1940). E A C D B
Ở cây dứa Ananas comosus Merr, chồi bất định có nguồn gốc từ lớp tế tào nhu mô lá. Lá từ cây mẹ in vitro nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung ANA 0,5 mg/l
và BA 0,5 mg/l chuyển sang môi trường MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l, chồi được hình thành trong 15 ngày ( Mercier và cộng sự, 2003).
Ảnh 1.2. Sự phát triển chồi từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường
MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l
A. Lá cắt theo chiều dọc ở ngày thứ 6, bề mặt lá cuộn lên. B. Ngày thứ 9 có sự phồng lên ở đáy lá, xuất hiện cụm tế bào (protuberance). C. Tế bào trung tâm của protuberance phân chia mạnh, sự phân chia mạnh của tế bào nhu mô lá. D. Chồi hình thành ở ngày 15.
1.3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Chất điều hoà sinh trưởng là hợp chất hiện diện ở một nồng độ rất thấp trong mô, nhưng đủ để gây các phản ứng chuyên biệt (Bùi Trang Việt, 2000), không trực tiếp tham gia vào quá trình phát triển và biến dưỡng của thực vật nhưng có thể can thiệp và sửa đổi các quá trình đó.
1.3.1.Auxin
Idol-3-acetic acid (AIA) là hợp chất auxin tồn tại ở hầu hết các thực vật. Chất dùng phổ biến nhất có nguồn gốc tự nhiên là AIA hay chất tổng hợp như 2,4-D (2,4-diclophenoxy acetic acid), ANA (naphthalen acetic acid), AIB (indolbutyric acid)…
AIA được tổng hợp từ tryptophan hay idole, trong vùng đỉnh chồi trong sơ khởi lá, trong lá non. Trong mô thực vật, auxin tồn tại ở dạng tự do và liên kết với một acid amin. Dạng tự do gây ra hoạt tính, dạng liên kết không có hoạt tính nhưng dễ dàng phóng thích auxin theo con đường enzim. Liên kết cũng là một trong những cách điều hòa hàm lượng auxin trong tế bào (Bùi Trang Việt, 2000).
Ở mức tế bào, auxin kích thích sự hoạt động của bơm proton qua màng nguyên sinh chất, làm gia tăng nồng độ H+ ở khoảng gian bào, pH giảm. Sự giảm pH làm cầu nối extensin, hemicellulose, các hợp chất peptit và cellulose bị phá vỡ, Ca2+
nối liền các chuỗi hợp chất peptit bị loại đi, một số enzime thủy giải được hoạt hóa giúp cho sự tổng hợp hay phân hủy polysaccharid và protein được thực hiện, giúp duy trì sự lỏng lẻo của vách tế bào.
Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp mRNA liên quan trong sự tổng hợp enzim chuyên biệt, bao gồm enzim tạo tiền chất của cellulose và các hợp chất của vách (Bùi Trang Việt, 2000).
hợp với các chất điều hòa tăng trưởng khác. Cảm ứng tạo mô sẹo ở Ananas
comosus Merr cần môi trường MS có bổ sung ANA 1mg/l (Benega, 1995) hay
picloram 3mg/l (Sripaoraya và cộng sự, 2003). Để cảm ứng tạo rễ ở Brassia
rapai, ANA được xem là một auxin có hiệu quả, nhưng ở Lilium longiflorum
Thunb. thì sự tạo rễ tốt nhất được thấy ở môi trường AIA 2mg/l (Phan Hoàng Anh
và cộng sự, 2005). Ở cây dứa Ananas comosus Merr rễ lại không hình thành
trong môi trường chứa ANA 1-2,5 mg/l mà phải là môi trường AIB 1,5-2,5 mg/l (Akbar và cộng sự, 2003) hay cần sự kết hợp giữa AIB và ANA hay AIA ở các
nồng độ khác nhau như AIA 1,14 µM và AIB 2,46 µM ở Zizyphus jujuba Mill.
(Gu và cộng sự, 2005). Có thể nói, tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bào còn phụ thuộc vào loài, nồng độ và sự hiện diện của các chất điều hòa tăng trưởng khác.
