đặc điểm lâm sàng của các chủng nấm candida sp. phân lập được trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo tại bệnh viện phong và da liễu tỉnh sơn la

Với đặcđiểm là một tỉnh miền núi hầu hết là các dân tộc thiểu số có trình độ dân tríthấp, còn nhiều hủ tục lạc hậu, mê tín dị đoan, việc quan tâm đến sức khoẻ nóichung còn nhiều hạn chế

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng và ẩm là những yếu

tố thuận lợi cho nấm phát triển và gây bệnh ở khắp các bộ phận trên cơ thểtrong đó có viêm âm hộ, âm đạo Viêm âm hộ, âm đạo do bất kỳ căn nguyênnào là bệnh phụ khoa phổ biến trên toàn thế giới và được xếp vào các nhiễmkhuẩn lây truyền qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infection - STI).Các bệnh STI có xu hướng ngày càng gia tăng nhất là ở các nước đang pháttriển, nó vừa là bạn đồng hành, vừa là chỉ điểm của đại dịch HIV/AIDS Theo

Tổ chức y tế thế giới, có khoảng 340 triệu người mắc STI trên thế giới, riêngvùng Đông Nam Á có khoảng 150,5 triệu người mắc các bệnh này Hiện naySTI đã trở thành vấn đề y tế cộng đồng mang tính toàn cầu, triệu chứng điểnhình nhất là tiết dịch ở âm đạo, niệu đạo nhiều hơn bình thường và được chẩnđoán có hội chứng tiết dịch âm đạo, niệu đạo Nguyên nhân gây bệnh có thểdo: vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm Trong đó căn nguyên do nấm

Candida chiếm tỷ lệ tương đối cao từ 12-26% 29], [33], [42].

Khi nhiễm nấm Candida âm đạo người bệnh có cảm giác ngứa ngáy,

bứt rứt khó chịu, nếu viêm nhiễm nặng có thể đau đớn ảnh hưởng đến sứckhoẻ, tinh thần thậm chí cảm thấy chán nản, tự ti, mất hứng thú trong quan hệtình dục Nếu bệnh tái phát nhiều, không điều trị đúng và kịp thời bệnh sẽ tiếntriển nặng và có thể gây nhiều biến chứng như: viêm tử cung, ống dẫn trứng,viêm buồng trứng, có thể dẫn đến vô sinh

Vì vậy việc tìm hiểu tình hình mắc bệnh, việc chẩn đoán sàng lọc tạicộng đồng, những yếu tố liên quan đến căn nguyên lây bệnh nhằm phát hiệnđiều trị sớm để giảm các biến chứng là hết sức cần thiết

Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặcđiểm lâm sàng, các yếu tố có liên quan đến tỷ lệ nhiễm nấm âm đạo nhưng ở

Sơn La cho tới nay chưa có đề tài nào nghiên cứu về vấn đề này Với đặcđiểm là một tỉnh miền núi hầu hết là các dân tộc thiểu số có trình độ dân tríthấp, còn nhiều hủ tục lạc hậu, mê tín dị đoan, việc quan tâm đến sức khoẻ nóichung còn nhiều hạn chế nhất là các bệnh mang tính xã hội như các nhiễmkhuẩn lây truyền qua đường tình dục dễ gây cho người bệnh mặc cảm, lo ngạiđến danh dự và hạnh phúc gia đình nên việc nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng,các dấu hiệu giúp cho chẩn đoán sớm, lựa chọn thuốc điều trị đạt hiệu quảcao, qua đó làm giảm các biến chứng viêm cổ tử cung, viêm vòi trứng, đặcbiệt là vô sinh sẽ là việc làm rất có giá trị trong phòng chống các bệnh lâytruyền qua đường tình dục.

Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Đặc điểm lâm sàng

của các chủng nấm Candida sp phân lập được trên bệnh nhân có hội

chứng tiết dịch âm đạo tại Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La" Đề

tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Văn Hưng, Bộmôn Da liễu - Trường Đại học Y Hà Nội; TS Dương Minh Lam, Trường Đạihọc Sư phạm Hà Nội

2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm nấm Candida

trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo

- Định danh những chủng nấm Candida của bệnh nhân đến khám tại

Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013 tại Bệnh việnPhong và Da liễu tỉnh Sơn La và Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Da liễu Trungương Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

- Thu thập thông tin về một số yếu tố ảnh hưởng đến tình hình nhiễm

nấm Candida âm đạo.

- Xét nghiệm trực tiếp dịch âm đạo tìm nấm Candida spp.

- Nuôi cấy nấm trên môi trường Sabouraud + chloramphenicol

- Đánh giá đặc điểm (lâm sàng, hình thái khuẩn lạc, tế bào, ống mầm,

chromagar, auxocolor) một số chủng nấm Candida của bệnh nhân viêm âm

đạo tại Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn từ tháng 10/2012 đến tháng6/2013

- Định loại nấm Candida spp.

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: Tất cả các bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đếnkhám tại Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La có biểu hiện lâm sàng vàxét nghiệm trực tiếp tìm nấm dương tính từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013

- Phạm vi nghiên cứu: Tỉnh Sơn La

4 Những đóng góp cơ bản của luận văn

- Lần đầu tiên đánh giá được mức độ nhiễm, các yếu tố ảnh hưởng tới tỉ

lệ nhiễm bệnh nấm Candida spp ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo

đến khám tại Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La

- Nuôi cấy và định loại được 5 loài nấm Candida gây bệnh viêm âmđạo trên địa bàn nghiên cứu

- Kết quả nghiên cứu góp phần tăng cường biện pháp giáo dục sức khỏe sinhsản và tuyên truyền an toàn tình dục

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về nấm Candida

Candida là một loại nấm men thuộc bộ Saccharomycetales, lớp

Saccharomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota) [54] Ngày nay có khoảng

377 loài Candida được công nhận, trong đó có khoảng 17 loài gây bệnh [55] Candida là một loại nấm tồn tại phổ biến trong thiên nhiên, sống ký sinh ở người và sinh vật nhưng chỉ có Candida albicans được xem là thường xuyên

gây bệnh còn đại đa số các loài khác sống hoại sinh và gây bệnh cơ hội

Candida có những đặc điểm sau:

- Tồn tại ở trạng thái đơn bào, thường là tế bào hình tròn hay hình trái

xoan Kích thước nấm Candida thường lớn gấp 10 lần vi khuẩn, C albicans

quan sát dưới kính hiển vi thường có dạng hình trái xoan, thành dày, nẩy chồidạng hẹp và thường kèm dạng sợi mảnh, giả sợi

Hình 1: Hình ảnh C albicans

Tuy nhiên, muốn xác định chắc chắn loài phải làm thêm xét nghiệmnuôi cấy, phân lập bằng các kỹ thuật hiện đại

- Candida sinh sản vô tính theo một quá trình gọi là nẩy chồi Một chồi

nhỏ thường mọc lên ở phần cực của tế bào nấm, chồi này phình to ra và hìnhthành một tế bào con, cuối cùng tách ra khỏi tế bào mẹ Ở một vài loài nấm

Candida, các tế bào chồi này kéo dài ra, có loại tế bào nấm Candida dính vào

nhau tạo thành chồi dạng giả sợi Ngoài ra Candida sinh sản vô tính bằng bào

tử áo hay bào tử màng dày thường mọc ở các đỉnh giả sợi

- Thành tế bào nấm thường có chứa chitin và mamnan

- Nhiều loại có khả năng thích nghi với môi trường đường cao

1.2 Nấm Candida gây bệnh ở người

Trong cuốn “Of the Epidemics” được dịch bởi Francis Adams,

Hippocrates đã miêu tả nấm Candida miệng (khoảng năm 400 trước công

nguyên) là “triệu chứng loét niêm mạc miệng” Năm 1665, Sammuel Pepys

đã miêu tả bệnh tưa lưỡi, ngày nay được biết là do C albicans gây ra, ông

viết “bệnh nhân bị sốt, tưa lưỡi và nấc”, duy trì mãi một quan điểm rằng tưalưỡi xuất phát từ vật chủ [47] Những nhà nấm học chấp nhận điều này tới tậnnhững năm đầu 1900 khi mà Castellani trích dẫn những báo cáo trước đây vềtưa lưỡi là “những dịch tiết mang bệnh của niêm mạc miệng” [36]

