nh 3.24. Cây con in vitro 16 tuần tuổi sau khi ra v n m 20 ngày 1 cm
3.2. THẢO LUẬN
Vai trò của vị trí sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr trong quá trình phát triển chồi
So với vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở hai vị trí non và già, vùng mô phân
sinh của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
có chiều ngang và chiều cao lớn nhất. Sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có khả năng tiếp tục con đường phát triển chồi sau khi đã thoát khỏi phần nào ưu tính ngọn, biến dưỡng mạnh nên cường độ hô hấp của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian và non cao hơn. Tuy nhiên, những sơ khởi chồi ở vị trí già dù thoát khỏi ưu tính ngọn cũng vẫn không thể phát triển có lẽ do vai trò của trái bên dưới.
Khi nuôi cấy sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian và già với kích thước 0,3 đến 0,5 cm trên môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l cho kết quả chiều cao sơ khởi chồi tăng dần theo thời gian. Ở ngày 14, 30 chiều cao sơ khởi chồi ở vị trí trung gian đạt kết quả cao nhất.
Trong quá trình tăng trưởng đó, cường độ hô hấp của sơ khởi chồi giảm dần theo vị trí non, trung gian và già trong đó cường độ hô hấp của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian và non không có sự khác biệt. Điều này phù hợp với sự tăng trưởng cao nhất của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian trong hai thí nghiệm trên. Cường độ hô hấp tăng chứng tỏ nhu cầu năng lượng ở một sơ khởi chồi đã thoát khỏi ưu tính ngọn nhưng năng lượng không phải là yếu tố duy nhất cho sự phát triển chồi mà còn do sơ khởi chồi ở vị trí trung gian đáp ứng tốt hơn hai vị trí còn lại.
Hàm lượng AIA thấp và hàm lượng zeatin cao của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chồi. Thêm vào đó, hàm lượng GA3 của chồi ngọn vị trí trung gian cao nhất cũng đóng vai trò quan trọng vì GA3 kích thích
sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì, giúp sự tăng trưởng chồi, kéo dài lóng và tăng trưởng lá (Bùi Trang Việt, 2000). Hàm lượng AAB ở cả ba vị trí không có sự khác biệt.
Vì những lí do trên, chúng tôi tiếp tục xử lý riêng rẽ hay phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật cho sự phát triển sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn
gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr trong các thí nghiệm tiếp theo.
• Phát triển chồi từ khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr
Auxin có vai trò tăng rộng và kéo dài tế bào thúc đẩy cho quá trình phân bào trong nuôi cấy (Kikorian, 1995). Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, tạo chồi và trì hoãn quá trình lão suy. Môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l; BA 0,5 mg/l và BA 1 mg/l đều làm tăng kích thước vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi so với đối chứng sau 10 ngày nuôi cấy.
Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nhất định cũng có vai trò rất quan trọng trong sự biệt hoa tạo mô sẹo, hình thành cơ quan chồi, rễ… Sự cân bằng giữa auxin và cytokinin là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1957) cho thấy tỉ lệ auxin và cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, còn thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi. Khi tiến hành thí nghiệm trên môi trường BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l hay BA 1 mg/l và ANA 0,5 mg/l hay BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l chiều cao và chiều ngang vùng mô phân sinh chồi ngọn đạt kết quả cao trong đó trên môi trường BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l kích thước vùng mô phân sinh chồi ngọn đạt cực đại sau 10 ngày nuôi cấy. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Mercier
và ANA 1 mg/l. Akbar và cộng sự (2003) khi phát sinh chồi từ mô sẹo ở cây dứa
Ananas comosus Merr cho rằng số lượng chồi hình thành từ mô sẹo thay đổi theo sự
xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Môi trường chỉ có cytokinin làm chồi phân hóa trong đó kinetin hiệu quả hơn BA nhưng thấp hơn khi có sự kếp hợp với ANA.
Nhiều thí nghiệm trên các đối tượng khác cũng cho kết quả tương tự mhư ở Carcica
papaya (Modal, 1994), Hybanthus ennea-spermus (Prakash, 1999), Salvia selerea
(Liu, 2000), Bixa orellana (Sha Villakhan và cộng sự, 2002). Có thể nói, tác động
của auxin và cytokinin trong nuôi cấy tế bào phụ thuộc vào loài, nồng độ và sự hiện hiện của chất điều hòa tăng trưởng khác.
