1.3.1 .Auxin
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.2. Thí nghiệm sơ khởi
• Đo kích thước vùng mô phân sinh ngọn ở ba vị trí non, trung gian, già
Vùng mô phân sinh ngọn từ sơ khởi chồi ở ba bị trí tương ứng: non, trung gian,
già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr (Hình 2.1) được đo kích thước
theo chiều ngang và chiều cao bằng trắc vi thị kính. Chiều ngang của vùng mô phân sinh ngọn dưới trắc vi thị kính được tính từ khoảng cách giữa nách sơ khởi lá xuất hiện muộn nhất L1 đến nách sơ khởi lá xuất hiện ngay trước đó L2. Chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn được tính bằng khoảng cách giữa vị trí cao nhất của vùng trung tâm CZ (central zone) đến vị trí nách của sơ khởi lá L2 (Hình 2.2).
Hình 2.1. Sơ đồ chỉ ba vị trí non, trung gian, già của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr. 1: vị trí non, 2: vị trí trung gian (được
dùng trong các thí nghiệm xác định vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và nitrogen trong sự phát triển chồi), 3 : vị trí già
Hình 2.2. Chiều ngang và chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn
• Sự tăng trưởng của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái theo vị trí mẫu cấy
Sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr được
tách bỏ hết lá, rửa sạch bằng xà phòng và nước cất 3 lần, sau đó được khử trùng bằng dung dịch javel 100% trong 5 phút. Mẫu được cắt thành từng miếng nhỏ kích thước trung bình 0,3 đến 0,5 cm ở ba vị trí non, trung gian, già (Hình 2.1) và cấy vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l, vitamin MS, sacaroz 30g/l đường bổ sung 6,5 g/l agar, pH = 5,7.
1 2
3 Khúc cắt chồi trên trái
ở vị trí trung gian Khúc cắt sơ
khởi chồi Chiều ngang Ch iều cao L1 L2 CZ
So sánh khả năng tái sinh chồi bằng cách đo chiều cao của chồi theo thời gian 0 ngày, 14 ngày, 30 ngày bằng trắc vi thị kính.
• Đo hàm lượng tinh bột và đường
Hàm lượng tinh bột và đường được ly trích và đo theo phương pháp AOAC (Coombs và cộng sự ,1987 trong Lê Thị Trung, 2003).
- Xác định đường chuẩn: dung dịch đường sacrose và glucose được pha theo các nồng độ 10, 20, 0, 40, 50, 60, 70, 80 mg/l. Nhuộm dung dịch đường bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường: phenol: H2SO4 đậm đặc là:1: 1: 5. Lắc đều, để yên 15 phút. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490nm. Thu các giá trị đo được và vẽ đồ thị đường chuẩn của sacrose và glucose theo các nồng độ khác nhau.
- Đo hàm lượng đường: cân một gam trong lượng tươi sơ khởi chồi từ chồi trên trái dứa ở ba vị trí non, trung gian, già sau đó nghiền với 10 ml cồn 96o, đun sôi cách thủy lọc lấy phần dịch. Phần bã ly trích với cồn 80o (hai lần lặp lại). Phần dịch thu được làm bay hơi bằng cách đun cách thủy cho cô cạn dung dịch, pha loãng với nước theo một thể tích nhất định, thu được dịch trích đường.
Dịch trích đường cho phản ứng với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol: H2SO4 đậm đặc là: 1: 1: 5. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490nm.
Hàm lượng đường tổng số được tính bằng cách so sánh với đồ thị đường chuẩn sucrose.
- Đo hàm lượng tinh bột: phần bã chứa tinh bột sất khô ở 80oC, thêm vào 2ml nước cất và tinh bột được thủy giải bằng 2ml acid peloric (HClO4) 9,2N. Đun cách thủy 15 phút, cho nước cất vào đủ 10 ml. Ly trích lấy phần dịch, phần bã được ly trích lại với HClO4 4,6N như trên (lặp lại 2 lần). Tiến hành thu dung dịch thủy giải tinh bột.