Tuy nhiên, một số bác sỹ và một số nhà nấm học lại tin rằng một tácnhân lây nhiễm nào đó gây tưa lưỡi Năm 1771, Rosen von Rosenstein xácđịnh một dạng nấm xâm lấn Năm 1839, Langenbeck đã có những ghi nhậnđầu tiên về nấm ở một bệnh nhân sốt thương hàn Nấm hầu họng và thực quản

có màng giả được tìm thấy khi giải phẫu tử thi “Dưới kính hiển vi phóng đại,các lớp màng giả chứa rất nhiều nấm” Ông miêu tả chi tiết những thứ màngày nay người ta gọi là sợi nấm có vách ngăn, giả sợi và bào tử nảy chồi(pseudohyphae và blastoconidia) Nhưng ông lại cho rằng đây là vi khuẩnthương hàn chứ không phải là nấm [47] Năm 1844, J H Bennett quan sátđược 1 loại nấm tương tự ở đờm và phổi của một bệnh nhân bị tràn khí màngphổi và chỉ trích kết luận của Langenbeck Mô tả hình thái của ông về cơ bảngiống với của Langenbeck Bennett kết luận rằng bệnh là “biểu thị của sự suygiảm miễn dịch và sự suy yếu các chức năng dinh dưỡng của vật chủ” [36].Hai năm sau, Fredrik Theodor Berg kết luận rằng tưa lưỡi trẻ em là do nấm

và lây truyền có thể là do dùng chung những chai sữa cho trẻ em bú Sau phát

hiện này, hai loại bệnh khác cũng được cho là do Candida gây ra là nhiễm Candida âm đạo và tiêu hóa

Candida ở âm đạo lần đầu tiên được Wilkinson mô tả vào năm 1849.

Vào năm 1875, Haussmann đã chứng minh rằng sinh vật gây bệnh trong

Candida đường miệng và đường âm đạo là một [48]

Khi căn nguyên đã được các nhà nấm học xác định thì cuộc tranh luậntiếp theo là xác định tác nhân gây bệnh Năm 1847, nhà nấm học danh tiếngngười Pháp, Charles Philippe Robin, đã phân loại được nấm Oidium albicans,

sử dụng chữ “albicans” (có nghĩa là “làm cho trắng, hóa trắng”) để đặt tên choloại nấm gây tưa lưỡi ở trẻ em Hill và sau đó là Martin và Jones đã phân loạinhầm Candida vào chi Monilia, một chi nấm thường phát triển ở thực vật Sau

đó các bác sỹ gọi nhầm căn nguyên gây tưa lưỡi là Monilias mặc dù các nhànấm học đã làm sáng tỏ sự khác biệt hình thái giữa nấm gây tưa lưỡi với nấmtrong chi Monilia Christine Marie Berkhout đã ghi nhận những khác biệt này,đặc biệt là khả năng lây nhiễm sang người của Candida trong luận án tiến sỹcủa bà ở đại học Utrecht năm 1923 Berkhout đã phân loại lại là chi Candida,

và hiện nay ta vẫn sử dụng tên này Candida bắt nguồn từ chữ “toga candida”trong tiếng Latin, nghĩa là áo choàng rộng màu trắng mà các nguyên lãoRoma thường mặc Và cho tới Hội nghị thực vật năm 1954, Candida albicanschính thức được đặt làm danh pháp cho loại nấm này [36].Trong các loài

Candida thì Candida albicans là loài gây bệnh chủ yếu Một số loài khác

cũng có khả năng gây bệnh với tần suất ngày càng tăng do sự sử dụng thuốc

bừa bãi như Torulopsis glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida prapsifosis…

Ở trạng thái hoại sinh, số lượng vi nấm rất ít, soi tươi các dịch sinh học

từ niêm mạc đôi khi có một vài tế bào nấm men Ở đây vi nấm giữ một thế

quân bằng với các vi khuẩn cùng sinh sống với nó Tất cả tạo thành một visinh chủng bình thường của cơ thể [3]

Trong một số điều kiện nhất định, vi nấm Candida chuyển từ trạng thái

hoại sinh sang trạng thái ký sinh gây bệnh Đặc trưng của trạng thái ký sinh là

số lượng vi nấm tăng lên rất nhiều, có sự thành lập các sợi nấm giả(pseudohyphae) cho phép vi nấm len lỏi giữa các tế bào ký chủ và xâm nhậpsâu hơn [10]

1.2.1 Tính chất gây bệnh

Ở người bình thường có thể tìm thấy Candida sống ký sinh trong họng,

bộ phận tiêu hoá, âm đạo mà không gây bệnh Trên da hiếm khi thấy Candida ngoại trừ vùng nếp kẽ Candida thực sự gây bệnh cho người khi cơ thể giảm

sức đề kháng, suy giảm miễn dịch và có yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhập của

nấm [11] Ví dụ: Trong âm hộ C albicans luôn luôn bị kiềm chế bởi vi khuẩn Lactobacillus axitophilus Vi khuẩn này tiết axit lactic làm giảm pH, khi

người bệnh dùng kháng sinh diệt vi khuẩn nhưng không diệt nấm sẽ làm giảm

nhanh chóng L axitophilus tạo điều kiện để C albicans gây bệnh Một số tác giả khác chứng minh và nhận thấy các chủng Candida khác nhau thì có sự

khác nhau về độc tính gây bệnh Nguyên nhân quan trọng ban đầu là sự kếtdính của nấm vào tế bào biểu mô, rồi xâm nhập vào trong tế bào sừng do nấm

men Candida tạo ra một loại enzyme gây phân huỷ protein đặc hiệu, ví dụ như Candida albicans tồn tại và gây bệnh là nhờ có các men như protease,

phospholipase, lipophospholipase Ngoài ra nó còn liên quan đến khả nănghình thành các thụ thể (receptors) đối với steroide và đối với sắt làsiderophores [4], [5], [1], [58]

Sự phát triển của nấm Candida gây đáp ứng mạnh mẽ là biểu hiện lâm sàng của bệnh Đáp ứng miễn dịch trong bệnh nấm Candida là đáp ứng miễn

dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào suy giảm

ở bệnh nhân bị bệnh nấm Candida da, niêm mạc mạn tính [32].

Candida có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan, tổ chức Tổn thương có thể

nông trên da, niêm mạc miệng, lưỡi, họng, hầu, niêm mạc sinh dục nam, nữ, ởmóng, ở tóc nhưng cũng có thể xâm nhập vào sâu trong phủ tạng như: tim,

phổi, gây nhiễm Candida hệ thống và có thể gây tử vong [11], [24].

Gần đây người ta thấy nhiễm nấm Candida hệ thống có chiều hướng

tăng lên Theo Đỗ Thị Nhuận ở Mỹ khoảng 25% số bệnh nhân tử vong do một

loại nấm Candida trong tổng số các bệnh nhân tử vong do nấm [26].

