Sự phát triển chồi in vitro ở cây dứa Ananas comosus Merr dưới tác dụng của auxin, cytokinin và sự thay đổi hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy

Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA ở các nồng độ khác nhau .... Kích thước vùng mô p

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-o0o -

TRẦN LÊ TƯỚC NGUYÊN

SỰ PHÁT TRIỂN CHỒI IN VITRO Ở CÂY DỨA ANANAS COMOSUS MERR DƯỚI

TÁC DỤNG CỦA AUXIN, CYTOKININ VÀ

SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG NITROGEN

TRONG MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY

Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Mã số: 01-05-17

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố HỒ CHÍ MINH, năm 2009

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

• Cô GS TS Mai Trần Ngọc Tiếng, Cô đã giảng dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

• Thầy PGS TS Bùi Trang Việt, Trưởng bộ môn Sinh Lý Thực Vật, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, Thầy đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm sống và động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn

• Cô TS Lê Thị Trung đã giảng dạy, hướng dẫn những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn

• Thầy TS Trần Du Sanh, Cô PGS TS Võ Thị Bạch Mai, Cô TS Lê Thị Đẹp đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn

• Thầy Ths Phan Ngô Hoang, Cô NCS Trần Thanh Hương, Cô Ths Trịnh Cẩm Tú, Cô Lê Thị Thanh Xuân, Ths Đỗ Thường Kiệt đã tận tình giúp đỡ, động viên và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm luận văn

• Cô Hồ Thị Thủy, Hiệu Trưởng trường Trung Học Phổ Thông Tân Thạnh cùng tập thể thầy cô đồng nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

• Các anh chị, các bạn lớp cao học khóa 14, 15, 16 và những người bạn thân Ngọc, An, Mai luôn bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ trong công việc và học tập

• Cuối cùng, con xin biết ơn Bố, Mẹ, anh chị hai bên và gia đình đã luôn yêu thương, lo lắng, giúp đỡ vật chất, tinh thần trong học tập cũng như trong công tác

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xxii

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ANANNAS COMOSUS MERR 2

1.1.1.Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm sinh học 2

1.1.2.1 Rễ 2

1.1.2.2 Thân 3

1.1.2.3 Lá 3

1.1.2 4 Chồi 4

1.1.2.5 Hoa 5

1.1.2.6 Quả 5

1.1.2.7 Hạt 6

1.1.3 Các giống trồng 6

1.1.3.1 Nhóm Caynen 7

1.1.3.2 Nhóm Queen 7

1.1.3.3 Nhóm Red Spanish 7

1.1.3.4 Nhóm Abacaxi 7

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng và công dụng 8

1.1.4.2 Công dụng 9

1.2 Sự phát triển chồi 10

1.2.1 Sự phát triển 10

1.2.2 Mô phân sinh ngọn 10

1.2.2.1 Cấu trúc mô phân sinh ngọn 10

1.2.2.2 Yếu tố điều khiển kích thước của mô phân sinh ngọn 12

1.2.3 Sự phát triển chồi 13

1.3 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 18

1.3.1.Auxin 18

1.3.2 Cytokinin 20

1.3.3 Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin 21

1.3.4 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác 23

1.4 Ảnh hưởng của nitrogen trong quá trình phát triển chồi 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 27

2.1.1 Vật liệu nuôi cấy in vitro 27

2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP 28

2.2.1 Quan sát hình thái giải phẫu 28

2.2.2 Thí nghiệm sơ khởi 28

2.2.3 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật 34

2.2.3.1 Xử lý riêng rẽ 34

2.2.3.2 Xử lý phối hợp 34

2.2.3.3.Xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian 36

2.2.4 Tạo cụm chồi 37

2.2.5 Xử lý nitrogen 37

2.2.6 Tạo rễ 38

2.2.7 Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm 38

2.2.8 Phân tích thống kê 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 39

3.1.1 Quan sát hình thái giải phẫu 39

3.1.2 Thí nghiệm sơ khởi 39

3.1.2.1 Kích thước vùng mô phân ngọn ở ba vị trí non, trung gian và già 39

3.1.2.2 Sự tăng trưởng của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái theo vị trí mẫu cấy 42

3.1.2.3 Hàm lượng đường tổng số và tinh bột 43

3.1.2.4 Cường độ hô hấp 44

3.1.2.5 Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật 44

3.1.3 Xử lý các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 46

3.1.3.1 Xử lý riêng rẽ 46

3.1.3.2 Xử lý phối hợp 53

3.1.3.3 Xử lí phối hợp các chất điều hoà tăng trưởng thực vật theo thời gian 61

3.1.4 Tạo cụm chồi 62

3.1.5 Xử lý nitrogen 65

3.1.5.1 Thay đổi hàm lượng nitrogen tổng cộng 65

3.1.5.2 Thay đổi tỉ lệ NH4/NO3 .68

3.1.6 Tạo rễ 69

3.1.7 Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm 71

3.2 THẢO LUẬN 74 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.2 ĐỀ NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC .88

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIA : Acid indol acetic

ANA : Acid α - napthalen acetic

GA3 : Acid giberelic

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng chất dinh dưỡng trong cây dứa Ananas comosus Merr 9 Bảng 1.2 Nguồn gốc khác nhau của chồi bất định ở một số loài 14

Bảng 3.1 Kích thước vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian và

già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 39 Bảng 3.2 Chiều cao của sơ khởi chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở 3 vị trí non, trung gian, già trên môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l theo thời gian 42 Bảng 3.3 Hàm lượng đường tổng số của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 43 Bảng 3.4 Hàm lượng tinh bột của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 43 Bảng 3.5 Cường độ hô hấp của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 44 Bảng 3.6 Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già 45 Bảng 3.7 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA ở các nồng độ khác nhau 46 Bảng 3.8 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung ANA ở các nồng độ khác nhau 47

Bảng 3.9 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau 48 Bảng 3.10 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau 49 Bảng 3.11 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, ANA ở các nồng độ khác nhau 53 Bảng 3.12 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, AIA ở các nồng độ khác nhau 55 Bảng 3.13 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, ANA và GA3riêng rẽ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau 56 Bảng 3.14 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS bổ sung BA, AIA và GA3 riêng rẽ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau 57 Bảng 3.15 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian trên môi trường MS bổ sung BA, ANA hay AIA ở các nồng độ khác nhau, theo thời gian 58 Bảng 3.16 Số lá non màu xanh từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian trên môi trường MS có bổ sung BA, AIA, GA phối hợp theo thời gian sau 5