Dung dịch thủy giải tinh bột cho phản ứng với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol: H2SO4 đậm đặc là: 1: 1: 5. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm.
Hàm lượng đường tổng số được tính bằng cách so sánh với đồ thị đường chuẩn glucose. Hàm lượng tinh bột được tính theo hàm lượng đường thủy giải nhân với hệ số 0,9.
• Đo cường độ hô hấp
Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái
dứa Ananas comosus Merr được dùng để đo cường độ hô hấp bằng máy
Hansatech ở 25oC, trong tối. Kết quả đo cường độ hô hấp thể hiện ở hàm lượng O2 hấp thu, được tính bằng µmol/g/h.
• Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Auxin, cytokinin và giberelin được ly trích phân đoạn trên bản mỏng sắc kí silicagel và đo hoạt tính nhờ các sinh trắc nghiệm.
Ly trích chất điều hòa tăng trưởng thực vật: cân 1g khúc cắt sơ khởi chồi ở ba
vị trí non, trung gian, già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr dùng để ly
trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Dùng methanol 80% để ngâm mẫu vật sau khi nghiền, dùng eter để ly trích các chất có hoạt tính auxin, giberelin, acid abscisic, dùng butanol để ly trích các chất có hoạt tính cytokinin. Tiến hành ly trích theo hình 2.3. Các dịch chứa chất trích được chấm trên bản sắc ký lớp mỏng bằng nhôm tráng silicagel 60 F254 mã số 1.05554 (Merck). Dung môi di chuyển gồm chloroform, methanol, acid acetic (tỉ lệ 80:15:5 theo thể tích).
Xác định vị trí các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên bản sắc ký lớp mỏng. Vị trí auxin, acid abscisic và cytokinin trên bản sắc ký có thể được phát hiện trực tiếp dưới tia UV 254 nm so với chuẩn là acid indol acetic (AIA), acid
ethanol (tỷ lệ 5:95 theo thể tích), sấy ở 1100C trong 10 phút và quan sát dưới tia UV 254 nm so với chuẩn là acid giberelic GA3. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được đo ở các vị trí tương ứng với vị trí của chất chuẩn.
Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm. Hoạt tính của auxin và acid abscisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp
tiêu của cây mầm lúa (Oryza sativa L.) (được gieo trong tối, sau 72 ± 5 giờ, khi
bao diệp tiêu chưa bị xé). Diệp tiêu lúa được cắt thành các đoạn 2 mm, 10 khúc cắt được ngâm vào đĩa petri có chứa các dịch trích, ở 27± 20C, trong tối. Sau 24 giờ, đo sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu. Hoạt tính của auxin được so với hoạt tính của AIA tinh khiết 1 mg/l; hoạt tính của AAB được so với hoạt tính của AAB tinh khiết 1 mg/l.
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo, 5 tử diệp dưa leo từ hột nảy mầm được cân và đặt trên giấy thấm có chứa dịch trích n- butannol và 10ml nước cất ở 27 ± 20C, ánh sáng 2000 lux, độ ẩm 80%. Sau 48 giờ, các tử diệp được cân và tính sai biệt trọng lượng. Hoạt tính của cytokinin được so với BA 1 mg/l. Hoạt tính của zeatin được so với hoạt tính của zeatin tinh khiết 1 mg/l.
Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp xà lách có rễ mầm vừa chui khỏi vỏ được đặt trong các cốc thủy tinh có ngâm các băng silicagel chứa giberelin, ở 27 ± 20C, ánh sáng 2000 lux, độ ẩm 80%. Sau 48 giờ, đo sự sai biệt các trụ hạ diệp. Hoạt tính của giberelin được so với hoạt tính của GA3 tinh khiết 10 mg/l.
