ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4. Phương pháp hóa sinh định danh nấm Candida * Thử nghiệm hấp thu đường
* Thử nghiệm hấp thu đường
- Kỹ thuật: láng đều hỗn dịch nấm men trong nước cất lên bề mặt môi trường hấp thu đường. Để yên khoảng 2 phút, rồi dùng pipet hút hết lượng dịch thừa. Phân chia bề mặt thạch thành 6 ô khác nhau tương ứng với 6 loại đường. Rắc vào mỗi ô một loại đường, đậy nắp hộp Petri, để ở nhiệt độ phòng sau 2-3 ngày và đọc kết quả.
- Kết quả: nếu nấm có khả năng hấp thu loại đường nào thì nấm sẽ phát triển thành khuẩn lạc ở ô có loại đường đó, không phát triển có nghĩa là không có khả năng hấp thu đường (Bảng 1).
Bảng 1. Tính chất hấp thu đường của một số chủng Candida
Loài Các loại đường
Glu Gal Sac Mal Lac Raf
C. albicans + + + + - - C. tropicalis + + + + - - C. parapsilopsis + + + + - - C. guillermondii + + + + - + C. krusei + - - - - - C. rugosa + + - - - -
Ghi chú: +: Dương tính, -: Âm tính, * Thử nghiệm lên men đường
+ Sử dụng môi trường lên men đường có ống Durham
- Kỹ thuật : Cho 3 - 4 giọt hỗn dịch nấm men trong nước cất vào ống môi trường, trộn đều ủ ở 25 - 280C trong 10 - 14 ngày.
- Kết quả: Khi lên men nấm sẽ biến đường thành acid và sinh hơi làm cho trong ống Durham có bọt khí, nếu trong môi trường có chất chỉ thị màu fucshin acid, môi trường chuyển màu đỏ (Bảng 2).
Bảng 2. Tính chất lên men đường của một số chủng Candida
Glu Gal Sac Mal Lac C. albicans + V - + - C. tropicalis + V + + - C. parapsilopsis + V - - - C. guillermondii + V V - - C. krusei + - - - - C. rugosa - - - - -
Ghi chú: +: Dương tính, -: Âm tính, V: thay đổi
Tuy nhiên kỹ thuật thử nghiệm hấp thu và lên men đường trên chỉ đánh giá được sự hấp thu 6 loại đường và lên men 5 loại đường của Candida và định loại được 6 loài Candida là C. albicans, C. tropicalis, C.krusei , C. rugola, C. gluillermondii, C. parapsilosis, không đánh giá được tính chất hấp thu và lên men đường của loài Candida inconspicua. Do vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm lên men đường bằng kít Auxacolor để định loại chính xác toàn bộ chủng Candida đã phân lập được.
+ Auxacolor (Kit của hãng Bio-Rad):
Nguyên lý: auxacolor là bộ kít nhỏ gọn dựa trên nguyên lý sử dụng đường của các chủng nấm men biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH có trong môi trường thử nghiệm từ tím sang vàng. Thử nghiệm dương tính khi màu chuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím. 13 loại đường dùng cho thử nghiệm là: glucose, maltose, saccharose, galactose, lactose, raffinose, inositol, cellobiose, trehalose, adonitol, melezitose, xylose, arabinose và định loại được 15 loài nấm Candida.
Thử nghiệm còn đánh giá sự kháng actidion của các chủng nấm men biểu hiện bằng sự thay đổi màu của chất chỉ thị oxy hóa khử từ xanh hoặc nâu sang hồng hoặc không màu.
Thử nghiệm còn cho phép phát hiện hoạt tính enzyme phenoloxydase của Cryptococcus neoformans. Kết quả dương tính cho màu xanh hoặc nâu.
Kỹ thuật thực hiện : lấy một lượng khuẩn lạc nấm men nuôi cấy trong môi trường Sabouraud hòa vào 3ml dung dịch treo có trong bộ thử, trộn đều,
dùng micropipet hút 100µl phân phối vào các giếng thử, đậy kín các giếng thử bằng giấy dính, ủ ở nhiệt độ 28 - 300C sau 24h, 48h, 72h đọc kết quả so với chứng âm, ghi lại kết quả, đối chiếu với bảng “Phân loại một số nấm men gây bệnh” dùng cho kỹ thuật Auxacolor để suy ra tên chủng nấm (Bảng 3).
Bảng 3. Bảng phân loại một số chủng nấm men (kỹ thuật auxacolor)
Tên loài nấm Glu Mal Sac Gal Lac Raf Ino Cel Tre Ado Mel Xyl Ara
C. albicans + + + + - - - - + V -(+) + -(+) C. albicans varstellatoidea + + - + - - - - V V - + - C. tropicalis + + +(-) + - - - - + + + + - C. kefyr (pseudotropicalis) + - + + + + - - - -(+) - V V C. krusei + - - - - - - - - - - - - C. parapsilosis + + + + - - - - (+)- (+)- (+)- (+)- - C. guilliermondii + + + + - + - + + + + + + C. lusitaniae + + + -(+) - - - + + + + + - C. zeylanoides + - - V - - - V +(-) V - - - C. inconspicua + - - - - - - - - - - - - C. lipolytica + - - -(+) - - - - - -(+) - - - C. rugosa + - - + - - - - - V - V V C. norvegensis + - - - - - - + - - - -(+) - C. glabrata + - - - - - - - + - - - - C. famata + + + + V + - + + + +(-) + +
Ghi chú: +: Dương tính -: Âm tính V: thay đổi
+(-) :Test dương tính ở ít nhất 95% số chủng hoặc biểu hiện chậm (48-72 giờ ). -(+) : Test âm tính ở ít nhất 95% số chủng.
Hình: Hình ảnh C. albicans