ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp vi sinh [6], [23]
3.3.3.1. Xét nghiệm trực tiếp tìm nấm Candida sp. trong dịch âm đạo
* Xét nghiệm trực tiếp
- Lấy bệnh phẩm: mở âm đạo bằng mỏ vịt và lấy bệnh phẩm ở cùng đồ
sau và thành âm đạo hai bên.
- Làm tiêu bản: dùng que cấy hoặc tăm bông vô khuẩn lấy dịch ở cùng đồ sau, hòa bệnh phẩm trong NaCl 9‰, đậy lamen và soi ngay dưới kính hiển vi (có thể đồng thời phát hiện Trùng roi âm đạo). Sau đó, dùng tăm bông vô khuẩn khác phết lên lam kính với đường kính khoảng 1cm, cố định bằng cách
để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ dưới ngọn lửa đèn cồn tránh làm nóng tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram, soi kiểm tra mẫu nghiên cứu.
3.3.3.2. Nuôi cấy, định loại
* Nuôi cấy trên môi trường Sabouraud: lấy bệnh phẩm bằng tăm bông hoặc que cấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường Sabouraud (có thể thêm Chloramphenicol) theo phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm. Mỗi bệnh nhân lấy bệnh phẩm cấy vào 2- 3 ống, bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay. Để trong tủ ấm t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24 - 48h đọc kết quả.
3.3.3.3. Chẩn đoán giống
- Dựa vào đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào.
3.3.3.4. Chẩn đoán loài
* Thử nghiệm tạo ống mầm (Germ tube test)
Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C. albicans, sử dụng môi trường huyết thanh ngựa, thỏ hoặc người.Huyết thanh (200 µl) được hút và cho vào ống xét nghiệm thuỷ tinh đã hấp vô khuẩn sau đó được bổ sung tế bào nấm men từ một khuẩn lạc mọc trên môi trường Saburaud. Ống nghiệm chứa huyết thanh và tế bào nấm men được ủ ở 37°C, trong thời gian 3h. Dịch sau ủ được dùng để kiểm tra trạng thái của nấm men xem có hình thành ống mầm hay không (soi dưới kính hiển vi, bội giác 40x). Nấm Candida albicans
sẽ có ống mầm. Nếu không thấy ống mầm: là Candida khác
Lưu ý:
- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa. Không nên dùng huyết thanh người, còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không có kháng thể kháng nấm.
- Đọc kết quả trong vòng 3h, không nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm. Bởi có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả.
- Bên cạnh đó, thử nghiệm còn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sự giới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm.
- Bảo quản huyết thanh ở 2- 8°C, nếu cất trữ lâu để dùng dần bảo quản ở -20°C. * Thử nghiệm tạo bào tử màng dày
Cắt 1 miếng môi trường thạch bột ngô + tween 80 (diện tích khoảng 2 cm2) lên lam kính. Dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc nấm men và cấy thành 2 đường cách đều nhau trên miếng thạch. Đậy lá kính vô khuẩn và đặt lam kính vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U và một miếng bông tẩm nước cất để tạo độ ẩm. Ủ trong tủ ấm t° = 25 - 30°C, đọc kết quả sau thời gian 24h - 48h:
+ Nếu thấy tế bào nấm men, sợi giả và bào tử màng dày (chlamydospores) là những tế bào tròn, thành bào tử rất dầy, kích thước lớn 10-15 µm, thường sinh ra ở đầu sợi nấm đôi khi xuất hiện ở giữa hoặc cuối sợi nấm. Trên 90% C. albicans có khả năng sinh bào tử màng dày. Các nấm
Candida khác hầu như không có đặc điểm này.
* Thử nghiệm trên môi trường Chrom agar Candida
Là thử nghiệm để phát hiện chủng nấm thông qua hiển thị màu sắc của khuẩn lạc, trong môi trường chứa sẵn chất chỉ thị màu đặc trưng cho từng loại nấm men. Kỹ thuật này rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm men đồng nhiễm.
Lấy khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud +
Chloramphenicol cấy ria lên đĩa thạch Chrom agar Candida và ủ trong tủ ấm 25 °C, nhận định kết quả sau 24 - 48h:
- C. albicans : bề mặt màu xanh lá cây, hoặc xanh da trời - C. tropicalis: xanh tím, có viền đỏ tím xung quanh khuẩn lạc
- C. glabrata: màu hồng, ở giữa phẳng, xung quanh có viền hồng tím. - Các chủng khác