Tuy nhiên, hiệu ứng của auxin giảm sau một nồng độ tối hảo và trở nên độc ở nồng độ qua cao (Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin được sinh ra từ phần non của cơ thể thực vật, chủ yếu ở chồi ngọn. Sau
khi cắt bỏ chồi ngọn, có sự giảm ngay nồng độ AIA sau 4h ở cây dứa Ananas
comosus Merr và sự phân chia tế bào ở lá mầm của nách (Beatriz và cộng sự,
2003) hay sau 8h ở Betula pendula (Galoch và cộng sự, 1998) nguyên nhân là do
sự di chuyển hữu cực của auxin chịu trách nhiệm duy trì ưu thế ngọn. Chatfield
(2000) nghiên cứu trên khúc cắt cô lập của Arabidopsis, chứng minh rằng khi tác
động lên ngọn làm ức chế vận chuyển auxin, đã góp phần đẩy mạnh sự phát triển của chồi bên. Sau 16h nuôi cấy nồng độ AIA lại tăng lên chứng minh cho sự thành lập một lượng auxin mới duy trì ưu thế ngọn của chồi mới. Bên cạnh đó, vẫn có mối liên quan với cytokinin và còn nhiều vẫn đề mà đến nay vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự tập trung auxin nồng độ cao ở ngọn và sự di chuyển hữu cực của auxin cũng sẽ dẫn đến sự hình thành cơ quan hoa theo trục dọc. Có thể nói, sự di chuyển hữu cực của auxin có vai trò quan trọng không chỉ trong giai đoạn dinh dưỡng để tạo chồi (nhánh và lá) mà còn trong sự ra hoa ở dâu tây và ở dứa (Hou và cộng sư,ï 2005 trong Tr n Th Anh Thoa, 2007).
1.3.2. Cytokinin
Kinetin là chất đầu tiên được khám phá bởi Skoog và Miller vào 1955. Đến 1963, Letham ly trích được cytokinin từ phôi nhũ bắp non có trong phần lớn thực vật và một vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn 10 lần, đó là zeatin. Trong nuôi cấy mô, người ta thường dùng zeatin và một số hợp chất tổng hợp như kinetin và BAP (benzilaminopurin hay benzil adenin). Nước dừa (phần lỏng) cũng được chứng minh là nguồn cung cấp zeatin (Bùi Trang Việt, 2000).
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật. Từ rễ, cytokinin được di chuyển trong mạch mộc để tới chồi. Tuy nhiên, các chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000).
Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và tự do, chúng bị phân hủy bằng con đường enzime, tạo sản phẩm cuối cùng là urê.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra, các chất này còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của một số enzim. Cơ chế tác dụng của cytokinin ở mức phân tử thể hiện ở tác động tương hổ của cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện tổng hợp DNA.
hoocmon khác để điều hoà các đáp ứng khác nhau ở thực vật bao gồm sự nảy mầm, sự tạo chồi, làm mất ưu tính ngọn, tăng rộng lá, sinh sản và lão suy. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (tăng trưởng củ) cũng như kích thích sự gia tăng tế bào lá trưởng thành (Bùi Trang Việt, 2000).
Lakshmanan và cộng sự (1997) phân tích khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ
mẫu lá ở Garcinia mangostana cho thấy rằng xứ lý BA là cần thiết ở giai đoạn
đầu tiên cho tế bào đi vào con đường phát sinh hình thái. BA ngoại sinh hoạt động trực tiếp lên tế bào thực vật, điều khiển sự tích lũy các hợp chất cytokinin khác. Hiệu quả của BA ngoại sinh trong sự tích lũy iP hay iPR được miêu tả trong
mẫu cấy lá Petunia hydrida trong quá trình phát sinh chồi (Auer và cộng sự,
1999).
Để tăng hệ số nhân giống người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy trong giai đoạn tạo chồi nhưng các loài thực vật chứa cytokinin nồng độ cao sẽ ức chế sự tạo rễ.
1.3.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin
Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có vai trò rất quan trọng trong quá trình hình thành mô sẹo, phát sinh cơ quan chồi, rễ.. Sự cân bằng giữa auxin và cytokinin là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Nồng độ thích hợp phụ thuộc vào từng loài cây và từng giai đoạn phát triển.
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan, đặc biệt là phân hoá chồi. Tỷ lệ auxin (phân hoá rễ) và cytokinin (phân hoá chồi) có ý nghĩa
quyết định trong sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy in vitro cũng như ở cây
nguyên (Skoog và Miller, 1957). Nếu nồng độ auxin cao hơn cytokinin sẽ kích thích tạo rễ còn ngược lại kích thích tạo chồi và khi tỉ lệ ở mức cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo.
