Khảo sát thực trạng nhiễm vi sinh vật hiếu khi, coliforms và e coli trong nước giải khát

Bên cạnh nhữngsản phẩm chất lượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém.Mặc dù, việc kiểm định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơquan chức năng thực hiện

EMB Eozin Methyl Blue

EPEC Enteropathogenic E Coli

ETEC Enterotoxigenic E coli

EIEC Enteroinvasive E Coli

EHEC Enterohaemorrhagic E.coli

TCVN Tiêu chuẩn Việt nam

ISO Tiêu chuẩn quốc tế

QĐ - BYT Quy định – Bộ Y tế

MPN Most Probale Number

BGBL Canh thang Brilliant Green Bile Lactose

Bảng 2.1: Bảng giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước giải khát đóng chai

không cồn 12

Bảng 3.1: Số lượng mẫu thu thập tại các địa điểm 13

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.3: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.4: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 4.1: Mức độ nhiễm TSVSVHK trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên 26

Bảng 4.2 Mức độ nhiễm Coliforms trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên 28

Bảng 4.3: Mức độ nhiễm E coli trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên 30

Bảng 4.4: Bảng kết quả so sánh tỷ lệ nhiễm VSV trong nước giải khát 32

Bảng 4.5: Kết quả xác định mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E coli 33

Hình 2.1: Vi khuẩn Coliforms (ảnh chụp hiển vi điện tử) qua kính 7

Hình 2.2: Vi khuẩn E coli 9

Hình 3.1: Sơ đồ phương pháp xác định Coliforms trong thực phẩm theo phương pháp MPN 19

Hình 3.2: Sơ đồ phương pháp xác định tổng số E coli trong thực phẩm theo phương pháp MPN 22

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập tổng số vi sinh vật hiếu khí 25

Hình 4.1: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu TSVSVHK 27

Hình 4.2: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu Colifroms 29

Hình 4.3: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu E coli 31

Hình 4.4: Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm VSV trong nước giải khát 32

Hình 4.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu không đạt tiêu chuẩn thực phẩm 34

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nước giải khát 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử hình thành và phát triển 3

2.1.3 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam 4

2.2 Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nước giải khát 6

2.2.1 Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí 6

2.2.2 Tổng quan về Coliforms 7

2.2.3 Tổng quan về E coli 9

2.2.4 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước giải khát đóng chai 12

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 13

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 13

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 13

3.3.1 Thiết bị nghiên cứu 14

3.3.2 Dụng cụ nghiên cứu 14

3.3.3 Hóa chất nghiên cứu 14

3.4 Nội dung nghiên cứu 15

3.5 Phương pháp nghiên cứu 15

3.5.2 Phương pháp xác định tổng số Coliforms có trong thực phẩm 16

3.5.3 Phương pháp xác định tổng số E coli có trong thực phẩm 20

3.5.4 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm 22

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Xác định mức độ nhiễm Coliforms, E coli, TSVSVHK trong nước giải khát tại chợ Thái, chợ Đồng Quang, chợ Nông Lâm trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 26

4.1.1 Mức độ nhiễm TSVSVHK 26

4.1.2 Mức độ nhiễm Coliforms 28

4.1.3 Mức độ nhiễm E.coli 30

4.2 Đánh giá mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E coli trong nước giải khát 32

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm hàng đầukhi mà xã hội không ngừng phát triển, cuộc sống con người không ngừng cảithiện, tiện nghi và đầy đủ hơn Con người không chỉ ăn no mặc ấm mà còn ănngon mặc đẹp và quan trọng hơn hết sức khỏe con người được chăm sóc tốt vàchu đáo Bên cạnh những mặt tích cực đấy thì mặt trái của vấn đề cũng rất đángquan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực ăn uống, vệ sinh an toàn thực phẩm

Các loại thực phẩm, đồ uống ngày nay rất phong phú về chủng loại,màu sắc, thành phần và giá cả cũng như giá trị dinh dưỡng Bên cạnh nhữngsản phẩm chất lượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém.Mặc dù, việc kiểm định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơquan chức năng thực hiện thường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết đượcnhững sản phẩm kém chất lượng trôi nổi trên thị trường [18] Do đó, ngườitiêu dùng sử dụng những sản phẩm này sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sứckhỏe

Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậuquả nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Điều này không chỉ phổ biến ởViệt Nam mà ngay cả các nước trên thế giới cũng vậy Một trong nhữngnguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các visinh vật gây hại trong thực phẩm [11]

Các loại nước uống thuộc các thương hiệu nổi tiếng: Pepsi, Lavie,Sting, Coca Cola, trà xanh C2, trà xanh O độ, trà bí đao… được bày bán trànlan trên thị trường nên khả năng nhiễm vi sinh vật gây hại là rất cao Chính vìthế, các bệnh liên quan tới ăn uống như rối loạn tiêu hóa, hô hấp, tiêu chảy …không ngừng phát triển thậm chí thành dịch ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức

khỏe con người Mà điển hình trong những loại vi sinh vật gây hại cho sứckhỏe con người có nhiều trong đồ uống phải kể tới đó là các vi sinh vật hiếu

khí, Coliforms và E coli.

Từ thực tiễn trên để có biện pháp hạn chế tình trạng ngộ độc thực phẩm

và đánh giá chất lượng nước giải khát, chúng tôi tiến hành “Khảo sát thực

trạng nhiễm vi sinh vật hiếu khi, Coliforms và E coli trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên.”

1.2 Mục đích của đề tài

Xác định được mức độ nhiễm chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí

(TSVSVHK), Coliforms và E coli trong nước giải khát trên địa bàn thành

phố Thái Nguyên

Đánh giá được mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E coli trong một

số mẫu nước giải khát trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

1.3 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát thực trạng nhiễm vi sinh vật hiếu khí (VSVHK), Colifoms và

E coli trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về nước giải khát

2.1.1 Khái niệm

Nước uống giải khát là loại thức uống không có cồn, có thể có gas và

bổ sung các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp

2.1.2 Lịch sử hình thành và phát triển

Lịch sử nước giải khát bắt nguồn từ nguồn nước khoáng được tìm thấytrong các dòng suối tự nhiên Từ lâu, việc ngâm mình trong suối nước khoángđược xem là tốt cho sức khỏe do tác dụng trị bệnh của khoáng chất có trongnước suối Các nhà khoa học cũng nhanh chóng phát hiện ra Carbon dioxide(CO2) có trong các bọt nước khoáng thiên nhiên [15]

Các loại nước khoáng không gas (không CO2) đầu tiên được xuất hiệnvào thế kỷ 17 với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một ít mật ong.Năm 1676, công ty Compagnie de Limonadiers (Pháp) độc quyền bán các loạinước chanh giải khát Đến năm 1767, Tiến sĩ Joseph Priestley – một nhà hóahọc người Anh đã pha chế thành công loại nước giải khát có gas Ba năm sau,nhà hóa học Thụy Điển Torbem Bergman cho phép sản xuất loại nước khoángnhân tạo với số lượng lớn Tuy nhiên, mãi đến năm 1832 loại nước khoáng cógas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời hàng loạt của máy sản xuất nước cógas trên thị trường [16]

John Mathws – cha đẻ nước giải khát Mỹ là người tiên phong trong lĩnhvực kinh doanh nước giải khát ở Mỹ, ông nhập cư vào Mỹ từ năm 1832, trước

đó ông là người đi đầu trong ngành kinh doanh nước giải khát tại Anh.Mathws đã học một số nguyên lý cơ bản về pha chế khí cacbonic và máy tạogas từ Joseph Bramah (nhà phát minh máy nén thủy lực từ thế kỷ thứ 18).Mathws định cư hẳn tại Mỹ và bắt đầu cung cấp nước giải khát có gas cho các

cơ sở giải khát ở khu vực New York – thời gian này thường phổ biến loạithức uống ướp lạnh nhưng không có hương vị nhờ tay nghề cao của Mathwsngành công nghiệp nước giải khát Mỹ phát triển nhanh chóng [15].