1.2.2 Các bệnh do Candida gây ra

1.2.2.1 Nhiễm Candida ở niêm mạc

+ Nhiễm nấm Candida ở niêm mạc miệng, hầu

Người ta thấy có tới 30 - 50% người khoẻ mạnh bị nhiễm nấm Candida

niêm mạc miệng Bệnh nhân đái tháo đường, trẻ vị thành niên dùng steroid xịt

điều trị hen phế quản, trẻ bú mẹ cũng hay bị nhiễm nấm Candida miệng Nhiễm nấm Candida hầu họng có thể là một trong những dấu hiệu chỉ điểm

của suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/ AIDS [49]

Biểu hiện lâm sàng của nhiễm nấm Candida miệng, hầu là những mảng

đốm trắng trên bề mặt lưỡi hoặc ở niêm mạc má, lợi Những mảng trắng này

có thể bong để lại nền trầy xước, đỏ, rớm dịch hoặc chảy máu [11]

+ Nhiễm nấm Candida ở da, móng

Nhiễm nấm Candida thường gặp ở các kẽ, vùng da bị ẩm ướt như:

nách, bẹn, nếp vú, rãnh liên mông, nếp lằn mông trên những người béo phì,

bệnh nhân đái tháo đường Tổn thương viêm kẽ do Candida thường có màu

đỏ tươi hoặc hơi xám, trên bề mặt dát đỏ có vẩy nhỏ, rìa tổn thương có nhữngđám da đỏ và mụn nước tiến triển [11]

Candida còn gây viêm móng, xung quanh móng Bệnh thường gặp ở

những người phải tiếp xúc nhiều với nước, người chế biến rau quả, công nhân

xí nghiệp chế biến thức ăn (đậu phụ) [11]

+ Nấm Candida ở da đầu

Hình thái này ít gặp Trên da đầu có những đám viêm chân tóc có mủ,

trong mủ tìm thấy tụ cầu và nấm Candida Tóc rụng không mọc trở lại, sợi

tóc không bị tổn thương, không tìm thấy bào tử nấm và sợi nấm trong sợi tóc,

viêm chân tóc do Candida dễ nhầm với viêm chân tóc do Favus [11]

1.2.2.2 Viêm đường sinh dục do Candida

+ Viêm quy đầu do Candida

Hay gặp ở bệnh nhân bị đái tháo đường hoặc những người có vợ bị

viêm âm hộ, âm đạo do Candida Trên lâm sàng thấy xuất hiện các vết trợt ở

quy đầu và da bao quy đầu, có nhiều vết nứt rạn và có nhiều chất nhày màutrắng Vết trợt có màu đỏ tươi, giới hạn rõ rệt, xung quanh có bờ, bệnh nhânthường bị ngứa, có khi ngứa dữ dội, bỏng rát quy đầu [11]

+ Viêm niệu đạo do Candida

Viêm niệu đạo cấp do Candida có triệu chứng lâm sàng gần giống như

viêm niệu đạo do lậu Niệu đạo xuất tiết nhiều, có mủ, đôi khi có máu, đái rắt,

đái buốt Viêm niệu đạo cấp do Candida ít gặp hơn so với viêm niệu đạo cấp

do lậu, do Chlamydia trachomatis [11].

Thông thường là viêm niệu đạo bán cấp Bệnh nhân có cảm giác nóngbỏng dọc niệu đạo Ngứa ở miệng sáo, nước tiểu có ít sợi bông, nhất là ở cốcđầu nếu làm nghiệm pháp 2 cốc Thăm khám tiền liệt tuyến thấy tiền liệttuyến có nhạy cảm Trường hợp đặc biệt tổn thương có thể lan đến tiền liệttuyến, túi tinh, mào tinh hoàn làm cho hình ảnh lâm sàng càng thêm phức tạp

1.2.2.3 Nhiễm nấm Candida phủ tạng

+ Nhiễm nấm Candida ở ống tiêu hoá

Bệnh nấm Candida ở thực quản có thể là một trong những biểu hiện

đầu tiên của bệnh nhân HIV/AIDS Khoảng 10% bệnh nhân AIDS hoặc bị các

bệnh suy giảm miễn dịch khác có nhiễm Candida thực quản Biểu hiện của nhiễm Candida thực quản thường thấy là khó nuốt, sút cân, suy dinh dưỡng

và hội chứng suy mòn, khó điều trị, đôi khi tử vong do suy dinh dưỡng [49]

Nấm Candida đường ruột gây tiêu chảy kéo dài.

+ Nhiễm nấm Candida đường hô hấp

Candida có thể gây viêm thanh quản, viêm nắp thanh quản và tắc

nghẽn khí quản, viêm phổi hoặc phế quản phổi Việc chẩn đoán xác định phảicăn cứ vào sinh thiết nhu mô phổi và cấy nước rửa thanh khí phế quản Tuy

nhiên cần phải nuôi cấy để phân biệt với Paracocidimycosse [10].

+ Nhiễm nấm Candida ở tim

Candida có thể gây viêm màng ngoài tim nhất là sau mổ tim Viêm nội tâm mạc do Candida chủ yếu xẩy ra sau phẫu thuật tim hở kéo dài, trên bệnh

nhân đã điều trị bằng kháng sinh hoặc truyền dịch dài ngày qua vi ống(catheter) Ngoài ra những người có van tim nhân tạo hoặc nghiện ma túy

cũng là yếu tố thuận lợi cho viêm nội mạc do Candida [10].

+ Nhiễm nấm Candida máu

Bệnh cảnh lâm sàng này chủ yếu gặp ở bệnh nhân bị ác tính, nhất làleucose hoặc u lympho Hogdkin hoặc không Hogdkin.Những thủ thuật mổ xẻphức tạp kéo dài, bị bỏng rộng, nghiện ma tuý cũng là những yếu tố thuận lợi

cho nhiễm Candida máu

Candida còn có thể xâm nhập vào thần kinh trung ương, mọi bộ phận

của mắt như: nhãn cầu, kết mạc gây mù loà vĩnh viễn [10]

1.3 Nhiễm nấm Candida âm đạo

1.3.1.Đặc điểm sinh lý âm đạo bình thường

* Khí hư: là chất dịch không có máu chảy ra từ âm đạo có thể là chất tiết

sinh lý hoặc được tạo ra do cơ quan sinh dục đáp ứng với sự kích thích haynhiễm trùng Bình thường ở âm đạo có dịch trắng như sữa, trong và hơi đặc,lượng ít có nguồn gốc từ tuyến Bartholin ở âm hộ, từ các tuyến và nút nhầy ở

cổ tử cung, từ biểu mô âm đạo bong ra, không chảy ra ngoài âm hộ, khôngảnh hưởng đến sinh hoạt của người phụ nữ Khi chất dịch sinh lý này thay đổi

về tỷ lệ và số lượng vi khuẩn, tiết ra nhiều, chảy ra ngoài âm hộ làm chongười phụ nữ khó chịu phải chú ý tới là bất thường, là khí hư bệnh lý [4],[18], [24], [43]

Tùy theo nguyên nhân mà khí hư có tính chất khác nhau Có 3 loại khí hư:

- Khí hư trong dính như lòng trắng trứng, có khi loãng như nước, xétnghiệm khí hư sẽ không thấy vi khuẩn, bạch cầu, chỉ có tế bào biểu mô Khí

hư này từ niêm mạc tử cung, do u xơ tử cung, polyp cổ tử cung hoặc ở ngườicường estrogen

- Khí hư trắng như váng sữa, xét nghiệm không có bạch cầu và vi khuẩn.Nguyên nhân do rối loạn thần kinh thực vật ở bệnh nhân hay lo lắng, hoặc tửcung bị sung huyết

- Khí hư đục là triệu chứng phổ biến của viêm sinh dục Khí hư đục,loãng hoặc đặc do lẫn mủ Nhiễm khuẩn càng nặng thì khí hư càng nhiều,màu sắc vàng xanh, mùi hôi, tanh [30], [31]

* Biểu mô âm đạo: được cấu tạo bởi các tế bào gai đáp ứng với sự thay

đổi nồng độ estrogen và progesterone Các tế bào lớp nông là loại tế bào chủyếu của đường sinh dục sẽ vượt trội khi có sự kích thích của Estrogen Các tếbào lớp trung gian sẽ vượt trội trong giai đoạn hoàng thể khi có sự kích thíchcủa Progesteron Các tế bào cận đáy sẽ vượt trội khi không có sự hiện diện

của các hormone, một tình trạng như ở phụ nữ mãn kinh không điều trịhormon thay thế Estrogen làm dày lớp thượng bì âm đạo, làm tăng lượngglycogen có trong tế bào thượng bì Và do đó nó ảnh hưởng đến pH của âmđạo, từ đó ảnh hưởng đến hệ sinh thái vi khuẩn ở âm đạo [28], [39].

