)

• Bamforth C.W Food, Fermentation and Micro-organisms,

Blackwell Publishing, USA, 2005

• Hutkins R.W Microbiology and Technology of Fermented

Foods, Blackwell Publishing, USA, 2006.

• Elmer H Marth, Applied dairy microbiology, Second edition

• Springer, Wine microbiology practical and procedures, 2007

• Springer, Modern techniques in the microbial ecology of

để đọc hiểu và thuyết trình power point (4sv/nhóm)

hiểu và thuyết trình power point (2sv/nhóm)

đọc hiểu và thuyết trình power point (4sv/nhóm)

Thi viết tự luận

NỘI DUNG CHI TIẾT HỌC PHẦN 2

Phần 1 Mở đầu

Phần 2 Kỹ thuật lên men

Phần 3: Công nghệ lên men ứng dụng

3.1 Lên men ethanol và các ứng dụng

3.2 Công nghệ sản xuất acid hữu cơ thực phẩm

3.3 Công nghệ sản xuất acid amin

3.4 Công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật

3.5 Công nghệ sản xuất polysaccharide từ VSV

3.6 Công nghệ enzyme

3.7 Công nghệ sx các sp lên men truyền thống

www.gbd.edu.vn

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 CÔNG NGHỆ LÊN MEN

1.1.1 Khái niệm về lên men (fermentation)

1.1.2 Khái niệm về CNLM (fermentation technology)

1.2 PHÂN LOẠI CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN

www.gbd.edu.vn

(From latin “fervere”)

1.1.1 Khái niệm về lên men (fermentation)

www.gbd.edu.vn

Quan điểm của nhà hóa sinh học: lên men là quá trình sản sinh

năng lượng Các hợp chất hữu cơ hoạt động với vai trò vừa là

chất cho, vừa là chất nhận điện tử Lên men là quá trình yếm

khí, năng lượng được sản xuất không cần có oxy hoặc các chất

nhận điện tử vô cơ khác

Quan điểm của Pasteur: 1857, Ông công bố quá trình lên men

không phải “công trình của sự chết” như những nhà hóa học

nghĩ mà là “công trình của sự sống” Ông đưa ra khái niệm tính

kỵ khí và ái khí của VSV và sự lên men là hệ quả của “cuộc

sống không có không khí”

hoặc không có oxy) để thu nhận sinh khối, các sản phẩm trao đổi

chất, thực hiện sự chuyển hóa cơ chất

1.1.1 Khái niệm về lên men (tt)

First Fermentation concept, or Pasteur concept in 1857,

“Fermentation is the transformation process of the sugar to

alcohol in presence of "la vie sans l'air" (means life without air)

Louis Pasteur (27.12.1822 – 28.9.1895)

the father of the Microbiology

1.1.1 Khái niệm về lên men (tt)

www.gbd.edu.vn

Conclusions of Pasteur from its study of wines:

The alcoholic fermentation of grape juice occur only in

presence of yeasts

The wine acidification occur in presence of bacteria

When the grape juice is heated the fermentation do not

take place

When the wine (the sugar) is heated the acidification do

not occur

Fermentation is the change of the substrate

(sugars) by the action of the ferments

1.1.1 Khái niệm về lên men (tt)

The fermentation technology is the combined

application of the knowledge of process

engineering , biochemistry and microbiology for

designing or evaluation a fermentation process.

1.1.2 Khái niệm về CNLM (fermentation technology)

Molecular Biology

Process engineering

Informatics Statistic

Immunology Physiology

TOOLS / TECHNICAL ADVANCES

Biosensors Bioinformatics

Bioprocess

Protein engineering Experimental design

Process analysis

ENVIRONMENT Bioremediation

Environmental monitoring Pollution control

What I should do to do fermentation?

Media preparation Fermenter preparation Sterilization Adjusting parameters Inoculation Cultivation Taking samples

Scale-up conservation

Optimization

Fermenter types Operation modes

CÁC SP TRAO ĐỔI CHẤT

vitamin, acid citric …

SP TĐC BẬC 2: enzyme VSV,kháng sinh…

SP lên men: rượu, acid lactic…

(lên men kỵ khí)

Cơ chất Tế bào (biomass)

1.2 PHÂN LOẠI CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TỪ VSV

Phân loại sản phẩm lên men theo quan điểm kinh tế

the substrate substrate price) price)

Medium value – High product volume (The The process is relatively expensive and some complexity)

Low value – High product volume

(Most Most of of the the production production correspond to purification

purification process process)