Nghi n 1g m u + 20ml Metanol 80% (Ngâm 24 gi ) Cơ c n d ch l c cịn 1ml Bình lĩng, thêm 15ml Eter, l c 20 phút c, l c dung d ch Thêm 5ml n c c t, ch nh pH~ 2,5 (HCl 10 %) + 3ml NaHCO3 8% (3 l n) ch Eter Qu t c n ch Eter (l p trên) c ký Sinh tr c nghi m auxin, AAB và GA Ch nh pH~ 7, Thêm 10ml n- Butanol bão hịa n c,
c 15 phút ( 3 l n) ch n c (l p d i) Sinh tr c nghi m cytokinin ch butanol + 3ml NaHCO3 8% (3 l n) ch butanol Qu t c n Hình 2.3. ly trích các ch t u hịa t ng tr ng th c v t
2.2.3. Xử lý các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian với kích thước 0,3 đến 0,5 cm của chồi
trên trái dứa Ananas comosus Merr được cấy vào các môi trường MS có bổ sung
các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở các nồng độ khác nhau.
2.2.3.1. Xử lý riêng rẽ
- AIA ở các nồng độ khác nhau: 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1 mg/l. - ANA ở các nồng độ khác nhau: 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1 mg/l. - BA ở các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 5; 10 mg/l.
- GA3ở các nồng độ khác nhau:1; 10; 20 mg/l và xử lý GA3 bằng cách ngâm trong dung dịch GA3 10; 20; 50; 100 mg/l trong 1h. 2.2.3.2. Xử lý phối hợp - BA và ANA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l + ANA 0,1 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 0,5 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 1 mg/l; BA 0,5 mg/l + ANA 10 mg/l; BA 1 mg/l + ANA 0,5 mg/l; BA 1mg/l + ANA 1 mg/l; BA 10 mg/l + ANA 0,5 mg/l. - BA và AIA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l + AIA 0,1 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 0,5 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 1 mg/l; BA 0,5 mg/l + AIA 10 mg/l; BA 1 mg/l + AIA 0,5 mg/l; BA 1mg/l + AIA 1 mg/l;
BA 10 mg/l + AIA 0,5 mg/l;
- BA, ANA và GA3 ở các nồng độ khác nhau: BA 1 mg/l; ANA 0,5 mg/l và GA3
1; 10; 20 mg/l.
- BA, AIA và GA3 ở các nồng độ khác nhau: BA 1 mg/l, AIA 0,1 mg/l và GA3 1; 10; 20 mg/l.
Tất cả thí nghiệm trên sau 10 ngày thu nhận mẫu cấy và tiến hành đo kích thước chiều ngang và chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn bằng trắc vi thị kính.
- BA, ANA hay AIA ở các nồng độ khác nhau: BA 0,5 mg/l, ANA 0,5 mg/l;
BA 1 mg/l, ANA 0,5 mg/l; BA 1 mg/l, AIA 0,1 mg/l.
Kết quả kích thước chiều ngang và chiều cao của vùng mô phân sinh ngọn được đo sau 10 ngày, 20 ngày bằng trắc vi thị kính.
2.2.3.3.Xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian
Hình 2.4. Sơ đồ xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian
Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian với kích thước 0,3 đến 0,5 cm của
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr được cấy vào môi trường MS có bổ sung
BA, AIA, GA3 phối hợp như trên. Sau 5 tuần, đếm số lá non màu xanh hình thành.
Thời gian (tuần)
BA 1mg/l + AIA 0,1mg/l 1 BA 1mg/l + AIA 0,1mg/l + GA3 10 mg/l 2 BA 1mg/l AIA 0,1 mg/l BA 1mg/l + IAA 0,1mg/l + GA3 10 mg/l 3 GA3 10 mg/l BA 1mgl/ + AIA 0,1 mg/l 0 4 BA 1mg/l AIA 0,1mg/l GA3 10 mg/l 1 5 5 0 0 0 0 1 1 1 1 5 5 5 5
2.2.4. Tạo cụm chồi
Khúc cắt thân 1 cm có nguồn gốc từ cây in vitro 6 tuần tuổi trên môi trường
MS có bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy vào môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l và BA thay đổi từ 1 đến 4 mg/l. Sau hai tuần, đếm số sơ khởi chồi hình thành.