Bảng 3.17 Số sơ khởi chồi hình thành từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr sau 2 tuần nuôi cấy ở môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau 62 Bảng 3.18 Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi

ở vị trí trung gian trên môi trường MS có bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 10 ngày 65 Bảng 3.19 Số lượng chồi, chiều cao chồi, số lá và chiều dài lá từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi 67 Bảng 3.20 Số lượng chồi, chiều cao chồi, số lá và chiều dài lá từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với với tỉ lệ NH4/

NO3 thay đổi sau 5 tuần 68 Bảng 3.21 Số sơ khởi rễ tạo thành từ cây con 6 tuần tuổi của cây dứa Ananas comosus Merr sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau 69 Bảng 3.22 Chiều cao cây, số lá, sổ rễ và chiều dài rễ của cây con invitro sau 20 ngày chuyển ra vườn ươm 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ các loại lá dứa Ananas comosus Merr 4

Hình 1.2 Sơ đồ các dạng chồi dứa Ananas comosus Merr 5

Hình 1.3 Cấu trúc mô phân sinh ngọn 12

Hình 1.4 Các giai đoạn phát triển chồi ở cây Saintpaula ionantha 15

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển chồi bất định ở Lilium longgiflorum 16

Hình 2.1 Sơ đồ chỉ ba vị trí non, trung gian, già của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 29

Hình 2.2 Chiều ngang và chiều cao của mô phân sinh ngọn 29

Hình 2.3 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 33

Hình 2.4 Sơ đồ xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian 36

Hình 3.1 Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già 45

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 1.1 Cây dứa Ananas comosus Merr 2

Ảnh 1.2 : Sự phát triển chồi từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường

MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l 17 Ảnh 2.1 Chóp lá trên trái dứa Ananas comosus Merr 27 Ảnh 3.1 Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí non có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 40 Ảnh 3.2 Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 40 Ảnh 3.3 Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 41 Ảnh 3.4 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS (đối chứng) 50 Ảnh 3.5 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l 50 Ảnh 3.6 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l 51 Ảnh 3.7 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l 51

H 3.8 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian khi ngâm trong GA3 100 mg/l 1h sau 10 ngày trên môi trường MS 52 Ảnh 3.9 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung GA3 10mg/l 52

Ảnh 3.10 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và ANA 0,5mg/l 54 Ảnh 3.11 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ngọn ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l 54 Ảnh 3.12 Chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l 59 Ảnh 3.13 Chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 20 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l 59 Ảnh 3.14 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l 60 Ảnh 3.15 Sơ khởi chồi hình thành từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr sau 2 tuần nuôi cấy ở môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l 63 Ảnh 3.16 Cụm chồi từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy 63 Ảnh 3.17 Cụm chồi từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr trên môi trường MS bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l sau 6 tuần nuôi cấy 64 Ảnh 3.18 Sự tăng trưởng chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian MS nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l AIA 0,1mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 20 ngày 66 Ảnh 3.19 Sự tăng trưởng chồi từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trong môi trường BA 1 mg/l AIA 0,1mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 5 tuần 67 Ảnh 3.20 Cây con in vitro trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,2

Ảnh 3.21 A, B Sơ khởi rễ hình thành từ chồi Ananas comosus Merr 6 tuần tuổi

trong môi trường AIA 2,5 mg/l sau 1 tuần nuôi cấy 70

Ảnh 3.22 Cây con in vitro 16 tuần tuổi 72

Ảnh 3.23 Cây con in vitro 16 tuần tuổi trước khi ra vườn ươm 73

Ảnh 3.24 Cây con in vitro 16 tuần tuổi sau khi ra vườn ươm 20 ngày 73

LỜI MỞ ĐẦU

Dứa (khóm) là một trong ba loại cây ăn quả hàng đầu (chuối, dứa, cam quýt)rất được ưa chuộng ở Việt Nam và trên thế giới Năm 1961 sản lượng dứa trênthế giới khoảng 3 triệu tấn, đến năm 2001 đạt hơn 13 triệu tấn Một số nước cósản lượng dứa cao như Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippin (1.571.904 tấn) hayBrazil (1.442.300 tấn)… (FAO, 2002) Năm 2004, với diện tích 43.350 ha sảnlượng 422.251 tấn, Việt Nam cũng là một trong những nước có sản lượng dứa caonhưng chủ yếu tiêu thụ trong nước do phẩm chất trái, quá trình chế biến…

Dứa là loại cây dễ trồng, chịu hạn cao, ít bị sâu bệnh, không kén đất Dứa tươichứa nhiều vitamin A, vitamin B, rất giàu vitamin C và các loại khoáng như: Fe,

Ca, Cu, P… , ít đường, chất béo, đặc biệt là có bromelin giúp tiêu hóa rất tốt(Wooster và Blank, 1950 trong Trần Thế Tục, 2002), chữa các vết thương, vếtbỏng, làm mau liền sẹo (Võ Văn Chi, 1977)

Đã có nhiều nghiên cứu khác nhau về cây dứa: vi nhân giống, sự phát sinh cơquan, sự tái sinh cây từ tế bào trần, từ mô sẹo với mục đích nâng cao phẩm chất,năng suất, rút ngắn thời gian sinh trưởng Nhiều phương pháp được áp dụng

nhưng tập trung chủ yếu vào nghiên cứu in vitro Nguyên liệu nuôi cấy in vitro ở

cây dứa chủ yếu là chồi, có thể từ chồi thân, chồi cuống, chồi ngọn hay chồingầm dưới mặt đất (Akbar và cộng sự, 2003)

Đề tài “ Sự phát triển chồi in vitro ở cây dứa Ananas comosus Merr dưới

tác dụng của auxin, cytokinin và sự thay đổi hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy “ được thực hiện với mục đích tìm hiểu sự phát triển chồi ở cây

dứa và đặc biệt là vai trò của auxin, cytokinin và hàm lượng nitrogen trong môitrường nuôi cấy

Chương 1:

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

1.1.GIỚI THIỆU VỀ CÂY ANANNAS COMOSUS MERR

1.1.1.Vị trí phân loại

Ngành : Magnoliophyta

Lớp: Liliopsida

Phân lớp: Liliidae

Liên bộ: Bromelianae

Bộ: Bromeliales

Họ: Bromeliaceae

Loài: Ananas comosus Merr

nh 1.1 Cây d a Ananas comosus Merr

Ananas comosus Merr đồng nghĩa A sativus Schult f., Ananas sativa Lindl., Bromelia ananas L., A comosa L.