* Môi trường âm đạo: hệ vi sinh vật trong môi trường âm đạo đóng vai

trò rất quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của bệnh viêm nhiễm đường sinhdục Hệ vi sinh vật này gồm chủ yếu là vi khuẩn và có thể có nấm men Trong

đó chiếm ưu thế là các chủng Lactobacillus Đó là vi khuẩn có lợi, tạo ra sự

bảo vệ âm đạo bằng cách sinh ra hydrogen peroxide, chất diệt khuẩn và axitlactic làm cho pH thấp, ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.Khi hệ

vi sinh vật bị thay đổi thì viêm âm đạo dễ xảy ra [21], [37], [38]

* Độ pH của âm đạo: pH trung bình của âm đạo phụ thuộc vào tuổi, tình

trạng nội tiết sinh dục Ở trẻ em chưa hành kinh pH là 7, ở phụ nữ trong độtuổi hoạt động sinh đẻ pH dao động trong khoảng 4-5 và ở phụ nữ mãn kinh

pH thay đổi từ 6-7 pH âm đạo tạo điều kiện thuận lợi cho sự cân bằng của hệsinh thái vi sinh vật trong âm đạo Sự thay đổi pH âm đạo là điều kiện cho

viêm âm đạo xảy ra Biến động của nhóm Lactobacillus ảnh hưởng đáng kể

đến pH âm đạo và tình trạng viêm nhiễm âm đạo [5], [39], [34]

1.3.2 Tác nhân gây bệnh

Bình thường trong cơ thể người, nấm có thể sống trong âm đạo nhiềuphụ nữ mà không có biểu hiện lâm sàng, còn gọi là nấm hoại sinh Sự pháttriển và gây bệnh của nấm chịu sự kìm chế của các vi khuẩn khác sống trong

âm đạo và phụ thuộc vào độ cân bằng môi trường âm đạo và hệ thống miễndịch của cơ thể Khi một yếu tố nào đó phá vỡ sự bình ổn môi trường này thì

nấm sẽ phát triển mạnh và gây bệnh (Từ Candida hoại sinh thành Candida

gây bệnh) [20]

Khoảng 50% người mang Candida sẽ trở thành bệnh có triệu chứng Khi Candida gây bệnh ở âm đạo thì gọi là nhiễm nấm Candida âm đạo Khoảng 85% các trường hợp nhiễm nấm âm đạo là do chủng Candida albicans gây ra, 15% còn lại là do các chủng C glabrata Ngoài ra các chủng C torulosis, C krusei cũng có thể gây viêm âm hộ, âm đạo nhưng ít gặp hơn [41], [45].

Người ta biết rằng nấm Candida chỉ phát triển trên vật chủ bị suy giảm sức đề kháng tại chỗ hoặc toàn thân Candida sp tồn tại được trong môi

trường âm đạo đầu tiên chúng phải bám dính được vào tế bào biểu mô âmđạo, sau đó xâm nhập vào tế bào biểu mô nhờ enzyme gây phân hủy protein

đặc hiệu do Candida tiết ra Hàng rào biểu mô bị tổn thương, viêm loét càng nhiều thì Candida càng sinh sôi, phát triển mạnh và khi đó sẽ xuất hiện những

triệu chứng bệnh và được chẩn đoán là nhiễm bệnh nấm âm đạo [40], [53]

Nhiều tác giả đã nhận thấy nhiễm nấm Candida thường gặp ở những

người dùng kháng sinh kéo dài hoặc dùng cocticoid tại chỗ hoặc toàn thân, trịliệu hormon, thuốc gây giảm miễn dịch trung gian tế bào Những người thiếuhụt tế bào lympho T (như bệnh nhân HIV/AIDS), đái tháo đường, làm việctrong điều kiện phải ngâm nước nhiều dễ bị nhiễm nấm nông (trong đó có

nấm Candida) nặng, lan toả và khó điều trị [49], [56].

1.3.3 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng chủ yếu là ngứa, rát, da âm hộ đỏ có thể phù nề, không kẽmép có bợt da trên phủ một lớp chất như kem màu trắng Bên dưới là tổnthương đỏ tươi hoặc đỏ sẫm, bờ không đều, nham nhở, xung quanh có viền vẩy

da Âm đạo có nhiều khí hư màu trắng, bột, thường không có mùi hôi Nếu cómùi hôi thường là nhiễm trùng phối hợp với viêm âm đạo do vi khuẩn, lậu…

1.3.4 Các yếu tố liên quan

+ pH âm đạo

Niêm mạc âm đạo có khả năng tự bảo vệ để chống lại sự xâm nhập của

vi khuẩn do môi trường âm đạo có tính axit pH âm đạo được duy trì nhờ trựckhuẩn sinh axit lactic yếm khí có sẵn trong môi trường âm đạo Các trựckhuẩn này sử dụng glycogen từ tế bào biểu mô của âm đạo và sinh ra axitlactic khiến cho môi trường âm đạo có tính axit Nồng độ glycogen dự trữchịu ảnh hưởng của Estrogen Chính vì vậy những rối loạn nội tiết tố sinh dụcnhư tăng hoặc giảm Estrogen đều ảnh hưởng đến pH âm đạo Nhiều nghiêncứu cho rằng bình thường pH âm đạo nằm trong khoảng 4,0-4,5 Khi phụ nữmãn kinh hoặc những bệnh nhân bị viêm âm đạo, pH đều tăng trên 4,5 [2]

+ Do dùng kháng sinh

Dùng kháng sinh kéo dài cũng là một yếu tố thuận lợi làm phát sinhviêm âm đạo do nấm, nhất là kháng sinh phổ rộng như: Cephalosporin,tetracyclin, ampicylin Những kháng sinh này làm giảm lượng vi khuẩn

Lactobaccilus bảo vệ âm đạo Nấm Candida không bị kìm hãm sẽ có cơ hội

phát triển và trở nên gây bệnh [8]

+ Đái tháo đường

Đối với bệnh nhân đái tháo đường song song với tăng đường huyết thìđường ở dịch âm đạo cũng tăng Chính sự tăng đường ở dịch âm đạo đã tạo điều

kiện cho nấm Candida nhân lên và gây nên các triệu chứng lâm sàng của bệnh.

+ Ảnh hưởng nội tiết tố sinh dục

- Đang có thai

Trong thời kỳ có thai, nồng độ hormon tăng, nhất là vào tháng thứ 7 vàthứ 9 Tăng hormon làm cho môi truờng axit của âm đạo thay đổi và glycogencủa tế bào tăng lên thuận lợi cho nấm phát triển

- Dùng thuốc tránh thai

Những loại thuốc có nồng độ Estrogen cao, có tác dụng như của nội tiết

tố trong thời kỳ thai nghén Vì thế khi sử dụng thuốc tránh thai sẽ tạo điềukiện cho nấm phát triển Để khắc phục tình trạng này , ngày nay người ta sửdụng thuốc tránh thai có nồng độ Estrogen thấp [18]

- Chu kỳ kinh nguyệt

Nấm phát triển liên tục trong giai đoạn trước kỳ kinh Trên thực tế lâmsàng có rất nhiều triệu chứng viêm âm đạo do nấm xuất hiện thường xuyênvào tuần thứ 3 và 4 của kỳ kinh

Có lẽ sự thay đổi hormon của vòng kinh đã ảnh hưởng đến sự phát triểncủa nấm [18]

+ Các yếu tố khác [8]

- Bạn tình bị nhiễm Candida: Nếu bạn tình bị nhiễm nấm Candida thì Candida cũng sẽ lây truyền như bất cứ một bệnh lây truyền qua đường tình

dục nào khác

- Tổn thương lớp nhầy bảo vệ âm hộ, âm đạo: Dùng hoá chất khử mùi,

xà phòng thơm, những chất sát trùng mạnh nếu vào âm đạo sẽ làm tổn thươnglớp nhày bảo vệ âm hộ, âm đạo Đây cũng là điều kiện thuận lợi để nấm

Candida xâm nhập vào cơ thể.