Những thập niên sau đó – kể từ 1852, với việc nước gừng được tung rathị trường, các sản phẩm có thương hiệu đã xuất hiện và được cấp quyền kinhdoanh Bắt đầu từ những năm 1880 đến nay, thị trường nước giải khát trànngập các loại nước uống có nhãn hiệu như Coca Cola (1886), Moxie (1885),Dr.Peppe (188), Pepsi Cola (1898)… [16]

2.1.3 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam

2.1.3.1 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới

Ngành công nghiệp nước giải khát trên thế giới đã hình thành và pháttriển từ rất lâu nhưng chỉ bùng nổ thực sự từ chiến tranh thế giới thứ hai vàkéo dài tới ngày nay mà điển hình nhất đó là Coca Cola và Pepsi Tiêu thụtoàn cầu vượt quá 327 tỷ lít mỗi năm, trong đó Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật lànhững thị trường lớn nhất của ngành công nghiệp này Do không ngừng mởrộng thị trường nên hai hãng nước giải khát lớn này chi phối cổ phần thịtrường thế giới là tất nhiên Coca Cola nắm khoảng một nửa thị phần thế giới

và bán 4 loại nước giải khát hàng đầu Doanh thu bán hàng trong năm 2006đạt 241 tỷ USD, lợi nhuận đạt 20% và hơn 400 dự án đang triển khai [16]

Xếp thứ hai và thứ ba thế giới trong ngành giải khát phải kể tới đó làPepsi và Cadbury Schweppes kiểm soát hầu hết thị phần còn lại Doanh thuđạt hơn 129 tỷ USD Một số sản phẩm của Pepsi như Pepsi, Diet Pepsi, Slice,Moutain Dew và Root Beer Mug Một số sản phẩm của Cadbury Schweppesgồm: La Casere, Trina, Spring Vallye và Ware [18]

Ngoài ra trong năm 1898, Pepsi – Coca được thành lập ở New Bern bởiCaleb Bradham DPepsiCo Inc nắm giữ khoảng một phần ba của thị trườngHoa Kỳ [18]

2.1.3.2 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát tại Viêt Nam

Theo nhận định của GS Phạm Song, Chủ tịch Tổng hội Y học ViệtNam, nước ta là một trong những thị trường tiêu thụ nước giải khát khôngcồn có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất thế giới Giáo sư cũng cho biết thêm,trung bình mỗi năm, một người Việt Nam mới chỉ uống khoảng 3 lít nước giảikhát đóng chai không cồn, trong khi mức bình quân của người Philippines là

50 lít trên năm Đến năm 2012, tổng lượng đồ uống bán lẻ ở Việt Nam sẽ tăng50% so với năm 2007 Mức tăng trưởng này chưa thể đáp ứng nhu cầu cònquá lớn trong thời điểm hiện nay Ông Nguyễn Thanh Phong, Cục phó Cục

An toàn Vệ sinh Thực phẩm (Bộ Y tế) cho biết thị trường nước giải khát ViệtNam còn khá nhiều đới với doanh nghiệp trong nước [15]

Hiện nay, đa số người tiêu dùng đều hướng tới nhu cầu sử dụng nhữngthực phẩm từ tự nhiên Những sản phẩm này không chỉ có lợi cho sức khỏe màcòn thân thiện với môi trường Nhiều doanh nghiệp Việt Nam sản xuất nước giảikhát đang triển khai những sản phẩm với thành phần tự nhiên, đảm bảo vệ sinh

an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu thực tế của người dân trong nước

Trước sự thay đổi thị hiếu của thị trường, các doanh nghiệp sản xuấtnước giải khát đã lập tức thay đổi cơ cấu sản xuất, đầu tư dây chuyền sản xuấtngày càng hiện đại, đồng thời nghiên cứu và cho ra đời những sản phẩm vớihương vị mới Các hãng Vinamilk, Tribeco, Wonderfarm, Number One, … đãtung ra thị trường nhiều loại nước trái cây: táo, xoài, nho, mãng cầu, trà xanh,trà thảo mộc không đường dành cho người mắc bệnh tiểu đường hay khôngthích uống có đường….để đáp ứng nhu cầu khách hàng Hiện các doanhnghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng vượt mức so với trướcđây Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng30% sản lượng nước giải khát không gas Các nhà nhập khẩu cũng làm đadạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo,Welchs, Regain, Berri, Drwitt… Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất

nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tácdụng thanh nhiệt: atiso, mía lau, sâm, bí đao…[16]