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây dứa là cây thân cỏ Phần trên mặt đất cao 0,75 đến 1,5 m với độ xòe rộng(đường kính) 0,9 đến 1,2 m; lá vững chắc có dạng hoa hồng Lá hẹp dài 50 đến

180 cm với những gai nhọn dọc theo rìa lá (Morton và cộng sự, 1987)

1.1.2.1 Rễ

Rễ dứa thuộc loại ăn nông, nhỏ, phân nhánh, sâu 0,9 m và rộng 1 m, tập trung

ở lớp đất cách mặt 0 đến 15 cm (Trần Thế Tục, 2002) Người ta chia rễ làm 3nhóm:

• Rễ sơ cấp: phát sinh từ phôi của hột, chỉ thấy được khi trồng bằng hột

• Rễ phụ: là loại rễ quan trọng nhất của cây Rễ phụ mọc trên thân, phátsinh từ hệ thống mạch giữa vỏ và trung trụ Rễ mọc ở phần trên mặt đấtthường ít phân nhánh và dẹp (do các đáy lá ép lại) và chỉ mọc vòngquanh thân Phần rễ dưới mặt đất tròn hơn và phân nhánh nhiều hơn

1.1.2.2 Thân

Cây dứa trưởng thành cao khoảng 1 đến 1,2 m, đường kính tán rộng 1,3 đến1,5 m Khi bóc lá ra thân hình trụ thẳng, dạng chùy khoảng 25 đến 50 cm,đường kính 2 đến 5 cm ở đáy, 5 đến 8 cm ở đỉnh và chứa nhiều mắt, lóng(Bartholomew và cộng sư,ï 1977; Collin, 1960; Medina và cộng sự, 2005;Purseglove, 1972)

Trên thân cây dứa chia thành nhiều lóng và đốt Ở đốt thân mang nhữngmầm ngủ Các lóng từ phần giữa thân dài khoảng 1 đến 10 cm tùy giống vàđiều kiện môi trường Các lóng từ phần giữa thân trở lên dài hơn các lóng bêndưới Thân chia hai phần: vỏ và trung trụ Nơi tiếp giáp giữa vỏ và trung trụ cómột hệ thống mạch mỏng, chủ yếu gồm các tế bào gỗ và một ít tế bào libe Mômạch không liên tục bị thủng nhiều chỗ, tạo điều kiện cho các rễ phụ mọc ra từthân Trung trụ gồm một khối tế bào nhu mô có nhiều hạt tinh bột và tinh thể,trong đó các bó mạch xếp thành vòng xoắn ốc xuyên qua nhau thành một mạnglưới phức tạp

Nhiệt độ thích hợp của dứa là 25oC Ở 5oC đỉnh thân và gốc lá có những vếtcháy do rét Khi điều kiện ngập nước, thân và rễ bị thối (Trần Thế Tục, 2002)

1.1.2.3 Lá

Lá mọc hình xoắn ốc, non ở giữa, già ở ngoài cùng Lá thường dày, khôngcuống, hẹp ngang và dài Mặt lá có lớp phấn trắng hay một lớp sáp để giảmthoát hơi nước Hình dạng lá có gai hay không là tiêu chí để phân biệt cácgiống dứa

Số lá, độ lớn bé của lá phụ thuộc vào giống Có một mối liên quan giữa diệntích lá và trọng lượng quả Diện tích lá lớn, quả thường to còn diện tích lá bé,quả lại nhỏ

Các loại lá gọi tên theo thứ tự từ gốc đến ngọn (Tr n Th T c, 2002)

Hình 1.1 Sơ đồ các loại lá dứa

1.1.2 4 Chồi:

Dứa có các loại chồi như sau:

• Chồi ngọn: mọc ra ở đầu ngọn trái mang nhiều lá nhỏ, ít cong, gốc chồithẳng

• Chồi thân (chồi nách): mọc ra từ mầm ngủ trên thân, thường xuất hiện saukhi cây mẹ ra hoa Chồi thân to khoẻ, gốc chồi dẹp (do bị đáy lá ép lại),hơi cong

• Chồi cuống: mọc ra từ mầm ngủ trên cuống trái, ngay sát dưới đáy trái.Hình dạng hơi giống chồi thân nhưng nhỏ hơn, gốc chồi cong, phình to(giống dạng trái)

• Chồi ngầm (chồi rễ, chồi đất): mọc ra từ phần thân dưới mặt đất hay ởcổ rễ Chồi có lá dài, hẹp, mọc yếu do bị các lá bên trên che ánh sáng

Hình 1.2 Sơ đồ các dạng chồi dứa (Trần Thế Tục, 2002).

1.1.2.5 Hoa

Cây dứa có thể ra hoa khi được khoảng 70 đến 80 lá (Eeckenbrugge và cộngsự, 2003; Medina và cộng sự, 2005; Purseglove, 1972) Hoa gồm ba lá đài, bacánh hoa, sáu nhị xếp hai vòng, một nhụy có ba tâm bì và bầu hạ (Bartholomewvà cộng sư,ï 1977)

Cánh hoa màu xanh hay đỏ tía, gốc màu trắng nhạt, mặt trên cánh có vảy.Cả tràng hoa có dạng một ống dài hơi loe phía đầu, ở giữa lồi lên ba núm nhụytím mờ của vòi nhụy, ba tuyến mật thông ra gốc vòi nhụy qua các ống dẫn(Trần Thế Tục, 2002)

Hoa thường nở buổi sáng, khoảng 5 đến 10 hoa mỗi ngày nên mất 15 đến 20ngày mới nở hết hoa trên trái Hoa bất thụ, trừ khi lai với giống khác Nếu thụtinh, mỗi quả dứa có thể cho đến 3000 hạt (Pickersgill, 1976) Có khoảng 100đến 200 hoa trên mỗi quả

1.1.2.6 Quả

Quả kép khoảng 100 đến 200 quả con (hay hoa) hợp lại Sau khi thụ phấn,cánh hoa, nhị, vòi nhụy tàn héo, gốc lá bắc mập ra, cong úp lên che các lá đài,

các lá đài trở nên có thịt và hợp lại tạo thành núm, khi quả gần chín chúng dẹpxuống thành mắt của quả Các trái con dính vào một trục phát hoa gọi là cùitrái, cùi khóm kéo dài ra bên ngoài gọi là cuống trái.