High investment cost (phí đầu tư cao) High investment cost

High raw material cost (phí nguyên liệu

Low recovery cost (Phí quay vòng thấp) High purification cost

Low margin profit (lợi nhuận thấp) High margin profit

Only few regulatory problems (phải

theo quy định pháp luật)

Too much regulatory and legyslation restrictions, and high plant hygiene

Required not much R&D expenditures

Low qualification of the labor force is

acceptable (Người lao động có thể ko

cần trình độ chuyên môn cao)

Very high qualification of the labor force is nedeed

PHẦN 2 KỸ THUẬT LÊN MEN

2.1 VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP

2.2 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN

2.3 PHƯƠNG PHÁP & THIẾT BỊ LÊN MEN

2.4 CẢI TiẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN

www.gbd.edu.vn

2.1 VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP

2.1.1 CÁC YÊU CẦU VỀ GIỐNG VSV

2.1.2 KỸ THUẬT TẠO GIỐNG

2.1.3 KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÀ SX GIỐNG

2.1.4 KỸ THUẬT KIỂM TRA GIỐNG VSV

2.1.5 KỸ THUẬT NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIỐNG

2.1.6 KỸ THUẬT BẢO QUẢN GIỐNG

VSV TRONG CÔNG NGHỆ LÊN MEN TP

TP lên men với sự tham gia

của VSV trong tự nhiên (TP

lên men truyền thống)

TP lên men với sự tham giacủa VSV thuần khiết (TPlên men công nghiệp)

Sx thủ công, quy mô nhỏ,

năng suất không cao

Không kiểm soát được

quá trình, chất lượng chưa

Kiểm soát được quá trình lênmen, chất lượng ổn định &

đồng đều

Phải có tốc độ sinh trưởng và phát triển mạnh, thuần

Phải tạo ra sản phẩm có năng suất sinh tổng hợp cao, chất

lượng tốt

Phải có tính thích nghi nhanh trong điều kiện sx CN

Phải có khả năng chống chịu lại VSV tạp nhiễm

Phải có kích thước đủ lớn, thuận tiện cho quá trình lắng,

lọc, tinh chế sau này Sản phẩm sinh khối dễ tách ra khỏi

môi trường nuôi cấy

Chủng VSV được bảo quản dễ dàng, tồn tại các đặc tính

trong suốt thời gian sử dụng

Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng kỹ thuật di truyền

để cải thiện, nâng cao năng suất

Không hoặc ít tạo thành sản phẩm không mong muốn

2.1.1 Yêu cầu giống VSV trong CNLM

2.1.2 Kỹ thuật tạo giống

Phân lập trong

tự nhiên

PL trong đk sx công nghiệp

Tạo giống VSV mới (áp dụng kỹ thuật di truyền)

Tốn thời gian, hoạt lực VSV còn thấp

PL trong

sx CN

Tính thích nghi cao Hiệu quả cao, VSV

đã quen với điều kiện sx công nghiệp

Yêu cầu trình

độ cao, thiết

bị hiện đại

Các trung tâm lưu trữ giống trên thế giới và Việt Nam

ABBOTT : Abbott Lab, North Chicago, III.60064, USA

ATCC : America Type Culture Collector, 12301, Parklaw

Drive Rockvill Md20852, USA

HIR : Food and Fermentation Divisio, Hokkatdo Profectural

Industrial Research Institute Saporo, Japan

FERM : Fermentation Research Institute, Agency of

Industrial Science and Technology Ministry of Industrial

Trade and Industry, Chiba, Japan

VTCC, IMBT , National University, HaNoi, VietNam

quốc gia, HN)

Bảo tàng giống: www.bacteriummuseum.org

2.1.3 Kỹ thuật nhân giống

Nhân giống trong PTN Nhân giống trong quy mô sx lớn

PPnhân giống khởi động truyền thống và hiện đại

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống

Thành phần các chất trong MT nhân giống (không

chứa chất kháng sinh, chất ức chế) Penicillin,

chloramphenycol … ức chế sinh trưởng của VK lactic

Nồng độ các chất trong MT nhân giống Nồng độ

đường hoặc muối cao tăng p thẩm thấu ức chế VSV

pH: chọn pH của MT nhân giống = pHopcủa VSV

pH ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt tế bào tích điện khác

nhau làm cho hoạt độ các loại enzyme VSV thay đổi

pH ảnh hưởng đến sự phân ly của các chất dinh dưỡng

có trong MT

Nhiệt độ: chọn To nhân giống = To

opcủa VSV

Quan sát đại thể

 Quan sát vi thể

Kiểm tra hoạt lực giống VSV (thoái hóa)