2.2 Tình hình nhiễm vi sinh vật trong nước giải khát

Theo ông Nguyễn Thanh Phong, thị trường nước giải khát Việt Nam

còn khá lớn đối với doanh nghiệp trong nước Tuy nhiên theo ông Phong,không vì thế mà doanh nghiệp Việt Nam lơ là việc nâng cao chất lượng, nhằmđem đến những sản phẩm tốt nhất cho người tiêu dùng Sự cạnh tranh trên thịtrường đồ uống ngày càng trở nên khốc liệt, đòi hỏi doanh nghiệp khôngngừng đẩy mạnh nghiên cứu, nhằm đưa ra những sản phẩm mới có chất lượngcao Vì thế ngày càng nhiều cơ sở sản xuất, các doanh nghiệp nước giải khátđược thành lập Bên cạnh những hãng: Vinamilk, Pepsi, Tribeco, CocaCola…luôn luôn tung ra thị trường những sản phẩm mới cạnh tranh, hạ giáthành, đáp ứng nhu cầu khách hàng Tuy nhiên, không ít sản phẩm có giácạnh tranh nhưng chất lượng kém

2.2.1 Tổng quan về vi sinh vật hiếu khí

Vi sinh vật hiếu khí là tất cả các vi sinh vật có khả năng phát triển trongmôi trường thạch dinh dưỡng ở 30oC từ 24 – 48h với điều kiện hiếu khí Tổng

số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươimới hay nguy cơ hư hỏng của thực phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí còn cóthể chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng

số vi khuẩn hiếu khí có tác dụng nhất trong việc đánh giá chất lượng vệ sinhcủa các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Tổng số vikhuẩn hiếu khí được sử dụng để đánh giá vệ sinh trong quá trình sản xuất, vậnchuyển và bảo quản thực phẩm, tổng số vi khuẩn hiếu khí còn được dùng làmtiêu chuẩn để xác định thời gian bảo quản Tổng số vi khuẩn hiếu khí chỉ rarằng có thể tồn tại những vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Số lượng vikhuẩn hiếu khí thấp thường đi đôi với thực phẩm an toàn Do đó, chỉ tiêu tổng

số vi khuẩn hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ

an toàn của thực phẩm [4]

Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trênmôi trường thạch dinh dưỡng, được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thànhkhuẩn lạc (Colony Forming Unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thểtích thực phẩm [7].

Thuật ngữ “vi sinh vật hiếu khí” trong vệ sinh thực phẩm được hiểu là baogồm cả VSVHK và vi khuẩn yếm khí tùy tiện Sự phân chia vi sinh vật thành hainhóm dựa trên cơ sở nhiệt độ phát triển giữa chúng Theo Avery S.M (1991) hệ vikhuẩn được xác định thành hai nhóm dựa theo nhiệt độ của chúng:

1 Nhóm vi sinh vật (VSV) ưa nhiệt: Phát triển tốt ở nhiệt độ 370C vàngừng phát triển ở 10C

2 Nhóm VSV ưa lạnh: Sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp hơn

Xác định TSVSVHK trong thực phẩm được sử dụng như là một nhân tốchỉ điểm về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian chế biến, vận chuyển vàbảo quản thực phẩm Nó được tin cậy là phương pháp tốt để ước lượng vi sinhvật xâm nhập vào thực phẩm [7]

2.2.2 Tổng quan về Coliforms

2.2.2.1 Đặc điểm của Coliforms

Hình 2.1: Vi khuẩn Coliforms (ảnh chụp hiển vi điện tử) qua kính

(Nguồn:http://thewatchers.adorraeli.com)

Các loại thực phẩm đạt tiêu chuẩn

vệ sinh là thực phẩm không nhiễm các

loại vi sinh vật nguy hiểm hoặc nhiễm ở mức độ an toàn Nhìn chung, việckiểm tra từng sản phẩm thực phẩm có ô nhiễm vi khuẩn độc hại là không dễdàng Hiện nay, ngoài chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, các chỉ tiêu đánh giá

tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm bao gồm hai nhóm vi khuẩn chính: Coliforms và cầu khuẩn đường ruột (Enterococci) [9].