Hình dạng quả và mắt quả thay đổi tuỳ theo loài Màu thịt trái khi chín thayđổi từ trắng đến vàng đậm (Morton và cộng sự, 1987) Bộ phận ăn được củadứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển thành Thời gian từ khi trổ hoađến khi thu hoạch kéo dài 3 tháng (nhóm Queen)

Độ lớn của quả phụ thuộc vào giống, loại chồi đem trồng, sức sinh trưởngcủa cây, kĩ thuật thâm canh, điều kiện khí hậu Quả có thể đạt đến trọng lượng

2 đến 3 kg hay hơn (Bartholomew và cộng sự, 1977) Nhiệt độ thích hợp choquả phát triển là 15oC Nhiệt độ cao độ chua trong quả tăng, phẩm chất quảkém (Tisseau và cộng sự, 1963)

1.1.2.7 Hạt

Nếu thụ phấn tự do dứa thường không có hạt Hạt xuất hiện khi lai các giốngvới nhau Người ta tạo giống mới bằng cách áp dụng phương pháp lai hữu tính Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, hình trứng, dài khoảng 3 mm Mỗi quả chỉ có vàihạt Hạt dứa nảy mầm yếu, cần phải xử lý thì tỉ lệ nảy mầm mới cao

Mặc dù dứa có thể trồng từ hạt nhưng tỉ lệ thấp và hiếm (Eeckenbrugge vàcộng sự, 2003)

1.1.3 Các giống trồng

Dứa trồng trên thế giới có nhiều tên gọi khác nhau như pina (Tây Ban Nha),abacasi (Bồ Đào Nha), ananas (Hà Lan, Pháp) hay nanas (nam Châu Á, đông ẤnĐộ), Po-lo-mah (Trung Quốc), sweet pine (Jamaca) và pine (Guatemala)(Morton, 1987)

Việc phân loại cho các giống trồng trọt còn nhiều hạn chế, chủ yếu chia thành

4 nhóm: “ Smooth Caynen”, “ Red Spanish’, “ Queen “ và Pernambuco (Abacaxi)(Morton, 1987; Eeckenbrugge và cộng sự, 2003)

Nhóm thứ năm là “Motilona” là nhóm quan trọng ở South America(Sanewski và c ng s , 2000) Ở Úc, nhóm chiến ưu thế nhất là Caynen tiếp theolà Queen (Bartholomew và cộng sự , 1977)

1 1.3.1 Nhóm Caynen

Nhóm Caynen được trồng phổ biến trên thế giới, năng suất cao Lá thườngdài, không gai hay một ít gai ở chóp lá, có 1 đến 2 chồi Quả hình trụ, mắt dẹp,cạn, trọng lượng từ 2 đến 2,5 kg Hương vị ngọt, hơi chua, ít xơ, nhiều nước, mềm

1.1.3.2 Nhóm Queen

Nhóm Queen được trồng phổ biến ở nước ta hiện nay, năng suất kém, chủ yếudùng ăn tươi và xuất khẩu tươi Lá hẹp, ngắn chứa nhiều gai ở mép Cây dứa ởnhóm Queen chứa nhiều chồi (4 đến 6 chồi) Quả hơi bầu dục, nhiều mắt nhỏ vàlồi, bé, trọng lượng trung bình 1kg Hương vị của Queen ngọt hơn Caynen, ít chuavà thơm

1.1.3.3 Nhóm Red Spanish

Nhóm Red Spanish năng suất kém Lá dài, hẹp, có gai và mềm Trọng lượngquả thấp từ 1,2 đến 1,5 kg, hơi tròn, mắt rộng và dẹp Khi ăn, quả có vị chua,nhiều xơ

1.1.3.4 Nhóm Abacaxi

Lá cây dứa nhóm Acabaxi chứa nhiều gai Trọng lượng quả thấp, trung bình1,5 kg Hương vị rất ngọt, mềm và nhiều nước

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng và công dụng

1.1.4.1 Giá trị dinh dưỡng

Quả dứa có 60% phần ăn được bao gồm 85% nước; 0,4 % protein; 14% đường;0,1 % chất béo và 0,5% chất xơ (Purseglove, 1972)

Dứa chứa nguồn vitamin dồi dào gồm vitamin A, B1, B6, C…và một sốkhoáng chủ yếu là Ca, Mg, K, Fe… (Morton, 1987)

Dứa còn chứa enzim bromelin được xem là có ảnh hưởng đến các đáp ứngmiễn dịch của cơ thể, cụ thể là nó làm tăng số lượng tế bào bạch cầu trong hoạtđộng của tế bào T (Hale và cộng sự, 2005; Mynott và cộng sư,ï 1999; Secor vàcộng sự, 2007) Enzim này được sử dụng chữa các triệu chứng viêm, đặc biệt làviêm khớp xương (Brien và cộng sự, 2004) và còn có hiệu quả rất cao trong việcgiúp tiêu hóa, giảm đau

Bảng 1.1 Hàm lượng chất dinh dưỡng trong cây dứa Ananas comosus Merr

Chất dinh dưỡng Hàm lượng (mg/1 cup =155.00g=7595 calo)

Ngoài việc ăn tươi và đóng hộp các phụ phẩm khác của dứa còn sử dụng để:+ Chế biến thức ăn gia súc (một tấn dứa cung cấp 30kg thức ăn khô, tinh bộttrong dứa giống tinh bột ngô về tỉ lệ amyloz/amylopectin)

+ Sợi lá dứa ở phiến lá dùng để kéo sợi dệt áo, làm giấy

+ Thân dứa dùng làm nguyên liệu chế biến bột giấy

+ Phân hữu cơ: xác bã trái dứa sau chế biến được đem ủ khoảng một năm chứa:1,27% N; 0,09% P2O5; 0,18% K2O

1.2 Sự phát triển chồi:

1.2.1 Sự phát triển:

Sự phát triển là thuật ngữ chỉ những thay đổi ở cơ thể thực vật theo thời giangồm nhiều giai đoạn nối tiếp, không đảo ngược, là những thay đổi của cơ quan,mô, tế bào, hay bào quan thực vật từ lúc khởi đầu cho tới lúc trưởng thành(Hopkins, 2004; Bùi Trang Việt, 2000)

Sự phát triển được biểu hiện qua hai chuỗi thay đổi: thay đổi về lượng và thayđổi về chất Sự thay đổi về lượng hay là sự tăng trưởng chính là sự gia tăng vềkích thước (chiều dài, chiều rộng, diện tích, thể tích) hay trọng lượng (tươi haykhô) Những thay đổi về chất hay là sự phân hóa là quá trình tạo nên những đặctính mới về hình thái nhằm giúp sinh vật có thể đảm nhận những chức năng mới(Bùi Trang Việt, 2000)

