1.2.1. Sự phát triển:
Sự phát triển là thuật ngữ chỉ những thay đổi ở cơ thể thực vật theo thời gian gồm nhiều giai đoạn nối tiếp, không đảo ngược, là những thay đổi của cơ quan, mô, tế bào, hay bào quan thực vật từ lúc khởi đầu cho tới lúc trưởng thành (Hopkins, 2004; Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát triển được biểu hiện qua hai chuỗi thay đổi: thay đổi về lượng và thay đổi về chất. Sự thay đổi về lượng hay là sự tăng trưởng chính là sự gia tăng về kích thước (chiều dài, chiều rộng, diện tích, thể tích) hay trọng lượng (tươi hay khô). Những thay đổi về chất hay là sự phân hóa là quá trình tạo nên những đặc tính mới về hình thái nhằm giúp sinh vật có thể đảm nhận những chức năng mới (Bùi Trang Việt, 2000).
1.2.2. Mô phân sinh ngọn
1.2.2.1. Cấu trúc mô phân sinh ngọn
Mô phân sinh ngọn là nguồn tế bào cung cấp cho mọi sự phân hoá các cơ quan thực vật, nằm ở đỉnh thân.
Trong quá trình phát sinh phôi, mô phân sinh ngọn phát triển ở vùng giữa sơ khởi lá mầm (cây hai lá mầm) hay gốc thuẫn (cây một lá mầm). Mô phân sinh ngọn kiểu mẩu có đường kính từ 100 đến 200µm, vài trường hợp cá biệt 50 hay 90µm, có dạng phẳng hoặc mũ nấm, hay ngón tay.
Mô phân sinh ngọn biểu hiện sự phân vùng không phụ thuộc vào cấu trúc lớp. Sự phân hoá vùng của mô phân sinh không cố định, hoạt động của mỗi vùng tùy vào vị trí của chúng trong toàn thể mô phân sinh. Có ba vùng :
• Vùng trung tâm (vùng đỉnh): là vùng tế bào khởi đầu ngọn bao gồm tế bào ở lớp tunica và corpus, là những tế bào chưa biệt hoá và kích thước tương đối lớn, tế bào chất đậm đặc, không bào nhiều và to, hoạt tính phân chia thấp, chu kỳ tế bào dài. Tế bào chủ yếu ở pha G1.
• Vùng ngoại vi (vùng bên): tế bào vùng ngoại vi xếp chồng lên nhau, khởi phát sự biệt hoá, kích thước nhỏ, phân chia nhanh, chu kỳ tế bào ngắn, tế bào chất nhiều rRNA, là nơi tượng lá hoặc các mô của thân, có khả năng phát sinh cơ quan.
• Vùng lõi: nằm dưới vùng đỉnh, gồm vài dãy tế bào xếp chồng lên nhau. Các tế bào có không bào lớn, hàm lượng rRNA, hoạt tính phân chia và chu kì tế bào có những đặc tính trung gian so với vùng trung tâm và ngoại vi (Bùi Trang Việt, 2000). Đây là vùng phát sinh mô lõi (mọi mô khác có nguồn gốc từ vùng bên).
Tuy nhiên, nguồn gốc của dòng tế bào không quyết định nguồn gốc mô phân sinh mà chính vị trí của tế bào trong mô phân sinh mới là yếu tố quyết định (Fletcher, 2002). Có hai lớp:
• Tunica: lớp tunica bao gồm lớp L1 bao phủ ngoài cùng và lớp L2 nằm dưới (một lá mầm chỉ có một lớp), là những lớp tế bào phân chia thẳng góc với mặt phẳng mô phân sinh, hình thành biểu bì và các tế bào sinh dục như bao phấn và bầu nhụy.
• Corpus: lớp L3 là những tế bào nằm bên dưới tunica, có thể phân chia mọi hướng, góp phần vào sự hình thành hệ thống mạch thân, lõi và các cơ quan hoa.
Hình 1.3. Cấu trúc mô phân sinh ngọn
A. Cấu trúc chồi ngọn của Coleus. B. Hai kiểu phân chia tế bào ở mô phân sinh
ngọn. C. Sơ đồ hóa cấu trúc phân lớp và phân vùng của mô phân sinh ngọn
1.2.2.2. Yếu tố điều khiển kích thước của mô phân sinh ngọn
Mô phân sinh ngọn phân chia tế bào trong suốt chu kì sống (ngoại trừ giai đoạn ngủ hay bị tổn thương) nhưng vẫn đảm bảo kích thước đặc trưng cho thấy tồn tại sự cân bằng giữa phân chia tế bào hình thành cơ quan mới với duy trì kích thước kiểu mẫu ở mô phân sinh ngọn. Sự cân bằng này là do sự liên lạc giữa các vùng trong mô phân sinh.