Giống VSV bị tạp nhiễm, thoái hóa phải phân lập lại hoặc thay giống khác

2.1 4 Kỹ thuật kiểm tra chất lượng của giống VSV

Kiểm tra độ thuần của giống

thường xuyên (bị nhiễm từ ống gốc)

Khử trùng MT dinh dưỡng; với các

chính VSV tiết ra

2.1.5.1 Huấn luyện thích nghi giống vi sinh vật

Mọi VSV đều có khả năng thích nghi rất cao với môi trường

Những tác động môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên

tính thích nghi bền vững

Khi tạo được tính thích nghi của VSV phải luôn duy trì tác động

ởmức độ đã tạo ra tính thích nghi Đặc điểm này không bền

Yêu cầu: người thực hiện phải có tính kiên trì

2.1.5 Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống

Khuẩn lạc nấm men trên Hansen Agar có hàm lượng

đường 26, 28% (phương pháp huấn luyện giống)

2.1.5.2 Đột biến VSV

Đột biến bằng tác nhân vật lý ( tia U.V):

Tia U.V được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chọn giống

VSV Tia U.V có khả năng tạo ra các đột biến có chất lượng cao

hơn chủng loại ban đầu hàng trăm lần.

Tia U.V ở λ=260nm thường gây ra những đột biến điểm cao

nhất Đây là loại bức xạ không ion hóa và gây ra những biến

đổi base chứa nitơ trong gen.

Đột biến bằng tác nhân hóa học (kháng kháng sinh):

Dùng môi trường có kháng sinh để tìm các dạng đột biến bền

vững (kháng kháng sinh) Trên môi trường này, các tế bào mẫn

cảm với kháng sinh sẽ bị giết chết, chỉ còn các tế bào đột biến

TN tiến hành với vk E.coli Nuôi cấy E.coli ở nồng độ pha

loãng 10 -1 trong các môi trường bổ sung kháng sinh

2.1.5.3 Lai giống nấm men

Nguyên tắc:

Từ 2 giống nấm men giống nhau ta có thể tạo ra được giống

nấm men mới có những đặc tính của cả 2 loài ban đầu bằng

cách cho chúng tiếp xúc với nhau trong điều kiện thí nghiệm.

Nhược điểm :

•Tỷ lệ thành công không cao.

•Sự pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một lòai nhất định.

•Các giống VSV khác nhau thì không thể tiến hành quá trình

lai giống được.

Cách thực hiện lai giống nấm men

1 Cấy 2 giống men vào môi trường đầy đủ M1(môi trường

4 Kiểm tra giống thu nhận có phải là lưỡng bội thể bằng

cách: Cấy khuẩn lạc trên môi trường M2 vào môi trường

5 Làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi, nếu thấy nang

chứa 4 bào tử (tế bào lưỡng bội thể) chứng tỏ lai thành

công.

6 Kiểm tra tính trạng cần quan tâm.

2.1.5.4 Sử dụng kỹ thuật di truyền hiện đại

Kỹ thuật biến đổi gen để tạo ra các sinh vật có tính trạng đích

theo ý muốn

Súng

bắn

gen

Mục đích: đảm bảo được tính chất của giống (duy trì gần như

nguyên vẹn đặc tính ban đầu của giống VSV trước lúc cất

giữ) đủ tiêu chuẩn cho quá trình sản xuất.

Nguyên tắc: làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV,

đồng thời ngăn cản sự sinh sản của chúng.

Phương pháp:

Bước 1: Tiền bảo quản (thuần hóa giống) Chọn chủng VSV ở

điều kiện và giai đoạn tối ưu cho bảo quản.

Bước 2: Chọn phương pháp thích hợp cho bảo quản.

2.1.6 Kỹ thuật bảo quản giống VSV

2.1.6.1 Bảo quản giống trong thạch nghiêng (cấy truyền định kỳ)

Nguyên tắc : luôn đổi mới tế bào, không gây ra bất thường.

Biện pháp: môi trường tối thiểu, nếu môi trường giàu dinh

dưỡng, VSV phát triển nhanh sẽ thoái hóa nhanh.

Ưu: đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, thích hợp ở quy mô nhỏ

Nhược điểm: tốn thời gian, thời gian BQ ngắn (1- 2 tháng)

Vô tình đã huấn luyện VSV sống ở điều kiện lạnh, làm biến đổi

giống VSV ban đầu.

2.1.6.2 Bảo quản giống trong lớp dầu khoáng

Nguyên tắc: ức chế quá trình hô hấp ở VSV trong cả VSV yếm

khí và hiếu khí, hạn chế tiếp xúc với oxy, ngăn hiện tượng

mất nước của môi trường và VSV.

