1.3.1 .Auxin
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.3.1. Xử lý riêng rẽ
- AIA ở các nồng độ khác nhau: 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1 mg/l. - ANA ở các nồng độ khác nhau: 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1 mg/l. - BA ở các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 5; 10 mg/l.
- GA3ở các nồng độ khác nhau:1; 10; 20 mg/l và xử lý GA3 bằng cách ngâm trong dung dịch GA3 10; 20; 50; 100 mg/l trong 1h. 2.2.3.2. Xử lý phối hợp - BA và ANA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l + ANA 0,1 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 0,5 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 1 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 10 mg/l; BA 1 mg/l + ANA 0,5 mg/l; BA 1mg/l + ANA 1 mg/l; BA 10 mg/l + ANA 0,5 mg/l. - BA và AIA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l + AIA 0,1 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 0,5 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 1 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 10 mg/l; BA 1 mg/l + AIA 0,5 mg/l; BA 1mg/l + AIA 1 mg/l;
BA 10 mg/l + AIA 0,5 mg/l;
- BA, ANA và GA3 ở các nồng độ khác nhau: BA 1 mg/l; ANA 0,5 mg/l và GA3
1; 10; 20 mg/l.
- BA, AIA và GA3 ở các nồng độ khác nhau: BA 1 mg/l, AIA 0,1 mg/l và GA3 1; 10; 20 mg/l.
Tất cả thí nghiệm trên sau 10 ngày thu nhận mẫu cấy và tiến hành đo kích thước chiều ngang và chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn bằng trắc vi thị kính.
- BA, ANA hay AIA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l, ANA 0,5 mg/l;
BA 1 mg/l, ANA 0,5 mg/l; BA 1 mg/l, AIA 0,1 mg/l.
Kết quả kích thước chiều ngang và chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn được đo sau 10 ngày, 20 ngày bằng trắc vi thị kính.
2.2.3.3.Xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian
Hình 2.4. Sơ đồ xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian
Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian với kích thước 0,3 đến 0,5 cm của
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr được cấy vào môi trường MS có bổ sung
BA, AIA, GA3 phối hợp như trên. Sau 5 tuần, đếm số lá non màu xanh hình thành.
Thời gian (tuần)
BA 1mg/l + AIA 0,1mg/l 1 BA 1mg/l + AIA 0,1mg/l + GA3 10 mg/l 2 BA 1mg/l AIA 0,1 mg/l BA 1mg/l + IAA 0,1mg/l + GA3 10 mg/l 3 GA3 10 mg/l BA 1mgl/ + AIA 0,1 mg/l 0 4 BA 1mg/l AIA 0,1mg/l GA3 10 mg/l 1 5 5 0 0 0 0 1 1 1 1 5 5 5 5
2.2.4. Tạo cụm chồi
Khúc cắt thân 1 cm có nguồn gốc từ cây in vitro 6 tuần tuổi trên môi trường
MS có bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy vào môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l và BA thay đổi từ 1 đến 4 mg/l. Sau hai tuần, đếm số sơ khởi chồi hình thành.
2.2.5. Vai trò của nitrogen
• Thay đổi hàm lượng nitrogen tổng cộng
- Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian của chồi trên trái dứa Ananas
comosus Merr được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1
mg/l với hàm lượng N thay đổi lần lượt : không có N ( -N), ¼ N, ½ N, N và 2N. Sau 10 ngày thu nhận mẫu cấy và tiến hành đo kích thước chiều ngang và chiều cao vùng mô phân sinh ngọn bằng trắc vi thị kính.
- Chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi lần lượt : không có N (-N), ¼ N, ½ N, N và 2N.
Sau 5 tuần, đếm số lượng chồi, số lá và đo chiều cao cây, kích thước lá dài nhất.
• Thay đổi tỉ lệ NH4/ NO3
Chồi 4 tuần tuổi trong môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy chuyền sang môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với tỉ lệ NH4/ NO3 thay đổi lần lượt: loại NH4NO3, loại KNO3, loại NH4NO3, KNO3 và thay thế bằng NH4Cl.
Sau 5 tuần, đếm số lượng chồi, số lá và đo chiều cao cây, kích thước lá dài nhất.
2.2.6. Tạo rễ
Cây con in vitro 6 tuần tuổi kích thước 1 đến 1,5 cm có nguồn gốc từ cụm chồi
trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1mg/l được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng với nồng độ khác nhau: ANA 0,5 mg/l; ANA 1 mg/l; AIA 1mg/l; AIA 2 mg/l; AIA 2,5 mg/l. Sau một tuần, đếm số sơ khởi rễ hình thành.
Tất cả các ống nghiệm, erlen chứa mẫu cấy đều được đặt trong phòng nuôi có cường độ ánh sáng 2500 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ ngày, nhiệt độ 22 ± 2oC tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh Lí Thực Vật.
