- Globuli n Nấm men Spirulina
LÊN MEN BỀ SÂU (TG)
150 viên/hộp,70.000đ/hộp; 15 viên/ngày
LÊN MEN BỀ SÂU (TG)
Nguồn enz nội bào Nguồn enz ngoại bào
Loại bỏ tb (Ly tâm/lọc) Thu nhận tb (Ly tâm/lọc)
Phá vỡ tb (đồng hĩa) Loại bỏ vách, mảnh vỡ tb (Ly tâm/lọc) Cơ đặc (Siêu lọc/tủa) Bổ sung chất bảo vệ, chất ổn định VSV Enz lỏng Enz bột Sấy phun 3.6.3.2. Quy trình sx enz từ VSV (tt) PP LÊN MEN LÊN MEN BỀ MẶT (VN)
(Solid state fermentation)
Ưu:đầu tưít
Nhược: diện tích lớn
Canh trường thu nhận được là tổhợp của nhiều enzyme
LÊN MEN BỀ SÂU (TG)
(Submerged fermentation)
Ưu:
•Lượng cơchất sĩt thấp
•Tự động hĩa, cơ giới hĩa
•Khơng cần laođộng thủ cơng
•Áp dụng phổ biến
•Thu nhận 1 enzyme vượt trội so với các enzyme khác
•Hoạt tính enzyme cao
(tính theo hàm lượng cơ chất trong mơi trường hoặc theo g chất khơ của canh trường)
3.6.3.2. Quy trình sx enz từ VSV (tt)
Thu nhận sinh khối enz thơ
Enz ngoại bào Enz nội bào Xử lý dịch lên men Thu sinh khối Phá vỡ tế bào Loại bỏ vách, mảnh vỡ tb Cơ đặc và bước
đầu tinh sạch enz
Tủa Thẩm tích Cơ đặc Siêu lọc Tinh sạch enz = kỹ thuật sắc ký 3.6.3.2. Quy trình sx enz từ VSV (tt)
3.6.3.2.1. Thu nhận sinh khối enzyme thơ
CANH TRƯỜNG LỎNG
Enz ngoại bào: lọc, ly tâm, thu phần lỏng, dịch enz thơ là canh trường lỏng
Enz nội bào: lấy canh
trường , ly tâm, lọc thu sinh khối, phá vỡ màng tế bào để
trích ly enzyme. Ly tâm, lọc, dịch lỏng là enzyme thơ
CANH TRƯỜNG RẮN (thu nhận enz nội bào, áp dụng cho nấm mốc và xạ khuẩn) Lấy canh trường đem nghiền
để phá vỡthành tế bào (nếu canh trường tơi xốp thì khơng cần nghiền), trích ly bằng nước muối 0,9%, lọc, lấy phần lỏng.
PP PHÁ VỠ THÀNH TẾ BÀO VSV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
VẬT LÝ: nghiền bằng bi thủy tinhФ 0.2 – 0.3mm, nén áp lực
HĨA HỌC: trộn tb với các chất oxi hĩa khử mạnh như
benzen, hexan, tạo thành lỗ thủng trên màng tb
Nhược điểm: các dung mơi hữu cơ, chất tẩy rửa cĩ thể
làm vơ hoạt, biến tính enz SINH HỌC: tựphân, enz HĨA SINH
KẾT HỢP
3.6.3.2.2. Phá vỡ tế bào
2. Ly tâm: 30.000 v/p trong 45’
Ưu: thích hợp đểtách enz khỏi tb, mảnh vỡ tb Nhược: chi phí cao
4. Lọc
Lọc sâu: depth filter: giữ tb, mảnh vỡ tb trên bề mặt màng và
ởsâu bên trong màng
Lọc màng: giữ tb, mảnh vỡtb trên bề mặt màng. Ф0.2 - 10µm Lọc màng rẻ, thao tác đơn giản nhưng p nén, bít lỗ lọc, thủng màng lọc. Cĩ thể dùng màng nhiều lớp,Ф lỗ lọc giảm dần
3. Tách dịch 2 lớp
1.Tách acid nucleic và lipid: Sử dụng nuclease tách nucleic. Tách lipid bằng cột lọc nhồi vải hoặc bơng thủy tinh cĩ độ
xốp nhỏ
Thứ tự xếp màng trong thiết bị lọc màng (kích thước lỗ màng lọc từ ngồi vào trong 5, 1, 0.45µm) 3.6.3.2.3. Loại bỏ vách, mảnh vỡ tb (tt) Dextran Polymer polyethylence glycol (PEG) Phase dextran chứa tb, mảnh vỡ Phase PEG chứa enz PP tách dịch 2 lớp
ít sử dụng trong cơng nghiệp
3.6.3.2.4. Cơ đặc và bước đầu tinh sạch enzyme Tủa Dung mơi hữu cơ (ethanol, propanol, acetone) làm lệch cân bằng tương tác, giảm độ hịa tan của Pr. Tiến hành ở 4– 10oC. Vdung mơi/ Vdd enz = (2.5 – 3)/1 Muối (Na2SO4, (NH4)2SO4, NaCl) + nước làm mất lớp vỏ hydrate của Pr. Các Pr liên kết với nhau, kết tủa. Tách muối = pp thẩm tích Polymer: được sử dụng rộng rãi. PEG MW 6000, 12000 tỷ lệ 5 -15% w/v. Tiến hành ở 37oC. Cơ chế giống dung mơi hữu cơ Tủa ở pI: tại pI, Pr cĩ độ
hịa tan thấp, độ hydrate hĩa của Pr min làm tăng tương tác giữa các Pr, dẫnđến tạo tủa
Thẩm tích: qt siêu lọc tách các LMW (thành phần đệm, peptid, muối, etylic, a.a…) ra khỏi dd Pr.