Biện pháp : đổ 1 lớp dầu khoáng hoặc parafin lỏng

Nhược điểm: Có lẫn dầu

2.1.6.3 Bảo quản giống trong cát, đất sấy khô

Nguyên tắc: Sử dụng đất, cát như những giá thể mang Khi độ

ẩm môi trường giảm tối thiểu, VSV không phát triển nữa (Đất

và cát là môi trường tối thiểu)

Cách thực hiện: Xử lý đất, cát (rây đều, ngâm trong HCl hoặc

H 2 SO 4 đậm đặc 8-12h Rửa dưới vòi nước cho đến pH trung tính,

sấy đất, cát > 100 0 C BQ ở điều kiện vô trùng.

VSV được nuôi ở môi trường thạch Đổ cát, đất đã vô trùng vào

ống nghiệm, lắc đều, sau đó rót qua ống nghiệm khác Hàn kín

miệng ống

trường, trong nông nghiệp (phân bón) không đòi hỏi mức độ

tinh khiết cao Sử dụng bảo quản giống VSV tạo bào tử.

Thời gian bảo quản dài (2 năm)

Nhược điểm: không dùng trong sản xuất công nghệ thực phẩm

2.1.6.4 Bảo quản giống trong các hạt ngũ cốc

Nguyên tắc : sử dụng hạt ngũ cốc như giá thể mang

Thường sử dụng BQ các nấm sợi và VSV trong thực phẩm

Mục đích : giữ VSV ở trạng thái tiềm sinh.

Cách thực hiện : Hạt ngũ cốc rời, hấp chín, nuôi nấm mốc trực

tiếp (3 – 5 ngày), sấy ở t 0 < 50 0 C đạt độ ẩm W <15%.

Nhiệt độ bảo quản : 15 – 20 0 C

Thời gian bảo quản : 2 năm (châu Âu), 1 năm (Việt nam)

2.1.6.5 Bảo quản giống trong giấy lọc

Nguyên tắc: áp dụng với VSV có bào tử Ngoài giấy lọc, có thể

sử dụng B.C (bacterium cellulose)

Cách thực hiện :

1 Chuẩn bị giấy lọc vô trùng:Cắt giấy lọc 1 – 3 cm Cho giấy

lọc đã cắt vào ống nghiệm, đậy nút bông, sấy 160 0 C/ 2h hoặc

khử trùng 121 0 C/30’.

2 Nuôi VSV trong môi trường lỏng đến khi tạo thành bào tử

3 Dùng pi pet vô trùng hút 1 giọt Vi khuẩn vào giấy lọc Sấy ở

40 0 C dến khi thấy miếng giấy lọc khô thì chuyển giấy lọc vào

ống nghiệm

Thời gian BQ: 5 năm

2.1.6.6 Bảo quản giống trong gelantine

Cách thực hiện :

1 Chuẩn bị môi trường: Môi trường N.B bổ sung 10%

gelantin và 5% acid ascorbic Khử trùng 121 0 C/ 15’

2 Chuẩn bị giống VSV: nuôi giống VSV

3 Trộn VSV với môi trường.

4 Dùng ống nhỏ giọt vô trùng tạo thành từng giọt

gelantine nhỏ Sấy khô trong tủ hút chân không

2.1.6.7 Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh đông

Nguyên tắc: Sự phát triển của VSV sẽ bị ức chế ở nhiệt

độ lạnh sâu Cần sử dụng chất bảo vệ VSV (glycerin

15%, saccharose 10% + gelantin 10% Giúp VSV

không bị chết ở nhiệt độ lạnh sâu

Thời gian BQ :

ở -30 0 C: 9 tháng

ở - 40 0 C: 1 năm

ở - 70 0 C: 10 năm

2.1.6.8 BQ giống bằng pp đông khô (được sử dụng trong

các ngân hàng giống, cơ quan nghiên cứu lớn)

Nguyên tắc : sấy ở nhiệt độ thấp trong điều kiện chân không,

không ảnh hưởng đến chất lượng giống và có thể tạo ra các

ống giống theo quy mô công nghiệp.

Cách thực hiện : giống, nhân giống trong môi trường lỏng, kiểm

tra giống (đặc điểm sinh hóa, sinh lý), nếu đạt tiêu chuẩn,

máy đông khô 24h, hàn nắp lại.