1.2.2 Mô phân sinh ngọn

1.2.2.1 Cấu trúc mô phân sinh ngọn

Mô phân sinh ngọn là nguồn tế bào cung cấp cho mọi sự phân hoá các cơquan thực vật, nằm ở đỉnh thân

Trong quá trình phát sinh phôi, mô phân sinh ngọn phát triển ở vùng giữa sơkhởi lá mầm (cây hai lá mầm) hay gốc thuẫn (cây một lá mầm) Mô phân sinhngọn kiểu mẩu có đường kính từ 100 đến 200 µm, vài trường hợp cá biệt 50 hay

90 µm, có dạng phẳng hoặc mũ nấm, hay ngón tay

Mô phân sinh ngọn biểu hiện sự phân vùng không phụ thuộc vào cấu trúc lớp.Sự phân hoá vùng của mô phân sinh không cố định, hoạt động của mỗi vùng tùyvào vị trí của chúng trong toàn thể mô phân sinh Có ba vùng :

• Vùng trung tâm (vùng đỉnh): là vùng tế bào khởi đầu ngọn bao gồm tế bào

ở lớp tunica và corpus, là những tế bào chưa biệt hoá và kích thước tương đối lớn,tế bào chất đậm đặc, không bào nhiều và to, hoạt tính phân chia thấp, chu kỳ tếbào dài Tế bào chủ yếu ở pha G1

• Vùng ngoại vi (vùng bên): tế bào vùng ngoại vi xếp chồng lên nhau, khởiphát sự biệt hoá, kích thước nhỏ, phân chia nhanh, chu kỳ tế bào ngắn, tế bàochất nhiều rRNA, là nơi tượng lá hoặc các mô của thân, có khả năng phát sinh cơquan

• Vùng lõi: nằm dưới vùng đỉnh, gồm vài dãy tế bào xếp chồng lên nhau.Các tế bào có không bào lớn, hàm lượng rRNA, hoạt tính phân chia và chu kì tếbào có những đặc tính trung gian so với vùng trung tâm và ngoại vi (Bùi TrangViệt, 2000) Đây là vùng phát sinh mô lõi (mọi mô khác có nguồn gốc từ vùngbên)

Tuy nhiên, nguồn gốc của dòng tế bào không quyết định nguồn gốc mô phânsinh mà chính vị trí của tế bào trong mô phân sinh mới là yếu tố quyết định(Fletcher, 2002) Có hai lớp:

• Tunica: lớp tunica bao gồm lớp L1 bao phủ ngoài cùng và lớp L2 nằm dưới(một lá mầm chỉ có một lớp), là những lớp tế bào phân chia thẳng góc với mặtphẳng mô phân sinh, hình thành biểu bì và các tế bào sinh dục như bao phấn vàbầu nhụy

• Corpus: lớp L3 là những tế bào nằm bên dưới tunica, có thể phân chia mọihướng, góp phần vào sự hình thành hệ thống mạch thân, lõi và các cơ quan hoa

Hình 1.3 Cấu trúc mô phân sinh ngọn

A Cấu trúc chồi ngọn của Coleus B Hai kiểu phân chia tế bào ở mô phân sinh

ngọn C Sơ đồ hóa cấu trúc phân lớp và phân vùng của mô phân sinh ngọn

1.2.2.2 Yếu tố điều khiển kích thước của mô phân sinh ngọn

Mô phân sinh ngọn phân chia tế bào trong suốt chu kì sống (ngoại trừ giaiđoạn ngủ hay bị tổn thương) nhưng vẫn đảm bảo kích thước đặc trưng cho thấytồn tại sự cân bằng giữa phân chia tế bào hình thành cơ quan mới với duy trì kíchthước kiểu mẫu ở mô phân sinh ngọn Sự cân bằng này là do sự liên lạc giữa cácvùng trong mô phân sinh

Khi tiến hành xử lí đột biến clavata (CLV1) ở Arabidopsis, mô phân sinh tăng rộng bởi các tế bào không phân hóa trong khi đột biến meristemless 1 (STM1) mô phân sinh bị mất trong suốt quá trình sinh phôi, đột biến wuschel (WUS) mô phân

sinh bị mất sau sự hình thành vài cơ quan Trên dạng hoang dại, những gen bị bấthoạt ở đột biến CLV1 mã hóa protein CLV1 làm giảm trong khi STM và WUSlàm tăng số lượng tế bào mô phân sinh Những gen này hoạt động độc lập nhưngthống nhất với nhau và với vài gen khác để duy trì kích thước và cấu trúc môphân sinh ngọn (Clark, 2001)

Người ta đã tìm hiểu sự biểu hiện của những gen này trong mô phân sinh vàcả những protein được mã hóa bởi nó CLV1 biểu hiện chủ yếu ở lớp L3 của CZvà mã hóa leucine-rich repeat (LPR) receptor kinase Gen khác, CLV3 tăng rộngkích thước mô phân sinh chủ yếu biểu hiện ở lớp L1 và L2 của CZ Protein mãhóa bởi CLV3 còn nhiều điều chưa rõ.

Người ta giả thuyết rằng CLV3 có thể hoạt động như một tín hiệu đối khángCLV1 Ảnh hưởng giữa CLV1 và CLV3 đàn áp sự biểu hiện của WUS làm giảmkích thước mô phân sinh ngọn Tuy nhiên, WUS lại đòi hỏi sự biểu hiện củaCLV3 như là một tín hiệu điều hòa ngược để duy trì kích thước của mô phân sinh.STM biểu hiện trong mô phân sinh và duy trì tế bào mô phân sinh ở một trạngthái nhất định tương tự như qui luật điều hòa biểu hiện của CLV3

Rõ ràng là mô phân sinh ngọn được điều khiển bởi một hệ thống gen ảnhhưởng qua lại với nhau nghĩa là khi một tế bào trong mô phân sinh thay đổi vị trí,nó sẽ nhận một tín hiệu mới và phát triển theo một kiểu riêng biệt

1.2.3 Sự phát triển chồi

Sự tăng trưởng diễn ra ở chồi ngọn là sự tương quan giữa hai quá trình: tự tăngtrưởng của đỉnh ngọn và sự tạo các cơ quan bên Sự tự tăng trưởng đòi hỏi phảiduy trì kích thước của mô phân sinh mặc dù luôn có quá trình phân chia tế bàomạnh diễn ra ở đó Hai quá trình này tạo ra những biến đổi hình thái trên bề mặtcủa mô phân sinh ngọn