Tái sinh chồi in vitro từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường tạo
chồi ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l, tỉ lệ auxin/cytokinin thấp nhất vào ngày thứ ba, chủ yếu là do sự tăng mạnh iP. Có thể là do hàm lượng iP nội sinh gây ra tín hiệu cho sự phát sinh cơ quan chồi ở đáy lá dứa. Sự gia tăng iP đòi hỏi sự hiện hiện
của ANA và BA trong môi trường (Mercier và cộng sự, 2003). Ở Zizyphus jujuba
Mill., sự tạo chồi bất định từ lá cũng cần sự hiện diện của TDZ 4,45 µM và AIA 2,85 µM ở giai đoạn tái sinh chồi và sau đó cấy chuyền sang môi trường BA 0,89µM và GA3 577 µM hay ở Neoregelia cruenta cũng cho kết quả tương tự
(Carneiro và cộng sự, 2005)
Quá trình phát triển rễ, cytokinin cũng có thể phối hợp với auxin dể đạt hiệu quả hơn (Koukourikou-petridou, 1998).
Vai trò của auxin và cytokinin cũng được tìm thấy trong quá trình hình thành
chồi từ mô sẹo. Ở Ananas comosus Merr, số lượng chồi cao nhất từ mô sẹo thu
được trong môi trường MS bổ sung kinetin 1,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l. Sự kết hợp giữa BA và ANA không có hiệu quả trong sự tạo chồi như là sự kết hợp giữa ANA và kinetin. Phần trăm mô sẹo hình thành chồi và số lượng chồi sinh ra từ mô sẹo thay đổi theo sự chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy. Môi trường MS chỉ chứa kinetin làm chồi phân hóa, hiệu quả hơn BA nhưng thấp hơn khi so sánh với ANA bổ sung vào môi trường (Akbar và cộng sự, 2003). Tương tự nhu cầu auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy sinh chồi với
tỷ lệ cao nhất cũng được phát hiện ở Carcica papaya (Modal và cộng sự, 1994),
Hybanthus ennea-spermus (Prakash, 1999), Salvia selerea (Liu, 2000), Bixa orellana (Sha Vallikhan và cộng sự, 2002), Capsicum annuum L. (Dabauza,
1.3.4. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giberelin được tổng hợp từ acid mevanoid ở phôi đang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non… GA là một nhóm lớn, trên một trăm chất có cấu trúc hoá học cơ bản giống nhau và được gọi là giberelin, kí hiệu GAx (x: số thứ tự theo khám phá). GA3 là giberelin được sử dụng nhiều nhất trong các loại giberelin được phát hiện, nó có tác dụng kích thích sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ thấp.
Trong cây, giberelin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó di chuyển không phân cực, hướng ngọn hay hướng gốc tuỳ nơi sử dụng, vận chuyển trong hệ thống mạch. Giberelin có vai trò chủ yếu trong kích thích sự kéo dài lóng vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000). Trong phần lớn các trường hợp, giberelin có hoạt tính bổ sung cho auxin, nhưng hai hormon này hoạt động độc lập nhau.
Acid abscisic được tổng hợp hầu hết các bộ phận của cây như rễ, lá, hoa, quả, hạt, củ. Nó tích luỹ nhiều trong cơ quan già, cơ quan đang ngủ, sắp rụng. Acid abscisic vận chuyển phân cực trong cây theo mạch mộc và libe làm cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm kéo dài lóng, cản tăng trưởng của diệp tiêu và mô nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000).
1.4. Ảnh hưởng của nitrogen trong quá trình phát triển chồi:
Nitrogen là thành phần bắt buộc của protid chất đặc trưng cho sự sống. Nó có trong thành phần enzim, màng tế bào, trong diệp lục tố mang chức năng cấu trúc. Nitrogen còn là thành phần của nhiều vitamin B1, B6, B12, PP… đóng vai trò là nhóm hoạt động của nhiều hệ enzim oxi hóa khử trong đó có sự hình thành của adenin. Các hợp chất nitơ cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ATP, ADP (Võ Thị Bạch Mai, 2003).
Nitrogen tồn tại ở hai dạng: khí nitơ tự do trong khí quyển và dạng hợp chất hữu cơ, vô cơ khác nhau. Nitrogen là dạng duy nhất mà cây có thể hấp thu cả hai
dạng cation và anion NH4+ và NO3-. Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung một lượng lớn NO3- và một lượng nhỏ NH4+.
Người ta có thể dựa vào màu sắc lá, chiều cao cây, số lượng chồi, trọng lượng khô của chồi và rễ để xác định trạng thái dinh dưỡng của cây. Ở lúa, cây thiếu nitrogen biểu hiện lá ngắn, hẹp, màu xanh nhạt, vàng rụi sớm, yếu rạ, còi cọc. Cây dư nitrogen thì lá dài, rộng nhưng mỏng, xanh đậm (Tsunoda, 1964 trong Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).