Thời gian bảo quản : 20 năm

thường, thời gian bảo quản dài

Nhược điểm: chi phí lớn

2.2 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN (the kinetics of

the fermentation processes)

2.2.1 PHƯƠNG TRÌNH MONOD

2.2.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT LM

Mục đích nghiên cứu động học

•Thiết kế 1 quá trình lên men mới

•Đánh giá hiệu quả của qt lên men đang thực hiện

•Cải tiến quá trình (chất lượng, năng suất, giảm chi phí)

•Nâng cấp hoặc giảm quy mô sx

cells

biomass

CO2

H2O Products nutrients

¿How to describe a fermentation process?

Conversion process of nutrients to products

of the microbial metabolism

Rest of the nutrients

Yield – is an indicator of the efficiency of the process.

From “chemical engineering”: the Yield is stoichiometry of the reaction.

Y X/S : biomass-substrate yield = c · Mr(Biomass) / Mr(Substrate)

Y P/S : product-substrate yield, is calculated through “d”

Y P/X : product-biomass yield, is calculated through “d/c”

Carbon &

Energy source + O 2

Nitrogen source

+

Other required nutrients

+ Cells + Products + CO 2 + Heat + H 2 O

Monitor the consumption

of the carbon source:

Monitor the consumption

of the nitrogen source:

Chemical analysis NH3 electrode pH-stat Nitrate electrode

Monitor the consumption of essential nutrients:

Chemical analysis Ion selective electrodes

Measure cell components:

Protein DNA and RNA Carbohydrates

& Lipids Enzymes

Monitor product formation:

Chemical analyses Mass spectrometer

pH and viscosity Chromatography (gas and HPLC) Enzyme electrode

Monitor CO2 production:

IR analysis Mass spectrometer

Energy balance Heat evolution

Direct estimation of cell mass:

• Cell dry or wet weight

Methods for monitoring fermentation kinetics

Ảnh hưởng của loại cơ chất tới µ

Loại cơ chất µmax (h-1)

Glucose 0,28

Maltose 0,22

Maltotriose 0,18

dt dX X

µ: tốc độ tạo sinh khối riêng (Specific growth rate)

S K

K

S S K

S

2 max

+ +

= µ

µ

2.2.1.Phương trình Monod µ : tốc độ tạo sinh khối riêng (sự gia

tăng sinh khối trong 1 đơn vị thời gian (ngày, giờ) từ 1 đơn vị sinh khối X).

µ = dX/XdT (1/ngày; 1/giờ) µmax: hằng số tốc độ sinh trưởng max [S]: nồng độ cơ chất

Phương trình Monod: mối liên hệ giữa nồng độ cơ chất và

tốc độ sinh trưởng của VSV

Ý nghĩa thực tiễn của pt Monod:

Tính được, dự đoán được tốc độ tạo sinh khối riêng (µ) ở

nồng độ cơ chất (S) nhất định

Hạn chế :

- Pt Monod không đúng khi [S] quá cao Khi [S] quá cao thì

µ giảm do [S] quá cao: tạo áp suất thẩm thấu, ức chế VSV

- Pt Monod chỉ đúng trong một khoảng giới hạn của [S]

2.2.1.Phương trình Monod (tt)

2.2.2.1 Ảnh hưởng của giống VSV

2.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

2.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Khi nhiệt độ tăng, hằng số tốc độ phản ứng tăng, tốc độ

phản ứng tăng

Khi giảm nhiệt độ, tốc độ phản ứng giảm, nhưng có tính

thuận nghịch Nếu ta tăng nhiệt độ trở lại vùng tối ưu thì

hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng sẽ tăng trở lại

2.2.2.4 Ảnh hưởng của pH

enzyme VSV chỉ hoạt động tốt ở pH nhất định

pH tối ưu của mỗi VSV là khác nhau

2.2.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác: chất ức chế

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lên men

2.3 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ LÊN MEN

2.3.1 Chuẩn bị môi trường lên men

2.3.2 Tiệt trùng trong công nghiệp lên men

2.3.3 Các phương pháp lên men

2.3.4 Các thiết bị lên men

www.gbd.edu.vn

2.3.1 Chuẩn bị môi trường

Nguyên tắc thiết lập môi trường:

-Đủ chất và đủ lượng

-Dựa trên nhu cầu dinh dưỡng của VSV về:

Các nguyên tố cơ bản (Macroelements: 90-95% dry mass):

C, H, N, H, O (Conc: > 10-4 mol/L)

Các nguyên tố khoáng (Microelements): Ca, Mg, Fe, Zn,

Mn, Fe, Cu, B, Cr, Mo

Yếu tố sinh trưởng (Growth factors): vitamin B, Amino acids,

hợp chất khác (acid béo, acid nucleic)