Khi tiến hành xử lí đột biến clavata (CLV1) ở Arabidopsis, mô phân sinh tăng rộng bởi các tế bào không phân hóa trong khi đột biến meristemless 1 (STM1) mô phân sinh bị mất trong suốt quá trình sinh phôi, đột biến wuschel (WUS) mô phân
sinh bị mất sau sự hình thành vài cơ quan. Trên dạng hoang dại, những gen bị bất hoạt ở đột biến CLV1 mã hóa protein CLV1 làm giảm trong khi STM và WUS làm tăng số lượng tế bào mô phân sinh. Những gen này hoạt động độc lập nhưng thống nhất với nhau và với vài gen khác để duy trì kích thước và cấu trúc mô phân sinh ngọn (Clark, 2001).
Người ta đã tìm hiểu sự biểu hiện của những gen này trong mô phân sinh và cả những protein được mã hóa bởi nó. CLV1 biểu hiện chủ yếu ở lớp L3 của CZ và mã hóa leucine-rich repeat (LPR) receptor kinase. Gen khác, CLV3 tăng rộng kích thước mô phân sinh chủ yếu biểu hiện ở lớp L1 và L2 của CZ. Protein mã hóa bởi CLV3 còn nhiều điều chưa rõ.
Người ta giả thuyết rằng CLV3 có thể hoạt động như một tín hiệu đối kháng CLV1. Ảnh hưởng giữa CLV1 và CLV3 đàn áp sự biểu hiện của WUS làm giảm kích thước mô phân sinh ngọn. Tuy nhiên, WUS lại đòi hỏi sự biểu hiện của CLV3 như là một tín hiệu điều hòa ngược để duy trì kích thước của mô phân sinh. STM biểu hiện trong mô phân sinh và duy trì tế bào mô phân sinh ở một trạng thái nhất định tương tự như qui luật điều hòa biểu hiện của CLV3.
Rõ ràng là mô phân sinh ngọn được điều khiển bởi một hệ thống gen ảnh hưởng qua lại với nhau nghĩa là khi một tế bào trong mô phân sinh thay đổi vị trí, nó sẽ nhận một tín hiệu mới và phát triển theo một kiểu riêng biệt.
1.2.3. Sự phát triển chồi
Sự tăng trưởng diễn ra ở chồi ngọn là sự tương quan giữa hai quá trình: tự tăng trưởng của đỉnh ngọn và sự tạo các cơ quan bên. Sự tự tăng trưởng đòi hỏi phải duy trì kích thước của mô phân sinh mặc dù luôn có quá trình phân chia tế bào mạnh diễn ra ở đó. Hai quá trình này tạo ra những biến đổi hình thái trên bề mặt của mô phân sinh ngọn.
Đầu tiên xuất hiện một dãi hẹp 1 đến 3 tế bào nở rộng ở ngoại vi gọi là sơ khởi lá, tiếp theo một phần của vùng ngoại vi sẽ có một sơ khởi khác được hình thành nhưng nhỏ hơn. Nách sơ khởi được hình thành từ một dãi tế bào thấp nhất. Sự tăng trưởng của lớp tế bào này làm cho nách lá mở rộng dọc theo rìa của sơ khởi, tách sơ khởi ra khỏi vòm ngọn. Sơ khởi tiếp tục tăng trưởng tạo thành lá. Sự hình thành sơ khởi lá có thể chia thành bốn giai đoạn. Đầu tiên, trụ lá được nâng
lên, bề mặt trụ mở rộng. Sau đó, một số tế bào gia tăng kích thước bề mặt, một số giảm kích thước lõm xuống tạo hình oval. Tiếp theo, nách sơ khởi được hình thành tách sơ khởi ra khỏi vòm ngọn, bề mặt sơ khởi tiếp tục được tăng rộng. Cuối cùng, sơ khởi uốn cong thành vòm ngọn (Kwiatkowska và cộng sự, 2003). Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên quan đến mô phân sinh mà còn có thể xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì. Vì vậy, chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh do sự khử phân hóa tế bào trưởng thành (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)
Bảng 1.2. Nguồn gốc khác nhau của chồi bất định ở một số loài
Tên loài Cơ quan Nguồn gốc Tác giả
Saintpaula ionantha
(African Violet)
Cuống lá, phiến lá
Tế bào biểu bì Naylor và Johnson 1937 Sedum stahii (Sedum) Cuống lá, phiến lá Biểu bì cuống lá và vòng ngoài tế bào dưới biểu bì hay ngoại vi của mô sẹo
Yarbrough 1936
Begonia xhiemails
(Rieger Begonia)
Cuống lá Biểu bì và vòng ngoài tế bào duới biểu bì
Mikkelson và Sink 1978
Lilium longgiflorum
(Easter Lily)
Vảy thân Biểu bì và vòng ngoài tế bào duới biểu bì
Walker 1940
Malus sylvestrus
(Apple)
Rễ Vòng ngoài của libe thứ cấp, cạnh libe và vỏ
Siegler và Bownan 1939
Convolvus
(Bind weed)
Rễ Trụ bì đối diện xylem thứ cấp Torrey 1958 Tamarix pentandra ( Saltcedar) Rễ Trụ bì gần tầng phát sinh gỗ Wilkinson 1966
Naylor và Johnson (1937) nghiên cứu sự phát triển chồi bất định từ cuống lá
hay phiến lá Saintpaula ionantha cho thấy nguốn gốc của chồi bất định từ lớp tế
bào biểu bì và chia làm ba giai đoạn phát triển:
• Giai đoạn 1: tế bào biểu bì trải qua lần phân chia đầu tiên (A).