Coliforms và Feacal Coliforms còn là các nhóm sinh vật được dùng để

chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm

Nhóm Coliforms gồm những trực khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện, gram âm,

không sinh nha bào, lên men đường lactose và sinh hơi trên môi trường nuôicấy lỏng Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này được chia thành hai nhóm

nhỏ là Coliforms và Feacal Coliforms có nguồn gốc từ phân các loài động vật Feacal Coliforms có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng, bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella, và Enterobacter Khi Coliforms

và Feacal Coliforms xuất hiện trong mẫu thì có khả năng mẫu bị nhiễm nước

nhiễm phân và có khả năng chứa các VSV gây bệnh hiện diện trong phân

Trong các thành viên của nhóm Coliforms thì E coli là loài được quan tâm

nhiều nhất về VSATTP [9]

Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực

phẩm Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấpđến - 2oC và cao đến 50oC Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm

ở 5oC tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng là 3 - 6oC Ngưỡng

pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 - 9 Chúng phát triển tốt trên môi

trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 - 16 giờ ở 37oC,phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp [7]

Nhiễm Coliforms với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc Thời gian ủ bệnh từ 2

đến 20 giờ, bình thường là 4 - 7 giờ Bệnh phát đột ngột, ít nôn mửa, đi phân

lỏng, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ, có trường hợp sốt cao, chân coquắp Bình thường sau 2 - 3 ngày sẽ khỏi, bị nặng sẽ kéo dài hơn [14].

Đặc điểm gây bệnh :

Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với loài duy nhất là E.coli,

Citrobacter, Kebsiella, Enterobacter Đặc điểm gây bệnh của các chủng Coliforms có trong hệ tiêu hóa của người bình thường là vô hại, chúng chỉ gây

bệnh ở những người có hệ miễn dịch bị tổn thương

2.2.3 Tổng quan về E coli

Escherichia coli (E coli) là một dạng Coliforms ưa nhiệt Năm 1885

nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã phân lập được loài này từ

phân trẻ em bị bệnh Sau này vi khuẩn này được mang tên ông, tên “coli” có

nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “kolon” có nghĩa là “ruột” thường có trong ruộtngười và động vật Năm 1971 người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vậtgây bệnh trong thực phẩm và hiện nay với hầu hết các sản phẩm thực phẩmđều dùng chỉ tiêu này để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm [14]

Hình 2.2: Vi khuẩn E coli

2.2.3.1 Đặc điểm của E coli

Những vi khuẩn thuộc nhóm Escherichia coli (E coli) là những trực khuẩn di động hay không di động, gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae,

nhiệt độ thích hợp 42 - 440C, pH trong khoảng 4,4 - 9, sinh indol ở 42 - 440C,

Escherichia coli www.foodpoisonblog.com

tạo độc tố mạnh Những chủng điển hình sinh Indol, không có urease, phảnứng đỏ methyl dương tính, lên men đường glucose có sinh hơi, lên menđường mannit và lactose [9]

Trong các loại vi khuẩn nhóm Coliform, E coli thường được dùng làm

chỉ tiêu đánh giá vì vi khuẩn này đặc hiệu cho sự ô nhiễm phân hơn

Enterobacter aerogenes Để phát hiện E coli, người ta sử dụng công thức

IMViC trong đó: I = khả năng sinh indol, M = phản ứng đỏ methyl, V =Voges - Proskauer (khả năng sinh acetoin), và C = khả năng sử dụng citrate.Dựa vào đó, hai vi khuẩn này được phân biệt như sau:

I M V C

E coli + +

-E aerogenes - - + +

Có 3 loại kháng nguyên được dùng để định nhóm kháng nguyên của

E coli: Kháng nguyên O (kháng nguyên thân chịu nhiệt), kháng nguyên K

(kháng nguyên thân không chịu nhiệt), và kháng nguyên H (kháng nguyênlông không chịu nhiệt) [6]

Một trong những đặc tính quan trọng của E coli liên quan đến khả

năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là thời hạn sống sót của chúng Chúngthường chết đi sau khi cùng tồn tại trong một khoảng thời gian như các sinhvật gây bệnh khác có trong ruột (có một số tài liệu cho thấy ở trong nước một

số vi sinh vật gây bệnh có sức chống chịu cao hơn) Ở thực phẩm qua các

biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông, chiếu xạ, E coli bị tiêu diệt trong khi

một số vi sinh vật khác vẫn chống chịu được và sống sót Tương tự như vậy

nước qua xử lý vẫn chứa một số VSV gây bệnh trong khi E coli có giá trị chỉ

thị về vệ sinh do tính chống chịu tương đối cao của chúng đối với pH thấp[7,13]