Môi trường lỏng: chất khô, pH

Môi trường rắn: độ ẩm, chất độn (trấu, rơm…)

www.gbd.edu.vn

Các bước để chuẩn bị môi trường

2.3.2 Tiệt trùng trong công nghiệp lên men

Tiệt trùng không khí: phương pháp vi lọc, …

Tiệt trùng/ thanh trùng môi trường:

-Phương pháp vật lý: nhiệt độ, nhiệt độ + áp suất, vi lọc

-Phương pháp hóa học: điều chỉnh pH, bổ sung SO2…

-Tiệt trùng thiết bị, hệ thống đường ống, nhà xưởng :

U.V, xông formol, hóa chất tẩy rửa…

Phân loại phương pháp lên men:

Theo sự phát triển của VSV trong môi trường:

Lên men chìm: LM trong các fermentor với môi trường lỏng

Lên men bề mặt: LM trong các khay với môi trường lỏng

hay môi trường có cơ chất rắn hay xốp

Theo nguyên lý hoạt động của thiết bị (Operation mode)

Lên men tĩnh (lên men theo mẻ) (batch culture)

Lên men tĩnh có bổ sung cơ chất (fed – batch culture)

Lên men liên tục (continuous culture)

Điều kiện lên men

Lên men hiếu khí: thông khí bằng hệ thống trục khuấy có

sục khí (sx biomass)

Lên men kị khí (sản xuất rượu, bia)

2.3.3 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Lên men tĩnh được coi là 1 hệ khép kín do không

có tác động của các yếu tố bên ngoài (trừ khí)

Cell growth can be expressed as:

 Dry cell weight (g dry biomass /L culture)

 Wet cell weight (g wet biomass /L culture)

 Optical density (O.D)

 Cell counts on Petri dishes

Other parameters used for the characterization of batch cultures

 Number of generations or duplications

 Duplication time

 Yields: Product/Substrate (YP/S); Biomass / substrate (YX/S)

 Productivity: Volumetric productivity (P); Specific productivity (qP)

Pha Lag: dài từ vài phút tới vài giờ.

Tlag = f (đk môi trường: pH, T o , MT nuôi cấy và VSV).

Tlag không tạo ra sp, ảnh hưởng tới tổng năng suất của qt LM

LnX

Năng suất = Lượng SP mong muốn (g/L)

Tổng thời gian lên men (h)

Adaptation Phase Exponential Phase Stationary Phase

=

Inoculum culture medium

Fermentor culture medium

Biomass in + Biomass grow = Biomass out + Cumulative Biomass

In a Batch fermentor: grow = cumulative

For substrate:

Substrate in = Substrate out + Metabolized substrate + Cumulative

substrate

In Batch fermentor: 0 = metabolized + cumulative

Mass Balance in batch culture

Lên men theo mẻ- Batch culture

Đơn giản, hạn chế được sự

Xđ được MT dinh dưỡng, µ,

tốc độ tối ưu tạo thành sp

Năng suất thấp Nồng độ cơ chấtcao ức chế VSV

Không kiểm soát được tốc độsinh trưởng của VSV

Tính đồng đều của SP không cao

so với các PP khác

Chi phí lớn (hệ thống tiệt trùngbằng hơi nước, nước vệ sinh thiết

bị, điện, diện tích, sức lao động

Khắc phục nhược điểm của Batch culture bằng

Fed- Batch Culture và Continuous Culture

What is it?

Starts with a batch culture which, after a specific time, is fed with fresh

medium The addition of fresh medium can be synchronized with the

depletion of the growth-limiting substrate from the starting culture medium.

Lên men tĩnh có bổ sung cơ chất (Fed-batch culture)

Harvesting Fermentation

Fermentor inoculation

Preparation of the

starting culture

medium

Fermentor sterilization

Feed addition

Preparation of

the feed culture

medium

Lên men tĩnh có bổ sung cơ chất - Fed-batch culture

Ưu điểm ( Advantages) Nhược điểm ( Disadvantages)

Thời gian của các đk sinh trưởng

tối ưu được kéo dài do các chất ức

chế bị pha loãng và các chất dinh

dưỡng chính được chuyển hóa như

nhau ở mọi thời điểm LM

•Tăng năng suất của quá trình

do giảm 1 số công đoạn (rửa

thiết bị, tiệt trùng, loading và

Nếu số tế bào/thể tích môi trường quá lớn thì có khả năng

Possibility of induction of contact inhibition if the number of cells per culture volume is too large

What is it?