Tiến hành loại muối và lọc trước khi thẩm tích. Liên tục bổ sung dung mơi sạch vào dd Pr để lấy những phân tử cĩ LMW ra khỏi dịch nhờ qt thẩm thấu. tách những chất tích điện ra khỏi những chất khơng tích điện và ngược lại Thẩm tích 3.6.3.2.4. Cơ đặc và bước đầu tinh sạch enz (tt)
Cơ dịch enz = chất trao đổi ion
Cơ dịch enz = siêu lọc 3.6.3.2.4. Cơ đặc và bước đầu tinh sạch enz (tt)
Cơ dịch enz = chất trao đổi ion Nguyên lý: điều chỉnh pH và lực ion để tạo tủa chứa Pr gắn kết với chất traođổi ion mang dấu ngược với Pr. Ly tâmđểtách tủa, giải phĩng Pr khỏi chất traođổi ion, rửa chất trao đổi ion đểtái sửdụng
Chất trao đổi ion (chất mang) Kiểu trao đổi ion Diethyaminoethyl (DEAE) Trao đổi anion Quaternary ammonium (Q) Trao đổi anion Quaternary aminonium (QAE) Trao đổi anion Carboxymethyl (CM) Trao đổi cation Methyl sulphonate (S) Trao đổi cation Sulphopropyl (SP) Trao đổi cation 3.6.3.2.4. Cơ đặc và bước đầu tinh sạch enz (tt)
Cơ dịch enz = siêu lọc Ưu: khơng làm mất hoạt tính Pr, hiệu suất tách cao. Nhược: dễ bị bít lỗ lọc Màng lọc cĩ Ф1 – 20nm để tách Pr cĩ MW từ 1 – 300kDa. Vật liệu màng siêu lọc: chế tạo từ màng cellulose acetate hoặc cellulose nitrate, polyvinyl, polycarbonate.
3.6.3.2.4. Cơ đặc và bước đầu tinh sạch enz (tt)
Kỹ thuật sắc ký dựa trên tương tác của Pr với chất mangđểphân tách
Sắc ký lọc gel (gel filtration) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sắc ký traođổi ion (ion exchange chromatography) Sắc ký ái lực (affined chromatography)
Điện di (electrophoresis)
Tinh sạch enzyme = kỹ thuật sắc ký
Kỹ thuật sắc ký Bản chất
Sắc ký trao đổi ion Khác biệt về điện tích trên mặt Pr ở giá trị pH quy định
Sắc ký lọc gel Khác biệt về hình dạng và MW của phân tử
Sắc ký ái lực Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa Pr và ligand tương thích Sắc ký tương tác kỵ nước Khác biệt về tính kỵ nước trên bề mặt Pr Sắc ký đẳng điện Tách theo điểm đẳng điện của từng phân tử Pr Sắc ký trên nền hydroxyapatide Tương tác tổng hợp giữa Pr và chất mang Ca-phosphate Nguyên tắc hoạt động của các sắc ký thơng dụng 3.6.3.2.6. Bổ sung chất bảo vệ, chất ổn định •Các chất bảo vệ: propylene glycol, glycerol, sorbitol.
•Dịch enz cơ đặc: thường bổ sung thêm ammoniumsulfate, sodium sulfate, sodium chloride để tạo tủa hoặc tinh thể enz.
•Để giữ enz ở dạng huyền phù bổ
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN – PP BỀ MẶT
•ĐỘẨM
•CHIỀU CAO MƠI TRƯỜNG
•NHIỆT ĐỘ •CUNG CẤP OXY •pH •THỜI GIAN •THIẾT BỊ 3.6.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sx enz từ VSV
3.6.3.4. Đánh giá chất lượng chế phẩm enz
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM ENZYME
Hoạt tính xúc tác: sốđơn vị hoạt độ trong 1g/1mL chế phẩm Hoạt tính của E = sốđơn vị hoạt độ/g (mL)
Đơn vị hoạt tính của enz: số lượng enz cĩ khả năng xúc tác cơ chất/đơn vị thời gian
Sốđơn vị hoạt độ tỷ lệ thuận với hoạt tính enz và độ tinh sạch của enz
Độ tinh sạch: sốđơn vị hoạt độ cĩ trong 1mg Pr của chế phẩm (tính theo Pr vì bản chất của enz là Pr)
Các enz kỹ thuật là sản phẩm thơ, hoạt tính enz = 2 -5%Pr tổng số.
PP Các thơng số cốđịnh Theo dõi