2.2.5. Vai trò của nitrogen
• Thay đổi hàm lượng nitrogen tổng cộng
- Khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian của chồi trên trái dứa Ananas
comosus Merr được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1
mg/l với hàm lượng N thay đổi lần lượt : không có N ( -N), ¼ N, ½ N, N và 2N. Sau 10 ngày thu nhận mẫu cấy và tiến hành đo kích thước chiều ngang và chiều cao vùng mô phân sinh ngọn bằng trắc vi thị kính.
- Chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi lần lượt : không có N (-N), ¼ N, ½ N, N và 2N.
Sau 5 tuần, đếm số lượng chồi, số lá và đo chiều cao cây, kích thước lá dài nhất.
• Thay đổi tỉ lệ NH4/ NO3
Chồi 4 tuần tuổi trong môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy chuyền sang môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với tỉ lệ NH4/ NO3 thay đổi lần lượt: loại NH4NO3, loại KNO3, loại NH4NO3, KNO3 và thay thế bằng NH4Cl.
Sau 5 tuần, đếm số lượng chồi, số lá và đo chiều cao cây, kích thước lá dài nhất.
2.2.6. Tạo rễ
Cây con in vitro 6 tuần tuổi kích thước 1 đến 1,5 cm có nguồn gốc từ cụm chồi
trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1mg/l được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng với nồng độ khác nhau: ANA 0,5 mg/l; ANA 1 mg/l; AIA 1mg/l; AIA 2 mg/l; AIA 2,5 mg/l. Sau một tuần, đếm số sơ khởi rễ hình thành.
Tất cả các ống nghiệm, erlen chứa mẫu cấy đều được đặt trong phòng nuôi có cường độ ánh sáng 2500 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ ngày, nhiệt độ 22 ± 2oC tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh Lí Thực Vật.
2.2.7. Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm
Cây con 16 tuần tuổi kích khước 2 đến 2,5 cm được trồng trong các chậu nhỏ với giá thể gồm đất : xơ dừa với tỉ lệ 2: 1. Các cây con được đặt trong điểu kiện ánh sáng 35000 ± 500 lux, nhiệt độ 32 ± 2oC, ẩm độ 61 ± 5%. Sau 20 ngày, tiến hành đo chiều cao cây, chiều dài rễ, và đếm số lá, số rễ.
2.2.8. Phân tích thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lí thống kê chương trình SPSS phiên bản 11.5 (Statistical Program Scientific System) dùng cho Window.
Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% của giá trị được thể hiện bởi các chữ cái kèm theo, so sánh được thực hiện trong cùng một cột.
3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Quan sát hình thái giải phẫu
Vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc
từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr có hình thái tương tự như vùng mô
phân sinh ngọn điển hình. Vùng mô phân sinh với sự hiện diện của vùng đỉnh gồm những tế bào có kích thước nhỏ, bắt màu đậm được bao bọc bởi các vảy lá. So với hai vị trí non và già, vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có các vảy lá tăng trưởng nhiều hơn.
3.1.2. Thí nghiệm sơ khởi
3.1.2.1. Kích thước vùng mô phân ngọn ở ba vị trí non, trung gian và già
Vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa cho kết quả chiều ngang và chiều cao tốt nhất so với hai vị trí non, già. Vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở vị trí già chiều ngang không khác biệt so với vị trí trung gian nhưng chiều cao lại không khác biệt so với vị trí non. B ng 3.1. Kích thước vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian
và già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Kích thước vùng mô phân sinh ngọn V trí
Chiều ngang (µm) Chiều cao (µm) Vị trí non 137,6 ± 1,2a 58,5 ± 0,8ab
Vị trí trung gian 149,4 ± 2,7b 61,3 ± 1,8b
Vị trí già 147,0 ± 1,0b 56,4 ± 0,7a
Ảnh 3.1. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí non có nguồn gốc từ chồi
trên trái dứa Ananas comosus Merr
Ảnh 3.2. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
45µm
Ảnh 3.3. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí già có nguồn gốc từ