Đầu tiên xuất hiện một dãi hẹp 1 đến 3 tế bào nở rộng ở ngoại vi gọi là sơkhởi lá, tiếp theo một phần của vùng ngoại vi sẽ có một sơ khởi khác được hìnhthành nhưng nhỏ hơn Nách sơ khởi được hình thành từ một dãi tế bào thấp nhất.Sự tăng trưởng của lớp tế bào này làm cho nách lá mở rộng dọc theo rìa của sơkhởi, tách sơ khởi ra khỏi vòm ngọn Sơ khởi tiếp tục tăng trưởng tạo thành lá Sựhình thành sơ khởi lá có thể chia thành bốn giai đoạn Đầu tiên, trụ lá được nâng

lên, bề mặt trụ mở rộng Sau đó, một số tế bào gia tăng kích thước bề mặt, mộtsố giảm kích thước lõm xuống tạo hình oval Tiếp theo, nách sơ khởi được hìnhthành tách sơ khởi ra khỏi vòm ngọn, bề mặt sơ khởi tiếp tục được tăng rộng.Cuối cùng, sơ khởi uốn cong thành vòm ngọn (Kwiatkowska và cộng sự, 2003) Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên quan đến mô phân sinh mà còn có thểxuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặcngoài biểu bì Vì vậy, chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh do sự khửphân hóa tế bào trưởng thành (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

Bảng 1.2 Nguồn gốc khác nhau của chồi bất định ở một số loài

Saintpaula ionantha

(African Violet)

Cuống lá,phiến lá

Tế bào biểu bì Naylor và

Johnson 1937

Sedum stahii

(Sedum)

Cuống lá,phiến lá

Biểu bì cuống lá và vòngngoài tế bào dưới biểu bìhay ngoại vi của mô sẹo

Yarbrough 1936

Begonia xhiemails

(Rieger Begonia)

Cuống lá Biểu bì và vòng ngoài tế

bào duới biểu bì

Mikkelson vàSink 1978

Lilium longgiflorum

(Easter Lily)

Vảy thân Biểu bì và vòng ngoài tế

bào duới biểu bì

Walker 1940

Malus sylvestrus

(Apple)

Rễ Vòng ngoài của libe thứ

cấp, cạnh libe và vỏ

Siegler vàBownan 1939

Naylor và Johnson (1937) nghiên cứu sự phát triển chồi bất định từ cuống lá

hay phiến lá Saintpaula ionantha cho thấy nguốn gốc của chồi bất định từ lớp tế

bào biểu bì và chia làm ba giai đoạn phát triển:

• Giai đoạn 1: tế bào biểu bì trải qua lần phân chia đầu tiên (A)

• Giai đoạn 2: hình thành nhóm tế bào vô tổ chức (B)

• Giai đoạn 3: xuất hiện sơ khởi chồi (C)

Hình 1.4 Các giai o n phát triển chồi ở cây Saintpaula ionantha (Naylor và

Johnson , 1957)

Ở Lilium longgiflorum chồi bất định có nguồn gốc từ lớp tế bào dưới biểu bì

và được chia làm năm giai đoạn phát triển:

• Giai đoạn 1: tế bào dưới biểu bì trải qua lần phân chia đầu tiên (A)

• Giai đoạn 2: tiếp tục phân chia hình thành sơ khởi chồi (B)

A

• Giai đoạn 3: sơ khởi lá xuất hiện cạnh sơ khởi chồi (C).

• Giai đoạn 4: tiếp tục phân chia hình thành sơ khởi lá (D)

• Giai đoạn 5: chồi kéo dài (E)

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển chồi bất định ở Lilium longgiflorum (Walker,

Ở cây dứa Ananas comosus Merr, chồi bất định có nguồn gốc từ lớp tế tào nhu mô lá Lá từ cây mẹ in vitro nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung ANA 0,5 mg/l

và BA 0,5 mg/l chuyển sang môi trường MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l,chồi được hình thành trong 15 ngày ( Mercier và cộng sự, 2003)

Ảnh 1.2 Sự phát triển chồi từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường

MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l

A Lá cắt theo chiều dọc ở ngày thứ 6, bề mặt lá cuộn lên B Ngày thứ 9 có sựphồng lên ở đáy lá, xuất hiện cụm tế bào (protuberance) C Tế bào trung tâmcủa protuberance phân chia mạnh, sự phân chia mạnh của tế bào nhu mô lá D.Chồi hình thành ở ngày 15

1.3 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Chất điều hoà sinh trưởng là hợp chất hiện diện ở một nồng độ rất thấp trongmô, nhưng đủ để gây các phản ứng chuyên biệt (Bùi Trang Việt, 2000), khôngtrực tiếp tham gia vào quá trình phát triển và biến dưỡng của thực vật nhưng cóthể can thiệp và sửa đổi các quá trình đó

1.3.1.Auxin

Idol-3-acetic acid (AIA) là hợp chất auxin tồn tại ở hầu hết các thực vật Chấtdùng phổ biến nhất có nguồn gốc tự nhiên là AIA hay chất tổng hợp như 2,4-D(2,4-diclophenoxy acetic acid), ANA (naphthalen acetic acid), AIB (indolbutyricacid)…

AIA được tổng hợp từ tryptophan hay idole, trong vùng đỉnh chồi trong sơ khởilá, trong lá non Trong mô thực vật, auxin tồn tại ở dạng tự do và liên kết với mộtacid amin Dạng tự do gây ra hoạt tính, dạng liên kết không có hoạt tính nhưng dễdàng phóng thích auxin theo con đường enzim Liên kết cũng là một trong nhữngcách điều hòa hàm lượng auxin trong tế bào (Bùi Trang Việt, 2000)

Ở mức tế bào, auxin kích thích sự hoạt động của bơm proton qua màng nguyênsinh chất, làm gia tăng nồng độ H+ ở khoảng gian bào, pH giảm Sự giảm pH làmcầu nối extensin, hemicellulose, các hợp chất peptit và cellulose bị phá vỡ, Ca2+

nối liền các chuỗi hợp chất peptit bị loại đi, một số enzime thủy giải được hoạthóa giúp cho sự tổng hợp hay phân hủy polysaccharid và protein được thực hiện,giúp duy trì sự lỏng lẻo của vách tế bào

Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp mRNA liên quan trong sự tổnghợp enzim chuyên biệt, bao gồm enzim tạo tiền chất của cellulose và các hợpchất của vách (Bùi Trang Việt, 2000)

Với khả năng kích thích kéo dài tế bào, auxin có tác động riêng biệt lên sự

hợp với các chất điều hòa tăng trưởng khác Cảm ứng tạo mô sẹo ở Ananas

comosus Merr cần môi trường MS có bổ sung ANA 1mg/l (Benega, 1995) hay

picloram 3mg/l (Sripaoraya và cộng sự, 2003) Để cảm ứng tạo rễ ở Brassia

rapai, ANA được xem là một auxin có hiệu quả, nhưng ở Lilium longiflorum

Thunb thì sự tạo rễ tốt nhất được thấy ở môi trường AIA 2mg/l (Phan Hoàng Anh

và cộng sự, 2005) Ở cây dứa Ananas comosus Merr rễ lại không hình thành

trong môi trường chứa ANA 1-2,5 mg/l mà phải là môi trường AIB 1,5-2,5 mg/l(Akbar và cộng sự, 2003) hay cần sự kết hợp giữa AIB và ANA hay AIA ở các

nồng độ khác nhau như AIA 1,14 µM và AIB 2,46 µM ở Zizyphus jujuba Mill.