- Mặc quần lót chật bằng nilon cũng tạo điều kiện cho nấm phát triển

do tăng mồ hôi, làm môi trường âm đạo ấm và ẩm

- Nhiễm khuẩn chéo như nấm Candida ở những vùng khác của cơ thể

như ở: móng tay, miệng, ruột có thể lây sang âm đạo

+ Do vô trùng không tốt: một số thủ thuật y tế không tiệt trùng như nạohút thai, đặt vòng hoặc khám âm hộ, âm đạo không đeo găng.

+ Từ môi trường sống: sử dụng nước tắm ao hồ, dùng chung đồ lót, làmviệc trong môi trường ẩm ướt, kém vệ sinh (lao động ngâm mình dưới nước

bẩn) cũng là những yếu tố làm dễ mắc bệnh nhiễm nấm Candida âm đạo.

Khi có nguồn lây kèm theo các yếu tố thuận lợi như mô tả ở trên thì dễtạo điều kiện dẫn đến nấm âm đạo phát triển [24]

1.4 Tình hình nghiên cứu nhiễm nấm Candida âm đạo

1.4.1 Trên thế giới

Nhiễm nấm Candida có thể gặp ở mọi lứa tuổi, mọi chủng tộc và ở khắp nơi trên thế giới Đã có nhiều tác giả nghiên cứu về nấm Candida âm

đạo và thấy rằng có tới hai phần ba số phụ nữ ít nhất một lần trong đời bị

nhiễm nấm Candida, khoảng 40 - 45% bị từ hai lần trở lên và có sự kết hợp

nấm âm hộ với nấm âm đạo [57] Ở Jamaica, Kamara và cs (2000) đã đánh

giá 269 phụ nữ mang thai thấy tỷ lệ nhiễm nấm Candida âm đạo là 30,7%

[46] Còn Ashraf và cs (2001) thực hiện một nghiên cứu với mục đích xác

định mối tương quan giữa các triệu chứng với nấm Candida trong viêm âm

đạo và thấy rằng trong tổng số 262 phụ nữ có 74 trường hợp nhiễm nấm,chiếm 28,2% [35] Trong nghiên cứu của Hamad và cs (2013) ở Bệnh việnLatifa, Dubai, UAE từ 2005 đến 2011 thấy rằng tỷ lệ mắc mới Candida âmđạo có sự gia tăng từ 10.76% năm 2005 lên 17,61% năm 2011, tỷ lệ nhiễmtrung bình là 13.88% [42] Còn Akinbiyi, Watson và Feyi (2008) nghiên cứu

ở 1073 thai phụ đến khám tại bệnh viện đa khoa Barnsley, Anh cho biết tỷ lệnhiễm C albicans là 12.5% [33] Theo Catalan và cs (2000) trong viêm âm

đạo nấm Candida chiếm 30% trường hợp [40] Theo Barraco (1996), khi

khám cho 1462 bệnh nhân thì có 10% viêm âm đạo có nguyên nhân do nấm,trong đó có 13% trước 50 tuổi, 4% sau 50 tuổi [50] Pfaller, M.A và cs

(2010) lại cho chúng ta một số liệu khổng lồ nghiên cứu trên nhiều quốc gia:trong 256,882 chủng Candida phân lập được từ 142 trung tâm y tế thuộc 41nước, từ 6/1997 đến 12/2007 (24 vùng thuộc châu Á Thái Bình Dương, 16vùng thuộc Mỹ Latin, 18 vùng thuộc châu Âu, 11 vùng thuộc Châu Phi-Trung

Đông và 13 vùng thuộc Bắc Mỹ) nhận thấy tỷ lệ nhiễm C albicans là 65,3% (70.9% từ 1997-2000; 62,9% từ 2001-2004 và 65% từ 2005-2007); C glabrata là 11.3% (10.2% từ 1997-2000; 11.5% từ 2001-2004 và 11.7% từ 2005-2007); C.tropicalis là 7.2% (5.4% từ 1997-2000; 7.5% từ 2001-2004 và 8% từ 2005-2007); C inconspicua là 0.2% (0.02% từ 1997-2000; 0.2% từ 2001-2004 và 0.3% từ 2005-2007); C guilliermondii là 0,7% (0.7% từ 1997-

2000; 0.8% từ 2001-2004 và 0.6% từ 2005-2007) [52]

1.4.2 Ở Việt Nam

Có rất nhiều nghiên cứu về nấm Candida âm đạo tại các bệnh viện,

trường y dược, các cơ sở y tế và các địa phương trên cả nước Theo Nguyễn

Thị Đào ở âm hộ phụ nữ khoẻ mạnh có thể tìm thấy các chủng nấm Candida

khoảng 25-30% Đối với phụ nữ có thai tỷ lệ có thể tới 30-50% [11] Nghiêncứu của Đàm Thị Hoà tại Viện Da liễu TW (Năm 1996-1998) cho thấy tỷ lệ

nhiễm Candida âm đạo là 26,2% [15] Tác giả Dương Thị Cương tổng kết các

tài liệu thấy tỷ lệ viêm âm đạo do nấm trong khoảng từ 22-26% [9] TheoPhạm Văn Hiển - Nguyễn Duy Hưng tỷ lệ nhiễm nấm âm đạo là 17,4% trêntổng số bệnh nhân STD [13] Nguyễn Thị Thanh Huyền trong một nghiên cứu

về tình hình, nguyên nhân và đặc điểm lâm sàng của hội chứng tiết dịchđường sinh dục ở phụ nữ đến khám tại Viện Da liễu (2001-2002) thấy tỷ lệnhiễm nấm âm đạo là 24,4% trong tổng số bệnh nhân có hội chứng tiết dịch

đường sinh dục Trong đó C albicans 46%, C glabrata 22%, C tropicalis 16%, C.krusei 4%, C stellatoide 4%, C glullemondii 2%, C geotrichum 2%,

không phân loại 4% [20] Theo Lê Thanh Bình, Nguyễn Thanh Huyền [2]

trong 180 phụ nữ đến khám tại phụ khoa tại bệnh viện Phụ Sản Hải Phòng vì

ra khí hư âm đạo hoặc ngứa hoặc cả hai thì có 75 trường hợp nhiễm nấm

Candida chiếm 41,7% Theo Lê Hồng Cẩm [7] có 28 trường hợp viêm âm đạo

do nấm trong mẫu 173 phụ nữ đã lập gia đình từ 15 đến 49 tuổi tại huyện HócMôn thành phố Hồ Chí Minh năm 1999 chiếm tỷ lệ 16,18% Theo Trần Khánh

Hoàn, Lê Thúy Mùi [16] cấy dịch âm đạo cho thấy 41.2% nhiễm nấm Candida

trong tổng số mẫu 614 bệnh nhân được chẩn đoán là viêm nhiễm đường sinhdục thấp từ 1/2000 - 7/2003 tại bệnh viện 354 Theo Phạm Đình Hùng [17] có