• Giai đoạn 2: hình thành nhóm tế bào vô tổ chức (B).
• Giai đoạn 3: xuất hiện sơ khởi chồi (C).
Hình 1.4. Các giai o n phát triển chồi ở cây Saintpaula ionantha (Naylor và
Johnson , 1957).
Ở Lilium longgiflorum chồi bất định có nguồn gốc từ lớp tế bào dưới biểu bì
và được chia làm năm giai đoạn phát triển:
• Giai đoạn 1: tế bào dưới biểu bì trải qua lần phân chia đầu tiên (A).
• Giai đoạn 2: tiếp tục phân chia hình thành sơ khởi chồi (B).
A
• Giai đoạn 3: sơ khởi lá xuất hiện cạnh sơ khởi chồi (C).
• Giai đoạn 4: tiếp tục phân chia hình thành sơ khởi lá (D).
• Giai đoạn 5: chồi kéo dài (E).
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển chồi bất định ở Lilium longgiflorum (Walker,
1940). E A C D B
Ở cây dứa Ananas comosus Merr, chồi bất định có nguồn gốc từ lớp tế tào nhu mô lá. Lá từ cây mẹ in vitro nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung ANA 0,5 mg/l
và BA 0,5 mg/l chuyển sang môi trường MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l, chồi được hình thành trong 15 ngày ( Mercier và cộng sự, 2003).
Ảnh 1.2. Sự phát triển chồi từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường
MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l
A. Lá cắt theo chiều dọc ở ngày thứ 6, bề mặt lá cuộn lên. B. Ngày thứ 9 có sự phồng lên ở đáy lá, xuất hiện cụm tế bào (protuberance). C. Tế bào trung tâm của protuberance phân chia mạnh, sự phân chia mạnh của tế bào nhu mô lá. D. Chồi hình thành ở ngày 15.
1.3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Chất điều hoà sinh trưởng là hợp chất hiện diện ở một nồng độ rất thấp trong mô, nhưng đủ để gây các phản ứng chuyên biệt (Bùi Trang Việt, 2000), không trực tiếp tham gia vào quá trình phát triển và biến dưỡng của thực vật nhưng có thể can thiệp và sửa đổi các quá trình đó.
1.3.1.Auxin
Idol-3-acetic acid (AIA) là hợp chất auxin tồn tại ở hầu hết các thực vật. Chất dùng phổ biến nhất có nguồn gốc tự nhiên là AIA hay chất tổng hợp như 2,4-D (2,4-diclophenoxy acetic acid), ANA (naphthalen acetic acid), AIB (indolbutyric acid)…
AIA được tổng hợp từ tryptophan hay idole, trong vùng đỉnh chồi trong sơ khởi lá, trong lá non. Trong mô thực vật, auxin tồn tại ở dạng tự do và liên kết với một acid amin. Dạng tự do gây ra hoạt tính, dạng liên kết không có hoạt tính nhưng dễ dàng phóng thích auxin theo con đường enzim. Liên kết cũng là một trong những cách điều hòa hàm lượng auxin trong tế bào (Bùi Trang Việt, 2000).
Ở mức tế bào, auxin kích thích sự hoạt động của bơm proton qua màng nguyên sinh chất, làm gia tăng nồng độ H+ ở khoảng gian bào, pH giảm. Sự giảm pH làm cầu nối extensin, hemicellulose, các hợp chất peptit và cellulose bị phá vỡ, Ca2+
nối liền các chuỗi hợp chất peptit bị loại đi, một số enzime thủy giải được hoạt hóa giúp cho sự tổng hợp hay phân hủy polysaccharid và protein được thực hiện, giúp duy trì sự lỏng lẻo của vách tế bào.
Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp mRNA liên quan trong sự tổng hợp enzim chuyên biệt, bao gồm enzim tạo tiền chất của cellulose và các hợp chất của vách (Bùi Trang Việt, 2000).
hợp với các chất điều hòa tăng trưởng khác. Cảm ứng tạo mô sẹo ở Ananas
comosus Merr cần môi trường MS có bổ sung ANA 1mg/l (Benega, 1995) hay
picloram 3mg/l (Sripaoraya và cộng sự, 2003). Để cảm ứng tạo rễ ở Brassia
rapai, ANA được xem là một auxin có hiệu quả, nhưng ở Lilium longiflorum
Thunb. thì sự tạo rễ tốt nhất được thấy ở môi trường AIA 2mg/l (Phan Hoàng Anh
và cộng sự, 2005). Ở cây dứa Ananas comosus Merr rễ lại không hình thành
trong môi trường chứa ANA 1-2,5 mg/l mà phải là môi trường AIB 1,5-2,5 mg/l (Akbar và cộng sự, 2003) hay cần sự kết hợp giữa AIB và ANA hay AIA ở các
nồng độ khác nhau như AIA 1,14 µM và AIB 2,46 µM ở Zizyphus jujuba Mill.
(Gu và cộng sự, 2005). Có thể nói, tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bào còn phụ thuộc vào loài, nồng độ và sự hiện diện của các chất điều hòa tăng trưởng khác.
Tuy nhiên, hiệu ứng của auxin giảm sau một nồng độ tối hảo và trở nên độc ở nồng độ qua cao (Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin được sinh ra từ phần non của cơ thể thực vật, chủ yếu ở chồi ngọn. Sau
khi cắt bỏ chồi ngọn, có sự giảm ngay nồng độ AIA sau 4h ở cây dứa Ananas
comosus Merr và sự phân chia tế bào ở lá mầm của nách (Beatriz và cộng sự,
2003) hay sau 8h ở Betula pendula (Galoch và cộng sự, 1998) nguyên nhân là do
sự di chuyển hữu cực của auxin chịu trách nhiệm duy trì ưu thế ngọn. Chatfield
(2000) nghiên cứu trên khúc cắt cô lập của Arabidopsis, chứng minh rằng khi tác
động lên ngọn làm ức chế vận chuyển auxin, đã góp phần đẩy mạnh sự phát triển của chồi bên. Sau 16h nuôi cấy nồng độ AIA lại tăng lên chứng minh cho sự thành lập một lượng auxin mới duy trì ưu thế ngọn của chồi mới. Bên cạnh đó, vẫn có mối liên quan với cytokinin và còn nhiều vẫn đề mà đến nay vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn.
Sự tập trung auxin nồng độ cao ở ngọn và sự di chuyển hữu cực của auxin cũng sẽ dẫn đến sự hình thành cơ quan hoa theo trục dọc. Có thể nói, sự di chuyển hữu cực của auxin có vai trò quan trọng không chỉ trong giai đoạn dinh dưỡng để tạo chồi (nhánh và lá) mà còn trong sự ra hoa ở dâu tây và ở dứa (Hou và cộng sư,ï 2005 trong Tr n Th Anh Thoa, 2007).
1.3.2. Cytokinin
Kinetin là chất đầu tiên được khám phá bởi Skoog và Miller vào 1955. Đến 1963, Letham ly trích được cytokinin từ phôi nhũ bắp non có trong phần lớn thực vật và một vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn 10 lần, đó là zeatin. Trong nuôi cấy mô, người ta thường dùng zeatin và một số hợp chất tổng hợp như kinetin và BAP (benzilaminopurin hay benzil adenin). Nước dừa (phần lỏng) cũng được chứng minh là nguồn cung cấp zeatin (Bùi Trang Việt, 2000).
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật. Từ rễ, cytokinin được di chuyển trong mạch mộc để tới chồi. Tuy nhiên, các chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000).
Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và tự do, chúng bị phân hủy bằng con đường enzime, tạo sản phẩm cuối cùng là urê.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra, các chất này còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của một số enzim. Cơ chế tác dụng của cytokinin ở mức phân tử thể hiện ở tác động tương hổ của cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện tổng hợp DNA.
hoocmon khác để điều hoà các đáp ứng khác nhau ở thực vật bao gồm sự nảy mầm, sự tạo chồi, làm mất ưu tính ngọn, tăng rộng lá, sinh sản và lão suy. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (tăng trưởng củ) cũng như kích thích sự gia tăng tế bào lá trưởng thành (Bùi Trang Việt, 2000).
Lakshmanan và cộng sự (1997) phân tích khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ
mẫu lá ở Garcinia mangostana cho thấy rằng xứ lý BA là cần thiết ở giai đoạn
đầu tiên cho tế bào đi vào con đường phát sinh hình thái. BA ngoại sinh hoạt động trực tiếp lên tế bào thực vật, điều khiển sự tích lũy các hợp chất cytokinin