Thí nghiệm trên cây cà chua, thay đổi hàm lượng nitrogen tổng số ở các nghiệm thức 0N, 1/3N, N cho thấy những biểu hiện khác nhau. Sự thiếu hụt nitrogen làm giảm sự tăng trưởng lá từ ngày thứ 4 và giảm tỉ lệ tăng trưởng chồi từ ngày thứ 6 ở nghiệm thức 0N, từ ngày thứ 6 và ngày thứ 12 ở nghiệm thức 1/3 N. Ngoài ra, sự thiếu nitrogen còn làm thay đổi màu sắc, giảm hàm lượng chlorophyll, tăng trưởng phenol ở lá (Quijada, 2002). Có thể nói, nitrogen là yếu tố quyết định sự tăng trưởng ở thực vật (Cazetta và cộng sự, 1999).
Tuy nhiên, sự tăng hàm lượng nitrogen không phải lúc nào cũng dẫn đến sự
tăng trưởng mạnh của chồi và rễ. Ở Triticum aestivam L., hàm lượng nitrogen ở
lá tăng nhanh khi nồng độ nitrogen trong môi trường tăng nhưng khi nồng độ nitrogen trong môi trường vượt quá 3,75 nmol/l thì hàm lượng nitrogen ở lá bắt đầu tăng chậm lại. Tương tự, trọng lượng khô của chồi tăng khi nồng độ nitrgen trong môi trường tăng đến 11,25 nmol/l sau đó bắt đầu giảm (Shangguan, 2003). Tóm lại, trọng lượng khô của chồi tăng khi hàm lượng nitrogen tăng nhưng bắt đầu giảm khi đến một giới hạn nhất định. Hàm lượng nitrogen tối ưu cho sự tăng trưởng chồi thay đổi tùy theo giống. Sự tăng trưởng của rễ thì ngược lại.
Bên cạnh đó, tỷ lệ NH4+ và NO3- cũng có vai trò quan trọng. Ở Dioscorea
Ở Nicotiana tabacum, sự phát sinh chồi phụ thuộc vào tỉ lệ NH4+/NO3-. Môi trường chuẩn có NO3- 39,4 mM và NH4+ 20,6 mM hình thành chồi, lá trong khi môi trường chỉ có NO3- hay chỉ có acid ethanesulphonic (MES, thay thế NH4+) không có sự phát sinh chồi, hình thành lá. Trường hợp này chứng tỏ hàm lượng nitrogen trong môi trường không quan trọng bằng tỉ lệ giữa nitrat và amonium và cũng chứng minh cho sự hỗ trợ giữa nitrat và amonium trong quá trình phát sinh cơ quan (Ramage, 2002).
Ở cây dứa Ananas comosus Merr vai trò của nitrogen cũng đã được chứng
minh bằng thực nghiệm. Do mật độ cây trồng trên một đơn vị diện tích cao, tổng lượng sinh khối lớn, bộ rễ nhiều và hoạt động mạnh nên nhu cầu dinh dưỡng của dứa rất cao. Đối với cây trên đồng, nếu tính trên một ha đất trồng trọt, cây dứa lấy từ đất 83 kg N (thân lá 40,2 kg; quả 35kg) và một số nguyên tố vi lượng khác (Trần Thế Tục, 2002).
Cây dứa thiếu nitrogen sinh trưởng chậm lại, cây lùn, số lá giảm và màu sắc lá cũng thay đổi. Ban đầu, các lá non chuyển sang màu lục vàng, sau đó tất cả các lá hình thành đều có mép lá màu vàng đỏ hay vàng chanh nhạt. Đến giai đoạn cuối, tất cả các lá đều có màu vàng nhạt. Bên cạnh đó, cây cũng ít mọc chồi thân, chồi cuống và kích thước chồi cũng giảm (Dương Tấn Lợi, 2002). Lá tăng trưởng mạnh trở lại khi cung cấp lại nitrogen cho cây thiếu nitrogen do ảnh hưởng tới quá trình phân chia và tăng trưởng của tế bào. Điều này tương tự ở
Prunus persica, tăng hàm lượng nitrgen trong suốt quá trình phát triển làm tăng
số lượng lá hình thành (Lobit, 2001).
Nhu cầu nitrogen của dứa cũng thay đổi theo giai đoạn phát triển. Trong 4 tháng đầu, dứa chỉ hấp thụ lượng nitrogen bằng một nữa của 4 tháng sau và bằng một phần tư của toàn chu kì sinh trưởng (Trần Thế Tục, 2002). Có thể nói, vào
giai đoạn đầu sự sinh trưởng chậm lại và việc thiếu nitrogen ít quan trọng hơn giai đoạn sau.
Nitrogen liên hệ mật thiết với potasium trong quá trình phát triển của dứa. Đất