30 trường hợp nhiễm nấm Candida trong 262 phụ nữ ở xã Hương Long- Huế

tham gia nghiên cứu từ 9/2001 đến 3/2002 chiếm tỷ lệ 11,45% Theo Nguyễn

Vũ Quốc Huy và cộng sự [19], tỷ lệ nhiễm nấm là 19,48% khi khám cho 1010phụ nữ huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế Theo Lê Lam Hương [18] trong

số 84 phụ nữ đến khám thai tại phòng khám phụ sản bệnh viện Trường Đại học

Y Khoa Huế và bệnh viện Trung Ương Huế có biểu hiện viêm đường sinh dục

dưới thì có 42 trường hợp nhiễm nấm Candida albicans chiếm 59,38% Theo

Nguyễn Thị Ngọc Khanh [21] ở phụ nữ mang thai 3 tháng cuối có 48.8 %

nhiễm nấm Candida trong tổng số 602 sản phụ đến khám tại Viện bảo vệ bà

mẹ và trẻ sơ sinh, nghiên cứu được tiến hành từ 6/1998 đến tháng 10 năm

2000 Theo Hoàng Thị Lương [24] có 65 trường hợp nhiễm Candida spp trong

180 phụ nữ đến khám tại phòng khám phụ sản - bệnh viện Trung Ương Huế từ1/6/2000 đến 30/6/2001 chiếm tỷ lệ 36,11% Theo Nguyễn Khắc Minh vàHoàng Ngọc Chương [25], nghiên cứu trên mẫu 548 phụ nữ trong độ tuổi sinh

đẻ tại huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam năm 2004 có 56 trường hợp nhiễm

Candida albicans chiếm 10,21% Trần Cẩm Vân (2010) khi nghiên cứu các

yếu tố nguy cơ và độ nhạy cảm với kháng sinh chống nấm của các chủng nấm

Candida spp ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo tại bệnh viện Da Liễu

TW thấy rằng có 21,5% nhiễm nấm Candida [29] Nhiều nghiên cứu về dịch tễ

cho thấy rằng: Candida là nguyên nhân chính của hội chứng tiết dịch đường sinh dục Ngày nay nhiễm Candida âm đạo đang ngày càng gia tăng Có nhiều

bệnh nhân bị tái phát nhiều lần, một năm có khi 4-5 đợt nhiễm bệnh Ngoàinhững yếu tố thuận lợi như: có thai, đái tháo đường, uống thuốc tránh thai cũng có giả thiết rằng do có thể thiếu hụt rõ rệt kháng thể IgG kéo dài gây nênnhiễm nấm trầm trọng [44]

1.4.3 Tại Sơn La

Theo số liệu những năm gần đây tình hình nhiễm các bệnh lây truyềnqua đường tình dục tại Phòng khám, Bệnh viện Phong và Da liễu ngày một giatăng (số liệu báo cáo hàng năm của bệnh viện) Trong đó số bệnh nhân có biểu

hiện lâm sàng của nấm Candida chiếm tỷ lệ không nhỏ, ước tính khoảng 20%.

1.5 Một vài đặc điểm về khu vực nghiên cứu

Sơn La là một tỉnh miền núi có 11 huyện, thành phố và 204 xã,phường, thị trấn Dân số trên 1.132.000 người, gồm 12 dân tộc với 82% làđồng bào dân tộc thiểu số (trong đó dân tộc Thái chiếm 54,76%, dân tộc Kinh17,43%, dân tộc Mông 13%, dân tộc Mường 8,15%, Xinh mun 1,89%, Dao1,82%, dân tộc Khơ mú 1,13%, dân tộc La Ha 0,61% và một số dân tộckhác, tỉnh có đường biên giới dài 250km với nước Cộng hoà Dân chủ Nhândân Lào

Tuy đời sống kinh tế văn hoá, xã hội đã phát triển và đạt được nhiềuthành tựu quan trọng nhưng vẫn còn một bộ phận không nhỏ nhân dân ở vùngsâu, vùng xa, vùng cao biên giới còn gặp nhiều khó khăn (Tỷ lệ hộ nghèo cònkhoảng 27%), trình độ dân trí thấp, đời sống sinh hoạt và tiếp cận các dịnh vụphúc lợi xã hội còn nhiều hạn chế, đặc biệt là các dịch vụ về y tế Đến naytoàn tỉnh mới có 78 xã có trạm y tế đạt chuẩn quốc gia; số giường bệnh trên 1vạn dân là 17,54 giường; số xã có bác sỹ là 147 xã, số bác sỹ trên 1 vạn dân là5,3 người; tỷ lệ dân số mắc các bệnh xã hội 3,8‰ Do điều kiện còn nhiều

hạn chế nên các kỹ thuật cận lâm sàng để chẩn đoán xác định bệnh chưa đượcthực hiện tại các trạm y tế Bên cạnh đó công tác bảo vệ, chăm sóc sức khoẻnhân dân của tỉnh cũng đối mặt với nhiều khó khăn, thách thức do một số đặcđiểm riêng biệt, điển hình như: Là một tỉnh miền núi có địa bàn rộng, địa hìnhchia cắt, dân cư sống thưa thớt, nhiều dân tộc chung sống và có phong tục tậpquán khác nhau; nền kinh tế tăng trưởng khá nhưng chưa vững chắc, văn hoá

xã hội còn nhiều yếu kém, một số vấn đề xã hội còn nhiều bức xúc, chấtlượng nguồn nhân lực chưa đáp ứng được yêu cầu; năng lực trình độ của cán

bộ, đặc biệt là cán bộ y tế cơ sở còn hạn chế, chưa ngang tầm với yêu cầu củanhiệm vụ bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ nhân dân trong giai đoạn hiện nay

Trình độ dân trí không đồng đều giữa các vùng, đặc biệt là các xã vùngsâu, vùng xa, vùng có đông đồng bào dân tộc thiểu số sinh sống Việc tuyêntruyền, phổ biến các kiến thức về bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cho đồng bào

để họ có kỹ năng và thực hiện hành vi có lợi về sức khoẻ còn nhiều hạn chế,trong đó có công tác tuyên truyền về phòng bệnh nói chung và các bệnh lâytruyền qua đường tình dục nói riêng Do vậy tỷ lệ các bệnh chưa có vacxinphòng bệnh còn cao, đặc biệt là các bệnh lây truyền qua đường tình dục.Người bệnh thường đến khám muộn với nhiều nguyên nhân khác nhau nhưkhó khăn về kinh tế, do thiếu hiểu biết, do mê tín dị đoan, do xấu hổ mặc cảmdẫn đến tình trạng bệnh thường nặng, gây khó khăn cho việc điều trị và có rấtnhiều biến chứng đáng tiếc xẩy ra

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám tại Bệnhviện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La có biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm trựctiếp tìm nấm dương tính

Bệnh phẩm dịch âm đạo

Các chủng nấm Candida sp phân lập được trên bệnh nhân có hội

chứng tiết dịch âm đạo tại Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La

* Tiêu chuẩn lựa chọn

- Phụ nữ có biểu hiện tiết dịch âm đạo

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

* Tiêu chuẩn loại trừ

- Sử dụng thuốc trước khi đến khám

- BN đang trong thời kỳ kinh nguyệt hoặc ra máu bất thường

- Các đối tượng không đồng ý tham gia nghiên cứu

- Bệnh nhân HIV/AIDS

2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Phong và Da liễu tỉnh Sơn La: Thu thậpthông tin bệnh nhân làm bệnh án Tiến hành thăm khám bệnh nhân có hội chứngtiết dịch âm đạo ( HCTDÂĐ) và xét nghiệm trực tiếp dịch âm đạo tìm nấm

- Tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Da liễu Trung ương: Nuôi cấy và định

loại chủng Candida sp gây viêm âm đạo.