Thông thường, GA3 kích thích sự phân chia tế bào mô phân sinh lóng, sự kéo dài
của các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh lóng và sự tăng trưởng chồi. GA3 còn có vai trò làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích (Bùi Trang Việt, 2000) do đó việc bổ sung GA3 vào môi trường cũng đóng vai trò quan trọng. Trên
môi trường MS bổ sung GA3 10 mg/l hay khi xử lý bằng cách ngâm mẫu cấy trong
dung dịch GA3 100mg/l trong 1h sự tăng trưởng kích thước vùng mô phân sinh ngọn khác biệt rõ rệt so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại sau 10 ngày nuôi cấy. Trong khi đó, khi xử lý phối hợp BA 1 mg/l, ANA 0,5 mg/l và GA3 1, 10, 20 mg/l
hay BA 1 mg/l, AIA 0,1 mg/l, GA3 1,10, 20 mg/l lại không đạt hiệu quả như khi xử
lý riêng rẽ, BA, AIA, ANA hay GA3.
Cũng xử lý các chất điều hòa tăng trưởng thực vật như trên nhưng chia làm hai giai đoạn cấy chuyền. Mỗi giai đoạn sẽ bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau. Với mục đích sử dụng vai trò độc lập của GA3, chúng tôi bổ sung
kích thích tạo sơ khởi chồi trước bằng vai trò BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l sau đó cấy chuyền sang môi trường của bổ sung GA3 10 mg/l để kéo dài chồi hay cấy chuyền sang môi trường phối hợp GA3 10 mg/l, BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l để kéo dài chồi trên môi trường cũ. Sự hiện diện của GA3 10 mg/l trong tất cả các nghiệm thức đều cho số lá hình thành thấp hơn khi chỉ phối hợp BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l trong 5 tuần nuôi cấy. Có lẽ hàm lượng GA3 làm tăng hàm lượng auxin trong mô cấy. Ở nồng độ cao, auxin lại cản sự phát triển của phác thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000).
Tương tự, kích thích kéo dài trước với GA 10 mg/l sau đó cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l số lá hình thành sau 5 tuần vẫn thấp. Điều này cho thấy giai đoạn đầu trong sự phát triển chồi cần vai trò của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy.
Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tạo cụm chồi
Khúc cắt thân cây dứa Ananas comosus Merr 6 tuần tuổi trên môi trường MS có
bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy vào môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l và BA 1 đến 4 mg/l. Số sơ khởi chồi hình thành sau 2 tuần tăng tỉ lệ thuận với nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy. Tỉ lệ auxin và cytokinin như trên hoàn toàn phù hợp với sự tăng trưởng chồi theo Skoog và Miller (1957). Kết quả cho thấy sự hiện diện của BA là cần thiết cho tế bào đi vào con đường phát sinh hình thái. BA ngoại sinh tác động trực tiếp lên tế bào thực vật, điều khiển sự tích lũy của các hợp chất cytokinin khác ( Lakshmam, 1997).
Vai trò của nitrogen trong quá trình phát triển chồi
ngang, chiều cao vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ
chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr ở nghiệm thức 2N (tăng gấp đôi hàm lượng
nitrogen) đạt cực đại. Ở các nghiệm thức –N, ½ N, ¼ N sự khác biệt không có ý nghĩa. Có thể nói, hàm lượng nitrogen tăng cao trong môi trường nuôi cấy làm tăng kích thước của mô phân sinh chồi ngọn nhưng sự thiếu hụt nitrogen ở giai đoạn này lại không đóng vai trò quan trọng. Điều này phù hợp với kết quả của Trần Thế Tục (2000) khi tiến hành so sánh nhu cầu nitrogen của dứa trong suốt chu trình phát triển. Trong 4 tháng đầu, dứa chỉ hấp thu một lượng nitrogen gần bằng ½ của 4 tháng sau và bằng ¼ của toàn chu trình sinh trưởng.
Chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy vào môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng nitrogen thay đổi. Trong môi trường thiếu hụt nitrogen, số chồi, chiều cao chồi, số lá và chiều dài lá đều giảm. Sự tăng hàm lượng nitrogen trong môi trường dẫn đến số lượng chồi tăng tăng cao nhưng chiều cao, số lá, chiều dài lá lại không có sự khác biệt so với chuẩn. Điều này phù hợp với kết quả ở cây cà chua (Quijada, 2002) hay cây lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).
Chồi 4 tuần tuổi trong môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l
được cấy vào môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l với tỉ lệ NH4/NO3
thay đổi. Ở tất cả các nghiệm thức chiều cao chồi, số lá, chiều dài lá đều giảm so với chuẩn. Điều này có nghĩa là không chỉ hàm lượng nitrogen ảnh hưởng đến quá trình phát triển chồi mà tỉ lệ NH4/NO3 cũng đóng một vai trò quan trọng. Để sinh
trưởng và phát triển, cây cần cả hai dạng nitrogen NH4+và NO3-. Có lẽ, với NH4+,
ion H+ được giải phóng ra từ rễ làm tăng tính axit của môi trường. Đối với nguồn
phóng ra từ rễ làm cho môi trường dinh dưỡng cân bằng tĩnh điện (Võ Thị Bạch Mai, 2003).
Tuy nhiên ở hai dạng NH4+ và NO3-, dạng NH4+ có hiệu quả hơn so với dạng
NO3- vì dứa là loại cây thường được trồng trên đất chua, bón đạm amôn cây dễ hấp
thụ hơn ( Trần Thế Tục, 2002). Tương tự trên, ở Dioscorea deltoidea Wall, sự phát
sinh chồi và rễ từ mô sẹo chỉ thấy trong môi trường có amonium nitrat hay amonium
citrate (Singh,1978) hay ở Nicotiana tabacum, sự hình thành chồi chỉ thấy trong môi
trường có cả NH4+ và NO3- (Ramage, 2002).
Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tạo rễ
Chồi 6 tuần tuổi của cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường MS bổ sung
BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l được cấy vào môi trường MS bổ sung ANA, AIA ở các nồng độ khác nhau đều tạo rễ. Môi trường MS bổ sung AIA 2,5 mg/l cho số sơ khởi rễ cực đại sau 1 tuần nuôi cấy. Điều này chứng minh cho vai trò của auxin trong quá trình tạo rễ. Auxin ở nồng độ thấp (ANA 0,5 mg/l, ANA 1 mg/l hay AIA 1 mg/l) chỉ giúp tăng trưởng rễ nhưng ở hàm lượng cao (AIA 2 mg/l, AIA 2,5 mg/l) giúp tạo được nhiều rễ mới.
4.1. KẾT LUẬN
- Sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr có khả năng tăng trưởng ban đầu tốt nhất được đánh giá qua kích thước của vùng mô phân sinh, cường độ hô hấp cao và hàm lượng auxin, cytokinin thích hợp.
- Sự phối hợp giữa BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l cho kết quả cao nhất về sự tăng trưởng vùng mô phân sinh của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10, 20 ngày nuôi cấy.
- Số lượng sơ khởi chồi hình thành sau 2 tuần nuôi cấy tăng tỉ lệ thuận với hàm lượng BA được bổ sung vào môi trường.
- Môi trường MS bổ sung AIA 2,5 mg/l cho số sơ khởi rễ cao nhất sau 1 tuần nuôi cấy. Sau đó, cây phát triển tốt trong môi trường ngoài tự nhiên không có auxin.
- Sự bổ sung gấp đôi hàm lượng nitrogen (2N) có vai trò quan trọng cho sự phát triển chồi từ tuần thứ 4 trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l.
4.2. ĐỀ NGHỊ
Nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu sự phát triển cây con trong tự nhiên sau giai đoạn phòng thí nghiệm để có một hệ thống cây sinh trưởng tốt, thích nghi với điều kiện môi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Phan Hoàng Anh, Phan Ngô Hoang, Bùi Trang Việt, 2005. Vi nhân giống
từ vảy hành của cây huệ trắng (Lilium longiflorum Thunb.). Tạp chí Phát
triển KH–CN, tập 8, số 8, 43-47.