2.2.7. Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm
Cây con 16 tuần tuổi kích khước 2 đến 2,5 cm được trồng trong các chậu nhỏ với giá thể gồm đất : xơ dừa với tỉ lệ 2: 1. Các cây con được đặt trong điểu kiện ánh sáng 35000 ± 500 lux, nhiệt độ 32 ± 2oC, ẩm độ 61 ± 5%. Sau 20 ngày, tiến hành đo chiều cao cây, chiều dài rễ, và đếm số lá, số rễ.
2.2.8. Phân tích thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lí thống kê chương trình SPSS phiên bản 11.5 (Statistical Program Scientific System) dùng cho Window.
Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% của giá trị được thể hiện bởi các chữ cái kèm theo, so sánh được thực hiện trong cùng một cột.
3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Quan sát hình thái giải phẫu
Vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc
từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr có hình thái tương tự như vùng mô
phân sinh ngọn điển hình. Vùng mô phân sinh với sự hiện diện của vùng đỉnh gồm những tế bào có kích thước nhỏ, bắt màu đậm được bao bọc bởi các vảy lá. So với hai vị trí non và già, vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có các vảy lá tăng trưởng nhiều hơn.
3.1.2. Thí nghiệm sơ khởi
3.1.2.1. Kích thước vùng mô phân ngọn ở ba vị trí non, trung gian và già
Vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa cho kết quả chiều ngang và chiều cao tốt nhất so với hai vị trí non, già. Vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở vị trí già chiều ngang không khác biệt so với vị trí trung gian nhưng chiều cao lại không khác biệt so với vị trí non. B ng 3.1. Kích thước vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian
và già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Kích thước vùng mô phân sinh ngọn V trí
Chiều ngang (µm) Chiều cao (µm) Vị trí non 137,6 ± 1,2a 58,5 ± 0,8ab
Vị trí trung gian 149,4 ± 2,7b 61,3 ± 1,8b
Vị trí già 147,0 ± 1,0b 56,4 ± 0,7a
Ảnh 3.1. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí non có nguồn gốc từ chồi
trên trái dứa Ananas comosus Merr
Ảnh 3.2. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
45µm
Ảnh 3.3. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí già có nguồn gốc từ
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
3.1.2.2. Sự tăng trưởng của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái theovị trí mẫu cấy vị trí mẫu cấy
Mẫu cấy từ sơ khởi chồi với kích thước trung bình 0,3 đến 0,5 cm ở ba vị trí tương ứng non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa được cấy vào môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l. Trên môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l ở vị trí trung gian và già chiều cao sơ khởi chồi đều tăng dần theo thời gian. Ở ngày 14, ngày 30, chiều cao sơ khởi chồi ở vị trí trung gian cho kết quả cao nhất.
Bảng 3.2. Chiều cao của sơ khởi chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở 3 vị trí non, trung gian, già trên môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l theo thời gian
Chiều cao chồi (mm) Vị trí mẫu cấy Thời gian
( ngày)
Non Trung gian Già Môi trường MS
0 2,2 ± 0,23a1 1,93± 0,18a1 1,93±0,22a1
14 2,31 ± 0,22a1 2,33± 0,88a1 2,03±0,27a1
30 2,6 ± 0,58a1 3,2±0,58b2 2,73±0,12b1
Môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l
0 2,2±0,23a1 1,93± 0,18a1 1,93±0,22a1
14 2,2±0,15a12 2,37± 0,33a2 1,97±0,67a1
30 2,67± 0,18a1 3,4±0,26b2 2,7±0,33b1
Các mẫu tự từ a-> z được tính theo cột dọc, các chữ số từ 1….được tính theo hàng ngang, khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0.05
3.1.2.3. Hàm lượng đường tổng số và tinh bột
* Hàm lượng đường tổng số: hàm lượng đường trong khúc cắt sơ khởi chồi ở
ba vị trí non, trung gian, già tăng dần. Hàm lượng đường cao nhất ở vị trí già, thấp nhất ở vị trí non. Hàm lượng đường tổng số ở vị trí trung gian và già không có sự khác biệt.
Bảng 3.3. Hàm lượng đường tổng số của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non,
trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Vị trí sơ khởi chồi Hàm lượng đường tổng số (mg/l) Non 1077,0 ± 5,8a
Trung gian 1093,5 ± 13,7ab
Già 1110,8 ± 1,9b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
*Hàm lượng tinh bột: tương tự hàm lượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột
của khúc cắt sơ khởi chồi cao nhất ở vị trí già, thấp nhất ở vị trí non. Hàm lượng tinh bột ở vị trí trung gian và già không có sự khác biệt.
Bảng 3.4. Hàm lượng tinh bột của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian,
già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Vị trí sơ khởi chồi Hàm lượng tinh bột (mg/l) Non 4849,6 ± 11,6a
Trung gian 4889,4 ± 4,18ab
Già 4920,8 ± 17,8b
3.1.2.4. Cường độ hô hấp
Cường độ hô hấp của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có
nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr mạnh nhất ở vị trí non và
không khác biệt so với vị trí trung gian.