2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu

2.4.1 Thiết bị, dụng cụ

Kính hiển vi quang học Euromex Holland; Tủ an toàn sinh học cấp II Malaixia; Tủ ấm 25oC - 37oC Memmert - Germany; Tủ sấy Gally - TrungQuốc; Nồi hấp ướt; Máy li tâm Hettich - Germany; Tủ lạnh Toshiba - NhậtBản; Tủ mát Nasaky - Nhật Bản; Máy ảnh kỹ thuật số Coolpix 4500 - Nhật;Hộp đựng mẫu bệnh phẩm

- Cồn 90°, đèn cồn, lam kính, lamen, ống tube thuỷ tinh vô khuẩn, quecấy, tăm bông vô khuẩn, bàn phụ khoa, mỏ vịt (các kích cỡ), pank, bông thấmnước, găng tay, khẩu trang, pipet Man, dao cắt thạch…

Cách pha: nghiền tím gentian với 5ml cồn trong cối sạch, quấy đều, đổ từ

từ 2/3 lượng nước cất vào, quấy đều Sau đó cho axit phenic vào, quấy đều chovào lọ đậy kín, sau 24h đem lọc qua giấy, tráng lọ bằng 1/3 lượng nước cất cònlại Đây là dung dịch tím gentian đặc, khi dùng để nhuộm thì pha loãng với tỷlệ: 10 ml dung dịch tím gentian đặc + 90ml dung dịch axit phenic 5%

+ Dung dịch Fucshin kiềm:

Cách pha tương tự như pha tím gentian

+ Dung dịch Lugol

Cách pha: Nghiền kali iotua với khoảng 20ml nước cất, cho iod tinh thể

đã nghiền nhỏ vào lắc đều cho tan hết Cho hết nước cất còn lại vào, lắc đều

để 24h rồi đem lọc Đựng vào chai màu, không pha nhiều và để lâu vì dễ bịmất màu và biến chất

+ Dung dịch cồn axeton 1/4

2.4.3 Môi trường [23]

- Môi trường Sabouraud: Pepton 10g

Glucose 40g Thạch 18g Nước cất 1000ml (có thể thêm Chloramphenicol hoặc Actidion) Cách làm: Trộn đều các chất vào nước cất, vừa đun vừa khuấy cho đếnkhi sôi và tan hết, lọc qua gạc, đóng 5-7 ml vào ống thủy tinh Hấp khử khuẩn

ở 110°C trong 30 phút hoặc 120°C trong 15 phút, lấy ra để nhiệt độ hạ xuốngkhoảng 50°C, ngả ống tạo thạch nghiêng, bảo quản trong tủ lạnh

- Môi trường thạch Bột ngô + Tween 80:

Bột ngô 4gThạch 1,5gTween 80 1mlNước cất 100ml

Cách làm: Cho bột ngô vào nước, đun nhỏ lửa 1giờ, lọc qua gạc vài lần.Cho thạch, nước cất và Tween 80 cho đủ 100ml, đun sôi cho tan thạch, hấpkhử khuẩn ở 110°C trong 30 phút hoặc 120°C trong 15 phút, đổ ra đĩa petri,mỗi đĩa khoảng 25 - 30ml trong buồng cấy vô trùng

- Môi trường đồng hóa đường:

(NH2)SO4 5g

KH2PO4 1g MgSO4 0,5g Thạch 20gNước cất 1000ml

Cách làm: Trộn đều các chất vào nước cất, vừa đun vừa khuấy cho đến khisôi và tan hết Đóng vào bình hấp khử khuẩn ở 110°C trong 30 phút hoặc 120°C,

khi dùng đổ ra đĩa petri khoảng 25ml trong buồng cấy vô trùng 6 loại đường đượcthử nghiệm là glucose, galactose, saccarose, maltose, raffinose, lactose.

- Môi trường lên men đường:

Yeast extract 5g Nước cất 1000ml Cách làm: Khuấy đều các chất trên cho tan hết phân phối đều vào cácống nghiệm có sẵn 2g đường có ống sinh hơi (Derham tube) 5 loại đường sửdụng là đường glucose, galactose, maltose, saccharose, lactose

- Huyết thanh thỏ ( hoặc người)

- Môi trường CHROM agar Candida của hãng Bio-Rad (Mỹ)

- Kit Auxacolor hãng Bio-Rad (Mỹ)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu thập thông tin các đặc điểm nhiễm nấm Candida

âm đạo (phụ lục 3)

- Sử dụng phiếu điều tra phỏng vấn người bệnh về các thông tin cần tìmhiểu phục vụ mục đích nghiên cứu (tên, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp, dân tộc,đặc điểm môi trường sinh sống, đặc lâm sàng, kết quả xét nghiệm)

3.3.2 Phương pháp mô tả lâm sàng [31]

* Khám lâm sàng:

- Tư vấn: thông báo cho người bệnh kỹ thuật khám và xét nghiệmchuẩn bị thực hiện, hướng dẫn cho người bệnh những điều cần thiết để phốihợp với thầy thuốc

Khám bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ): bệnh nhân nằm tư thế phụkhoa, bộc lộ bộ phận sinh dục, khám bộ phận sinh dục ngoài (môi lớn, môi

bé, vùng hậu môn, niệu đạo, tuyến Skene, tuyến Bartholin) để phát hiện cáctổn thương ở âm hộ

Khám âm đạo: đặt mỏ vịt vào trong âm đạo, mở mỏ vịt và định vị cổ tửcung vào giữa hai cành của mỏ vịt, kiểm tra tình trạng âm đạo, cổ tử cung.

Quan sát tính chất của khí hư: màu sắc, số lượng nhiều hay ít, tính chất(Bột, váng sữa, đặc hay loãng)

Phát hiện các tổn thương:

- Viêm âm hộ: âm hộ có thể đỏ, phù nề, trợt , loét

- Viêm âm đạo: thành âm đạo đỏ phù nề, xung huyết nhẹ, có thể viêm

âm đạo và rải rác có những điểm trợt hoặc loét

- Viêm loét cổ tử cung

- Lộ tuyến cổ tử cung

* Kỹ thuật đo pH âm đạo

- Sử dụng dải giấy pH chỉ thị màu có kèm bảng theo bảng màu chuẩn(Bảng chuẩn màu có chỉ thị pH từ 1-14)

- Lấy dịch tiết âm đạo bằng que cấy vô khuẩn qua mỏ vịt

- Để bệnh phẩm tiếp xúc trực tiếp với dải giấy pH trong thời gian 10 giây.+ Đánh giá kết quả: so dải pH đã thấm dịch âm đạo với bảng màuchuẩn để xác định pH của dịch âm đạo

- Làm tiêu bản: dùng que cấy hoặc tăm bông vô khuẩn lấy dịch ở cùng

đồ sau, hòa bệnh phẩm trong NaCl 9‰, đậy lamen và soi ngay dưới kính hiển

vi (có thể đồng thời phát hiện Trùng roi âm đạo) Sau đó, dùng tăm bông vôkhuẩn khác phết lên lam kính với đường kính khoảng 1cm, cố định bằng cách

để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ dưới ngọn lửa đèn cồn tránh làm nóng tiêu bản

và tiến hành nhuộm Gram, soi kiểm tra mẫu nghiên cứu

3.3.3.2 Nuôi cấy, định loại

* Nuôi cấy trên môi trường Sabouraud: lấy bệnh phẩm bằng tăm bônghoặc que cấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường Sabouraud (có thể thêmChloramphenicol) theo phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm Mỗi bệnh nhân lấybệnh phẩm cấy vào 2- 3 ống, bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay Để trong tủ

ấm t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24 - 48h đọc kết quả

3.3.3.3 Chẩn đoán giống

- Dựa vào đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào

3.3.3.4 Chẩn đoán loài

* Thử nghiệm tạo ống mầm (Germ tube test)

Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C albicans, sử dụng môi

trường huyết thanh ngựa, thỏ hoặc người.Huyết thanh (200 l) được hút vàcho vào ống xét nghiệm thuỷ tinh đã hấp vô khuẩn sau đó được bổ sung tếbào nấm men từ một khuẩn lạc mọc trên môi trường Saburaud Ống nghiệmchứa huyết thanh và tế bào nấm men được ủ ở 37°C, trong thời gian 3h Dịchsau ủ được dùng để kiểm tra trạng thái của nấm men xem có hình thành ống

mầm hay không (soi dưới kính hiển vi, bội giác 40x) Nấm Candida albicans

sẽ có ống mầm Nếu không thấy ống mầm: là Candida khác

Lưu ý:

- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa Không nên dùng huyết thanhngười, còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không có kháng thểkháng nấm

- Đọc kết quả trong vòng 3h, không nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm.Bởi có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả

- Bên cạnh đó, thử nghiệm còn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sựgiới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm.