(Gu và cộng sự, 2005) Có thể nói, tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bàocòn phụ thuộc vào loài, nồng độ và sự hiện diện của các chất điều hòa tăngtrưởng khác

Tuy nhiên, hiệu ứng của auxin giảm sau một nồng độ tối hảo và trở nên độc ởnồng độ qua cao (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin được sinh ra từ phần non của cơ thể thực vật, chủ yếu ở chồi ngọn Sau

khi cắt bỏ chồi ngọn, có sự giảm ngay nồng độ AIA sau 4h ở cây dứa Ananas

comosus Merr và sự phân chia tế bào ở lá mầm của nách (Beatriz và cộng sự,

2003) hay sau 8h ở Betula pendula (Galoch và cộng sự, 1998) nguyên nhân là do

sự di chuyển hữu cực của auxin chịu trách nhiệm duy trì ưu thế ngọn Chatfield

(2000) nghiên cứu trên khúc cắt cô lập của Arabidopsis, chứng minh rằng khi tác

động lên ngọn làm ức chế vận chuyển auxin, đã góp phần đẩy mạnh sự phát triểncủa chồi bên Sau 16h nuôi cấy nồng độ AIA lại tăng lên chứng minh cho sựthành lập một lượng auxin mới duy trì ưu thế ngọn của chồi mới Bên cạnh đó,vẫn có mối liên quan với cytokinin và còn nhiều vẫn đề mà đến nay vẫn chưađược hiểu rõ hoàn toàn

Sự tập trung auxin nồng độ cao ở ngọn và sự di chuyển hữu cực của auxincũng sẽ dẫn đến sự hình thành cơ quan hoa theo trục dọc Có thể nói, sự dichuyển hữu cực của auxin có vai trò quan trọng không chỉ trong giai đoạn dinhdưỡng để tạo chồi (nhánh và lá) mà còn trong sự ra hoa ở dâu tây và ở dứa (Houvà cộng sư,ï 2005 trong Tr n Th Anh Thoa, 2007).

1.3.2 Cytokinin

Kinetin là chất đầu tiên được khám phá bởi Skoog và Miller vào 1955 Đến

1963, Letham ly trích được cytokinin từ phôi nhũ bắp non có trong phần lớn thựcvật và một vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn 10lần, đó là zeatin Trong nuôi cấy mô, người ta thường dùng zeatin và một số hợpchất tổng hợp như kinetin và BAP (benzilaminopurin hay benzil adenin) Nướcdừa (phần lỏng) cũng được chứng minh là nguồn cung cấp zeatin (Bùi Trang Việt,2000)

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu cytokinin tự do cho cả cơ thểthực vật Từ rễ, cytokinin được di chuyển trong mạch mộc để tới chồi Tuy nhiên,các chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000).Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và tự do, chúng bị phân hủy bằngcon đường enzime, tạo sản phẩm cuối cùng là urê

Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào và làm hạn chếsự hóa già của tế bào Ngoài ra, các chất này còn có tác dụng lên quá trình traođổi chất, tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của một sốenzim Cơ chế tác dụng của cytokinin ở mức phân tử thể hiện ở tác động tươnghổ của cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạođiều kiện tổng hợp DNA

Cytokinin mặc dù được khám phá đầu tiên bởi khả năng kích thích phân chia tế

hoocmon khác để điều hoà các đáp ứng khác nhau ở thực vật bao gồm sự nảymầm, sự tạo chồi, làm mất ưu tính ngọn, tăng rộng lá, sinh sản và lão suy Trongthân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (tăngtrưởng củ) cũng như kích thích sự gia tăng tế bào lá trưởng thành (Bùi Trang Việt,2000).

Lakshmanan và cộng sự (1997) phân tích khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ

mẫu lá ở Garcinia mangostana cho thấy rằng xứ lý BA là cần thiết ở giai đoạn

đầu tiên cho tế bào đi vào con đường phát sinh hình thái BA ngoại sinh hoạtđộng trực tiếp lên tế bào thực vật, điều khiển sự tích lũy các hợp chất cytokininkhác Hiệu quả của BA ngoại sinh trong sự tích lũy iP hay iPR được miêu tả trong

mẫu cấy lá Petunia hydrida trong quá trình phát sinh chồi (Auer và cộng sự,

1999)

Để tăng hệ số nhân giống người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môitrường nuôi cấy trong giai đoạn tạo chồi nhưng các loài thực vật chứa cytokininnồng độ cao sẽ ức chế sự tạo rễ

1.3.3 Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin

Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có vai trò rất quan trọng trong quá trìnhhình thành mô sẹo, phát sinh cơ quan chồi, rễ Sự cân bằng giữa auxin vàcytokinin là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển Nồng độ thích hợpphụ thuộc vào từng loài cây và từng giai đoạn phát triển

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan, đặc biệt làphân hoá chồi Tỷ lệ auxin (phân hoá rễ) và cytokinin (phân hoá chồi) có ý nghĩa

quyết định trong sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy in vitro cũng như ở cây

nguyên (Skoog và Miller, 1957) Nếu nồng độ auxin cao hơn cytokinin sẽ kíchthích tạo rễ còn ngược lại kích thích tạo chồi và khi tỉ lệ ở mức cân bằng thì thuậnlợi cho phát triển mô sẹo

Tái sinh chồi in vitro từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường tạo

chồi ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l, tỉ lệ auxin/cytokinin thấp nhất vào ngày thứ ba,chủ yếu là do sự tăng mạnh iP Có thể là do hàm lượng iP nội sinh gây ra tín hiệucho sự phát sinh cơ quan chồi ở đáy lá dứa Sự gia tăng iP đòi hỏi sự hiện hiện

của ANA và BA trong môi trường (Mercier và cộng sự, 2003) Ở Zizyphus jujuba

Mill., sự tạo chồi bất định từ lá cũng cần sự hiện diện của TDZ 4,45 µM và AIA2,85 µM ở giai đoạn tái sinh chồi và sau đó cấy chuyền sang môi trường BA0,89µM và GA3 577 µM hay ở Neoregelia cruenta cũng cho kết quả tương tự