2. Võ Văn Chi, 1977. Phân loại thực vật bậc cao. NXB Trẻ.
3. Nguyễn Ngọc Đệ, 2009. Giáo trình cây lúa. NXB Nông nghiệp
4. Dương Tấn Lợi, 2002. Kỹ thuật trồng cây ăn quả Khóm (dứa). NXB
Thành Nghĩa.
5. Võ Thị Bạch Mai, 2003. Thủy canh cây trồng. NXB Đại Học Quốc Gia
Thành Phố Hồ Chí Minh, 15-19.
6. Trần Thị Anh Thoa, 2007. Khảo sát vài biến đổi hình thái và sinh lý trong
quá trình ra hoa ở cây dứa Ananas comosus Merr, Luận văn Thạc sĩ ngành
Sinh học, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
7. Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001. Thực vật cấp cao. NXB Đại Học Quốc Gia
Thành Phố Hồ Chí Minh.
8. Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, 2002. Kĩ thuật trồng dứa. NXB Nông
nghiệp.
9. Lê Thị Trung, 2003. Tìm hiểu và áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật để kiểm soát hiện tượng rụng trái non xoài (Mangifera indica L.),
Luận án Tiến sĩ ngành Sinh học, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
10.Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương - Phần II: phát triển. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Andrew W.W., Bartel B., 2005. Auxin regulation, action and interaction.
Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University.
2. Akbar M.A., 2003. Callus induction and high frequency plant regeneration
of pineapple (Ananass comosus (L.) Merr.). Plant Tissue Cult 13(2), 109-
116.
3. Auer C.A., Motyka V., Brezinova A., Kaminek M, 1999. Endogenous
cytokinin accmulation and cytokinin oxidase activity during shoot
organogenesis of Petunia hybrida. Physiology Plant. 105, 141-147.
4. Bartholomew D.P., Kadzimin S.B., 1977. Pineapple. In Alvim, PT and
Kozlowski, TT (eds) Ecophysiology of Tropical Crops. Academic press, New York, 113-156.
5. Beatriz M. S. , Jane E. Kraus, Endres L., Mercier H., 2003. Relationship
between endogenous hormonal levels and axillary bud development of
Ananas comosus nodal segments. Plant Physiology and Biochemistry, 41,
733-739.
6. Benega R., 1995. In vitro regeneration and callus formation in pineapple
hybrid seeds (Ananas comosus L.). 425, 215-220
7. Brien S., Lewith, G., Walker, A., Hicks, S.M., Middleton, D., 2004.
Bromelain as a treatment for Osteoarthritis: a Review of Clinical Studies. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine 1, 251-257. 8. Caba. J. M., Centeno M. L. Fernandez. B., Gresshoff. P. M; Ligero F.,
2000. Inoculation and nitrate alter phytohormone levels in soybean root:defferences between a supernodulating moutant and wild type. Planta 211, 98-104.
9. Carneiro L.A. and al., 2004. In vitro regeneration from leaf explants of
Neoregelia cruenta (R. Graham) L.B. Smith, an endemic bromeiad from
Eastern Brasil. Plant Cell, Tissue and organ Culture. 55, 79-83.
10.Cazetta J.O., Seebauer J.R, Below, F.E., 1999. Sucrose and nitrogen
supplies regulate growth of maize Kernels. Ann. Bot. 84, 747-757.
11.Chapin F.S., Walter, C.H.S. Clarkson D. T., 1988. Growth response of barley and tomato to nitrogen stress and its control by abscisic acid, water relations and photosynthesis. Plantes 173, 352-366.
12.Chatfield S.P., 2000. The hormonal regulation of axillary bud growth in
Arabodopsis. Plant J. 24, 159-169.
13.Clark S.E., 2001. Cell signalling at the shoot meristem. Narure reviews Molecular Cell Biology, 2, 276-284.
14.Collin J.L., 1960. The Pineapple: Botany, Cultivation and utilisation. Interscience Publishers, New York.
15.Dabauza M., 2004. High efficiency organogenesis in sweet pepper