Starts with a batch culture to which, after a specific period, fresh culture medium

is added, and cells plus exhaust medium are removed at a rate that keeps culture

conditions constant When the interval between successive additions and

extractions decreases, the culture is named continuous and its volume remains

Fermentor sterilization 1

Feed addition

2

Feed sterilization

Fresh culture medium Air

Spent culture medium, cells, Air

Lên men liên tục - Continuous culture

•Dịch lên men luôn được bổ sung

nên các chất ức chế bị pha loãng

•Tăng năng suất của quá trình do

YX/S, YP/S không đổi (= constant)

•Điều khiển và kiểm soát được tốc

độ cơ chất chính vào thiết bị nên

duy trì µ ở YP/S tối ưu

•Tăng năng suất của quá trình do

giảm 1 số công đoạn (rửa thiết bị,

tiệt trùng, loading và unloading)

•Sản phẩm có tính đồng nhất cao

•Nguy cơ vấy nhiễm cao

•Khả năng xuất hiện đột biến cao

•Chi phí thiết bị đắt tiền

•So với các pp khác, pp này chưa có nhiều kinh nghiệm áp dụng ở quy

mô công nghiệp

PHÂN LOẠI THIẾT BỊ LÊN MEN

Theo nguyên lý hoạt động: fermenter hoạt động liên

tục, gián đoạn, bán liên tục

Theo cấu trúc thiết bị: fermenter có cánh khuấy

(Shaking Tank), không có cánh khuấy

Theo hình dạng thiết bị: Thùng (H/Ф ≤ 3); Tháp

(H/Ф > 3); Ống (dạng tháp để nằm ngang, ít sử dụng)

Theo năng suất: nhỏ, vừa, lớn

Fermenter Types: Shaking Tank, Bubble Column,

Airlift, Packed Bed, Fluidized Bed

2.3.4 Thiết bị lên men

Mechanical agitation

Variety of de impelents

Baffles **

Working volume = (60-70) % of V tank

Height – Diameter ratio H/D =1; H/D > 1

Heat transfer in bioreactors

a) Continuous jacket

b) External coiled jacket

c) Internal coiled jacket

d) Coiled baffles

e) With external heat interchanger

Fermentor lên men bia tại Jangjing Beer Chụp bởi BHQ 2007

www.gbd.edu.vn

Spontaneous,

natural processes Submerged Anaerobic & Superficial Aerobic cultures Submerged Aerobic Culture

CHmOl + aNH3 + bO2→ ycCHpOnNq + zCHrOsNt + dCO2 + cH2O

The oxygen demand of the cell and the low solubility of oxygen in

water, required a continuous air supply into the fermentor and a

continuous transfer of oxygen from the gas phase into the liquid

phase

How is the oxygen transfer into the fermentor?

Cần xđ nhu cầu oxy

Oxygen Mass Balance:

O 2 in - O 2 out = O 2 metabolized + O 2 cumulative

O2 in = yO2 in·QAir·ρAir

O2 out = yO2 out·QEA·ρEA

O2 metabolized = qO2·X·V

O2 cumulative = d(CO2·V)/dt = V·dCO2/dt Assuming: QAir·ρAir = QAE·ρAE

∆yO2·QAir·ρAir= V·(qO2·X + dCO2/dt)

OTR – Oxygen Transfer Rate

But the oxygen transfer in a fermentor finds

resistances before to reach the cells

Mass transfer takes place by two basic processes: Convection

and Diffusion

Therefore, a full treatment of mass transfer requires a fully

known flow field

However, a simplified treatment in which the overall mass

transfer is schematically divided into different transfer steps is

used with good results

1 Diffusion of the O2from the bulk gas

to the gas liquid interface

2 Transport across the gas liquid interface

3 Diffusion of the O2 through a relatively stagnant liquid region adjacent to the gas bubble

4 Transport of O2 through the mixed liquid to a relatively unmixed liquid region surrounding the cells.

well-5 Diffusion throught the stagnant region surrounding the cells.

6 Transport from the liquid to the pellet cell aggregate

7 Diffusive transport of oxygen into the pellet

8 Transport across the cell envelope

9 Transport from the cell envelope to the intracellular reaction site e.g

mitochondria

5, 6 and 7 are relevant only for processes in which pellets or cell aggregates appear

General mechanism of O2 transfer

How we can improve the YP/X?