(Carneiro và cộng sự, 2005)

Quá trình phát triển rễ, cytokinin cũng có thể phối hợp với auxin dể đạt hiệuquả hơn (Koukourikou-petridou, 1998)

Vai trò của auxin và cytokinin cũng được tìm thấy trong quá trình hình thành

chồi từ mô sẹo Ở Ananas comosus Merr, số lượng chồi cao nhất từ mô sẹo thu

được trong môi trường MS bổ sung kinetin 1,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l Sự kết hợpgiữa BA và ANA không có hiệu quả trong sự tạo chồi như là sự kết hợp giữaANA và kinetin Phần trăm mô sẹo hình thành chồi và số lượng chồi sinh ra từmô sẹo thay đổi theo sự chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy.Môi trường MS chỉ chứa kinetin làm chồi phân hóa, hiệu quả hơn BA nhưng thấphơn khi so sánh với ANA bổ sung vào môi trường (Akbar và cộng sự, 2003) Tương tự nhu cầu auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy sinh chồi với

tỷ lệ cao nhất cũng được phát hiện ở Carcica papaya (Modal và cộng sự, 1994),

Hybanthus ennea-spermus (Prakash, 1999), Salvia selerea (Liu, 2000), Bixa orellana (Sha Vallikhan và cộng sự, 2002), Capsicum annuum L (Dabauza,

2004)

1.3.4 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác:

Giberelin được tổng hợp từ acid mevanoid ở phôi đang sinh trưởng, lá non,rễ non, quả non… GA là một nhóm lớn, trên một trăm chất có cấu trúc hoá học

cơ bản giống nhau và được gọi là giberelin, kí hiệu GAx (x: số thứ tự theo khámphá) GA3 là giberelin được sử dụng nhiều nhất trong các loại giberelin được pháthiện, nó có tác dụng kích thích sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ thấp

Trong cây, giberelin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó dichuyển không phân cực, hướng ngọn hay hướng gốc tuỳ nơi sử dụng, vận chuyểntrong hệ thống mạch Giberelin có vai trò chủ yếu trong kích thích sự kéo dàilóng vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000).Trong phần lớn các trường hợp, giberelin có hoạt tính bổ sung cho auxin, nhưnghai hormon này hoạt động độc lập nhau

Acid abscisic được tổng hợp hầu hết các bộ phận của cây như rễ, lá, hoa, quả,hạt, củ Nó tích luỹ nhiều trong cơ quan già, cơ quan đang ngủ, sắp rụng Acidabscisic vận chuyển phân cực trong cây theo mạch mộc và libe làm cản sự nảymầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm kéo dài lóng, cản tăng trưởngcủa diệp tiêu và mô nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000)

1.4 Ảnh hưởng của nitrogen trong quá trình phát triển chồi:

Nitrogen là thành phần bắt buộc của protid chất đặc trưng cho sự sống Nó cótrong thành phần enzim, màng tế bào, trong diệp lục tố mang chức năng cấu trúc.Nitrogen còn là thành phần của nhiều vitamin B1, B6, B12, PP… đóng vai trò lànhóm hoạt động của nhiều hệ enzim oxi hóa khử trong đó có sự hình thành củaadenin Các hợp chất nitơ cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ATP,ADP (Võ Thị Bạch Mai, 2003)

Nitrogen tồn tại ở hai dạng: khí nitơ tự do trong khí quyển và dạng hợp chấthữu cơ, vô cơ khác nhau Nitrogen là dạng duy nhất mà cây có thể hấp thu cả hai

dạng cation và anion NH4+ và NO3- Môi trường nuôi cấy thường được bổ sungmột lượng lớn NO3- và một lượng nhỏ NH4+.

Người ta có thể dựa vào màu sắc lá, chiều cao cây, số lượng chồi, trọng lượngkhô của chồi và rễ để xác định trạng thái dinh dưỡng của cây Ở lúa, cây thiếunitrogen biểu hiện lá ngắn, hẹp, màu xanh nhạt, vàng rụi sớm, yếu rạ, còi cọc.Cây dư nitrogen thì lá dài, rộng nhưng mỏng, xanh đậm (Tsunoda, 1964 trongNguyễn Ngọc Đệ, 2009)

Thí nghiệm trên cây cà chua, thay đổi hàm lượng nitrogen tổng số ở cácnghiệm thức 0N, 1/3N, N cho thấy những biểu hiện khác nhau Sự thiếu hụtnitrogen làm giảm sự tăng trưởng lá từ ngày thứ 4 và giảm tỉ lệ tăng trưởng chồitừ ngày thứ 6 ở nghiệm thức 0N, từ ngày thứ 6 và ngày thứ 12 ở nghiệm thức 1/3

N Ngoài ra, sự thiếu nitrogen còn làm thay đổi màu sắc, giảm hàm lượngchlorophyll, tăng trưởng phenol ở lá (Quijada, 2002) Có thể nói, nitrogen là yếutố quyết định sự tăng trưởng ở thực vật (Cazetta và cộng sự, 1999)

Tuy nhiên, sự tăng hàm lượng nitrogen không phải lúc nào cũng dẫn đến sự

tăng trưởng mạnh của chồi và rễ Ở Triticum aestivam L., hàm lượng nitrogen ở

lá tăng nhanh khi nồng độ nitrogen trong môi trường tăng nhưng khi nồng độnitrogen trong môi trường vượt quá 3,75 nmol/l thì hàm lượng nitrogen ở lá bắtđầu tăng chậm lại Tương tự, trọng lượng khô của chồi tăng khi nồng độ nitrgentrong môi trường tăng đến 11,25 nmol/l sau đó bắt đầu giảm (Shangguan, 2003).Tóm lại, trọng lượng khô của chồi tăng khi hàm lượng nitrogen tăng nhưng bắtđầu giảm khi đến một giới hạn nhất định Hàm lượng nitrogen tối ưu cho sự tăngtrưởng chồi thay đổi tùy theo giống Sự tăng trưởng của rễ thì ngược lại

Bên cạnh đó, tỷ lệ NH4+ và NO3- cũng có vai trò quan trọng Ở Dioscorea

deltoidea Wall, sự phát sinh chồi và rễ từ mô sẹo chỉ thấy trong môi trường có