- Bảo quản huyết thanh ở 2- 8°C, nếu cất trữ lâu để dùng dần bảo quản ở -20°C

* Thử nghiệm tạo bào tử màng dày

Cắt 1 miếng môi trường thạch bột ngô + tween 80 (diện tích khoảng 2

cm2) lên lam kính Dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc nấm men và cấythành 2 đường cách đều nhau trên miếng thạch Đậy lá kính vô khuẩn và đặtlam kính vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U và mộtmiếng bông tẩm nước cất để tạo độ ẩm Ủ trong tủ ấm t° = 25 - 30°C, đọc kếtquả sau thời gian 24h - 48h:

+ Nếu thấy tế bào nấm men, sợi giả và bào tử màng dày(chlamydospores) là những tế bào tròn, thành bào tử rất dầy, kích thước lớn10-15 m, thường sinh ra ở đầu sợi nấm đôi khi xuất hiện ở giữa hoặc cuối

sợi nấm Trên 90% C albicans có khả năng sinh bào tử màng dày Các nấm Candida khác hầu như không có đặc điểm này.

* Thử nghiệm trên môi trường Chrom agar Candida

Là thử nghiệm để phát hiện chủng nấm thông qua hiển thị màu sắc củakhuẩn lạc, trong môi trường chứa sẵn chất chỉ thị màu đặc trưng cho từng loạinấm men Kỹ thuật này rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm menđồng nhiễm

Lấy khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud +

Chloramphenicol cấy ria lên đĩa thạch Chrom agar Candida và ủ trong tủ ấm

25 °C, nhận định kết quả sau 24 - 48h:

- C albicans : bề mặt màu xanh lá cây, hoặc xanh da trời

- C tropicalis: xanh tím, có viền đỏ tím xung quanh khuẩn lạc

- C glabrata: màu hồng, ở giữa phẳng, xung quanh có viền hồng tím.

- Các chủng khác

3.3.4 Phương pháp hóa sinh định danh nấm Candida

* Thử nghiệm hấp thu đường

- Kỹ thuật: láng đều hỗn dịch nấm men trong nước cất lên bề mặt môitrường hấp thu đường Để yên khoảng 2 phút, rồi dùng pipet hút hết lượngdịch thừa Phân chia bề mặt thạch thành 6 ô khác nhau tương ứng với 6 loạiđường Rắc vào mỗi ô một loại đường, đậy nắp hộp Petri, để ở nhiệt độ phòngsau 2-3 ngày và đọc kết quả

- Kết quả: nếu nấm có khả năng hấp thu loại đường nào thì nấm sẽ pháttriển thành khuẩn lạc ở ô có loại đường đó, không phát triển có nghĩa làkhông có khả năng hấp thu đường (Bảng 1)

Bảng 1 Tính chất hấp thu đường của một số chủng Candida

Loài Glu Gal Các loại đườngSac Mal Lac Raf

-Ghi chú: +: Dương tính, -: Âm tính,

* Thử nghiệm lên men đường

+ Sử dụng môi trường lên men đường có ống Durham

- Kỹ thuật : Cho 3 - 4 giọt hỗn dịch nấm men trong nước cất vào ống môitrường, trộn đều ủ ở 25 - 280C trong 10 - 14 ngày

- Kết quả: Khi lên men nấm sẽ biến đường thành acid và sinh hơi làmcho trong ống Durham có bọt khí, nếu trong môi trường có chất chỉ thị màufucshin acid, môi trường chuyển màu đỏ (Bảng 2)

Bảng 2 Tính chất lên men đường của một số chủng Candida

Glu Gal Sac Mal Lac

-Ghi chú: +: Dương tính, -: Âm tính, V: thay đổi

Tuy nhiên kỹ thuật thử nghiệm hấp thu và lên men đường trên chỉ đánh

giá được sự hấp thu 6 loại đường và lên men 5 loại đường của Candida và định loại được 6 loài Candida là C albicans, C tropicalis, C.krusei , C rugola, C gluillermondii, C parapsilosis, không đánh giá được tính chất hấp thu và lên men đường của loài Candida inconspicua Do vậy chúng tôi tiến

hành thử nghiệm lên men đường bằng kít Auxacolor để định loại chính xác

toàn bộ chủng Candida đã phân lập được.

+ Auxacolor (Kit của hãng Bio-Rad):

Nguyên lý: auxacolor là bộ kít nhỏ gọn dựa trên nguyên lý sử dụngđường của các chủng nấm men biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chấtchỉ thị pH có trong môi trường thử nghiệm từ tím sang vàng Thử nghiệmdương tính khi màu chuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím 13loại đường dùng cho thử nghiệm là: glucose, maltose, saccharose, galactose,lactose, raffinose, inositol, cellobiose, trehalose, adonitol, melezitose, xylose,

arabinose và định loại được 15 loài nấm Candida.

Thử nghiệm còn đánh giá sự kháng actidion của các chủng nấm menbiểu hiện bằng sự thay đổi màu của chất chỉ thị oxy hóa khử từ xanh hoặc nâusang hồng hoặc không màu

Thử nghiệm còn cho phép phát hiện hoạt tính enzyme phenoloxydase

của Cryptococcus neoformans Kết quả dương tính cho màu xanh hoặc nâu.

Kỹ thuật thực hiện : lấy một lượng khuẩn lạc nấm men nuôi cấy trongmôi trường Sabouraud hòa vào 3ml dung dịch treo có trong bộ thử, trộn đều,

dùng micropipet hút 100l phân phối vào các giếng thử, đậy kín các giếng thửbằng giấy dính, ủ ở nhiệt độ 28 - 300C sau 24h, 48h, 72h đọc kết quả so vớichứng âm, ghi lại kết quả, đối chiếu với bảng “Phân loại một số nấm men gâybệnh” dùng cho kỹ thuật Auxacolor để suy ra tên chủng nấm (Bảng 3)

Bảng 3 Bảng phân loại một số chủng nấm men (kỹ thuật auxacolor)

Tên loài nấm Glu Mal Sac Gal Lac Raf Ino Cel Tre Ado Mel Xyl Ara

Ghi chú: +: Dương tính -: Âm tính V: thay đổi

+(-) :Test dương tính ở ít nhất 95% số chủng hoặc biểu hiện chậm (48-72 giờ ) -(+) : Test âm tính ở ít nhất 95% số chủng

n

n

Trong đó: fi: Tỷ lệ phần trăm xuất hiện mẫu i

ni: Tần số xuất hiện mẫu i n: Tổng số mẫu khảo sát

3.4 Y đức trong nghiên cứu

- Tư vấn cho bệnh nhân: lấy dịch tiết âm đạo chỉ để phục vụ cho việcchẩn đoán định hướng điều trị và có lợi cho bệnh nhân

- Tuyệt đối giữ bí mật: tất cả những thông tin về bệnh nhân như tên, tuổi,địa chỉ, nghề nghiệp bằng cách đánh mã số cho từng bệnh nhân

- Được sự đồng ý của Hội đồng nghiên cứu khoa học