Bảng 3.5. Cường độ hô hấp của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian,
già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Vị trí chồi ngọn Cường độ hô hấp (µmol/g/h) Non 0,18 ± 0,01b
Trung gian 0,12 ± 0,03b
Già 0,07 ± 0,01a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
3.1.2.5. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật
Hàm lượng các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa có sự khác biệt.
Hàm lượng AIA cao nhất ở vị trí già, thấp ở vị trí non và trung gian. Zeatin cao nhất ở vị trí non, không khác biệt so với vị trí trung gian và thấp nhất ở vị trí già. GA3 tăng cao nhất ở vị trí trung gian và thấp ở vị trí già. ABA ở cả ba vị trí non, trung gian, già không có sự khác biệt.
Bảng 3.6. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già
Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật (mg/l) Vị trí
AIA Zeatin GA3 AAB Non 0,42 ± 0,05a 0,42 ± 0,04b 1,16 ± 0,09ab 1,0 ± 0,29a
Trung gian 0,54 ± 0,07a 0,36 ± 0,03b 1,5 ± 0,14b 1,5 ± 0,29a
Già 0,92 ± 0,05b 0,08 ± 0,01a 0,82 ± 0,05a 0,67 ± 0,17a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
0 0.5 1 1.5 2
Non Trung gian Già
trí s kh i ch i Ho t tín h cá c ch t u h o à n g tr n g th c v t (m g /l ) AIA Zeatin GA3 AAB
Hình 3.1. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già
3.1.3. Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật 3.1.3.1. Xử lý riêng rẽ
• AIA
Mẫu cấy sơ khởi chồi ở vị trí trung gian được cấy trên môi trường MS có bổ sung AIA ở các nồng độ khác nhau. Trên môi trường MS có bổ sung AIA 0,1mg/l, kích thước vùng mô phân sinh ngọn (chiều ngang, chiều cao) tăng trưởng mạnh nhất.
Bảng 3.7. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA ở các nồng độ khác nhau
Kích thước vùng mô phân sinh ngọn Môi trường
Chiều ngang (µm) Chiều cao (µm) Mẫu cấy ban đầu 149,1 ± 5,9a 74,6 ± 2,8a
Nồng độ AIA (mg/l) Sau 10 ngày nuôi cấy 0 170,7 ± 8,6ab 76,6 ± 5,4a 0,001 182,5 ± 14,3ab 66,6 ± 7,6a 0,01 168,4 ± 9,1ab 75,4 ± 9,7a 0,1 191.2 ± 7,8c 80,7 ± 4,6b 0,5 187,7 ± 3,5b 66,7 ± 6,3a 1,0 191,2 ± 4,6b 78,9 ± 9,1a
• ANA
Mẫu cấy sơ khởi chồi ở vị trí trung gian được cấy vào môi trường MS có bổ sung ANA ở các nồng độ khác nhau. Ở môi trường MS có bổ sung ANA 0,01 mg/l, vùng mô phân sinh ngọn tăng trưởng chiều ngang và chiều cao cao nhất nhưng vẫn không khác biệt có ý nghĩa với môi trường đối chứng MS.
Bảng 3.8. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung ANA ở các nồng độ khác nhau
Kích thước mô phân sinh ngọn Môi trường
Chiều ngang (µm) Chiều cao (µm) Mẫu cấy ban đầu 135,1± 6,3b 54,4 ± 6,3a
Nồng độ ANA (mg/l) Sau 10 ngày nuôi cấy
0 173,7 ± 8,6c 78,1 ± 4,9b 0,001 166,7 ± 14,3c 62,9 ± 8,1ab 0,01 138,6 ± 4,6b 61,4 ± 4,6ab 0,1 170,1 ± 7,6c 56,9 ± 6,2b 0,5 122,8 ± 9,3ab 59,3 ± 1,9ab 1,0 110,3 ± 5,4a 61,3 ± 3,4a
• BA
Mẫu cấy sơ khởi chồi ở vị trí trung gian được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau. Ở môi trường BA 0,5 mg/l và BA 1 mg/l vùng mô phân sinh ngọn tăng trưởng cao nhất khác biệt có ý nghĩa với đối chứng. Bảng 3.9. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau
Kích thước vùng mô phân sinh ngọn Môi trường
Chiều ngang (µm) Chiều cao (µm) Mẫu cấy ban đầu 142,0 ± 5,4ab 59,8 ± 2,6ab
Nồng độ BA (mg/l) Sau 10 ngày nuôi cấy 0 163,5 ± 18,7b 72,0 ± 4,6bc 0,1 164,7 ± 7,3bc 63,4 ± 3,3ab 0,5 186,2 ± 0,8c 78,6 ± 2,8c 1,0 181,8 ± 1,7c 80,1 ± 7,6c