Strain development approach

- Fermentation process optimization

2.4 CẢI TIẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Phần 3: Công nghệ lên men ứng dụng

3.1 Lên men ethanol và các ứng dụng

3.2 Công nghệ sản xuất acid hữu cơ thực phẩm

3.3 Công nghệ sản xuất acid amin

3.4 Công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật

3.5 Công nghệ sản xuất polysaccharide từ VSV

3.6 Công nghệ enzyme

3.7 Công nghệ sx các sp lên men truyền thống

www.gbd.edu.vn

3.1 LÊN MEN ETHANOL VÀ CÁC ỨNG DỤNG

3.1.1 Công nghệ sản xuất ethanol

3.1.2 Công nghệ sản xuất rượu cao độ

3.1.3 Công nghệ sản xuất bia

3.1.4 Công nghệ sản xuất rượu vang

www.gbd.edu.vn

3.1.1.1.GIỚI THIỆU VỀ ETHANOL

3.1.1.2 NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT ETHANOL

3.1.1.3 PP SẢN XUẤT ETHANOL

3.1.1.4 SẢN XUẤT ETHANOL BẰNG PP LÊN MEN

3.1.1.5 CHƯNG CẤT & TINH CHẾ ETHANOL SAU

LÊN MEN

3.1.1.6 SẢN PHẨM CỦA QUÁ TRÌNH LM ETHANOL

3.1.1.7 ETHANOL – GREENFUEL

3.1.1 Công nghệ sản xuất ethanol

3.1.1.1 GIỚI THIỆU VỀ ETHANOL

•Các hình ảnh khảo cổ về việc làm rượu từ khi nền

nông nghiệp xuất hiện (người Xume, 4000 B.C)

•Tìm thấy rượu trong lăng mộ của người Ai Cập

Độc đối với người và VSV

Ảnh hưởng của ETHANOL với sức khỏe người

Uống ít không gây ảnh hưởng đến tim nhưng uống nhiều có thể

làm tê liệt hệ thống thần kinh và gây ảnh hưởng xấu đến hệ thống

tuần hoàn máu.

Lượng rượu trong máu: 0.5‰ - 2‰ có thể gây say

4‰ có thể dẫn đến chết người.

Hấp thụ nhanh vào thành dạ dày (29%) (xảy ra nhanh nhất khi

dạ dày rỗng) phần còn lại được hấp thu ở ruột non.

Ethanol được hấp thu sẽ được oxy hoá 90-98 % Người trưởng

thành có thể oxy hoá khoảng 10 ml/h, phụ thuộc vào nồng độ cồn

trong máu Uống nhiều sẽ gây sự hấp thu nhanh hơn tốc độ oxy

hoá, dẫn đến gây độc.

Ethanol không được oxy hoá có thể rời cơ thể theo phổi và thận,

nó cũng có thể được tìm thấy trong mồ hôi, nước mắt, mật, nước

miếng ở lượng nhỏ.

Ảnh hưởng của ETHANOL với sức khỏe người

Methanol (rượu gỗ) là một chất độc chết người, gây cho những

người nghiện rượu tình trạng mù hay chết.

 Methanol dần dần thấm vào ruột non khi nhóm methyl của

aspartame gặp enzyme chymotripsin.

Một đánh giá của EPA về trạng thái của methanol cho rằng

“methanol được xem như một độc chất được tích luỹ vì tỉ lệ bài

tiết rất thấp”.

 Trong cơ thể, methanol được oxy hoá thành formaldehyt và

acid formic; cả hai chất chuyển hóa này đều là chất độc thần

kinh chết người.

 Liều lượng tiêu thụ cho phép khoảng 7,8mg / ngày

Ảnh hưởng của FURFUROL với sức khỏe người

Là chất độc với hệ thần kinh, gây nhức đầu, buồn nôn.

Uống rượu có hàm lượng furfurol cao quá mức cho phép

gây tích tụ trong dịch của phổi (phù phổi).

Fufurol có thể gây dị ứng da, nếu sự dị ứng phát triển cao,

có thể gây ngứa và nổi mụn ở da Tình trạng trên nếu tiếp

tục có thể gây mất vị giác, tê lưỡi, đau đầu, mệt và rùng

mình Tình trạng kéo dài có thể ảnh hưởng tới gan.

Tiếp xúc lâu dài với furfurol có nguy cơ gây ung thư và

nguy cơ đối với sinh sản.

Ảnh hưởng của ETHANOL với VSV

Ethanol xâm nhập vào màng tế bào VSV, gây

đông tụ một số protein, ảnh hưởng đến quá trình

TĐC của tế bào VSV bị chết hoặc bị ức chế

Sản lượng ethanol trên TG

Brasil: sx 0,9-1 triệu lít ethanol/ ngày (đứng đầu thế giới)

2007, sản lượng ethanol toàn cầu: 55,7 tỷ lít

2015, sản lượng ethanol toàn cầu: 162 tỷ lít (Theo FAO,

Ủy ban Kinh tế Mỹ Latinh (CEPAL) và Ngân hàng phát triển

Braxin (BNDES)

www.gbd.edu.vn