- Đặc tính sinh hóa:

E coli có khả năng lên men nhiều loại đường sinh hơi đặc biệt là lactose,

sinh Indol, không có urease, phản ứng methyl đỏ dương tính, có khả năng khử

nitrat thành nitrit E coli có enzyme tryptophanase, nếu trong môi trường có

tryptophan chúng sẽ phân giải tryptophan sinh indol [7, 15]

Những dòng E coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh

khác nhau nhưng thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H12, O157 [18]

2.2.3.2 Nguồn lây nhiễm E Coli

Do phân bố rộng rãi trong môi trường nên E coli dễ dàng nhiễm vào

thực phẩm từ nguyên liệu nguồn nước hay trong quá trình chế biến Các

nghiên cứu sinh thái học chỉ ra rằng E coli có nguồn gốc từ hệ tiêu hoá của

người và các động vật máu nóng, dù vậy vi khuẩn này cũng có thể sống sót vàsinh trưởng nhanh trong các môi trường thích hợp khác Do đó, sự xuất hiện

của E coli trong thực phẩm là dấu hiệu của sự ô nhiễm phân và người tiêu

dùng có thể nhiễm phải các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác như

Salmonella khi tiêu thụ các thực phẩm này E coli là chỉ tiêu đánh giá với

các thực phẩm sống hoặc các thực phẩm không cần xử lý nhiệt trước khi sửdụng [13]

2.2.3.3 Các chủng E coli liên quan tới ngộ độc thực phẩm

E coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy tiện, không sinh bào tử,

khá phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người vàđộng vật Chúng thuộc loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl reddương tính song có phản ứng VP và citrate âm tính Cách hữu hiệu nhất đểđịnh danh loài là xác định kiểu huyết thanh, dùng kháng thể tương hợp với

kháng nguyên O, H và K của các chủng E coli khác nhau.

E coli gây tiêu chảy và ngộ độc thực phẩm là loại phổ biến nhất trên

toàn thế giới Những chủng E coli này được phân loại theo tính chất gây bệnh

và có cơ chế gây bệnh khác nhau [12]

Nhóm E coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic E Coli EPEC):

-Nhóm E Coli này là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở trẻ em đặc

biệt là ở những nước đang phát triển EPEC còn liên quan tới những vụ dịchtiêu chảy ở nhân viên y tế tại các nước phát triển EPEC bám dính vào tế bàotiết nhày ở niêm mạc ruột non, khả năng bám dính này được quy định bởi cácgen nằm trên nhiễm sắc thể Hậu quả của nhiễm trùng do EPEC là tiêu chảytoàn nước, thường tự khỏi nhưng cũng có thể chuyển thành mãn tính [12]

- Nhóm E coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E col - ETEC)

- Nhóm E coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive E Coli - EIEC)

- Nhóm E coli gây chảy máu đường ruột (Enterohaemorrhagic E coli

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Nước giải khát có gas: Pepsi (PS), Coca Cola (CO), Sting (ST)

+ Nước giải khát không có gas: Trà xanh O độ (OD), trà bí đao (BD),trà xanh C2 (C2)

+ Số lượng mẫu thu thập tại các địa điểm cụ thể là:

Bảng 3.1: Số lượng mẫu thu thập tại các địa điểm

Khảo sát, đánh giá thực trạng nhiễm TSVSVHK, Colifoms và E coli

trong một số nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

3.3.1 Thiết bị nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 3.1

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Mã số

thiết bị Hãng sản xuất Quốc gia

3.3.2 Dụng cụ nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu sử dụng các dụng cụ được thống kê dưới bảng 3.2

Bảng 3.3: Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

3.3.3 Hóa chất nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu sử dụng các môi trường được thống kê dưới bảng 3.3

Bảng 3.4: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên môi trường Hãng, nước sản xuất Mục đích sử dụng

–Green Bile Lactose

broth) (BGBL)

Lưu ý: pha môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định mức độ nhiễm Coliforms, E coli, TSVSVHK

trong nước giải khát tại chợ Thái, chợ Đồng Quang, chợ Nông Lâm trên địabàn thành phố Thái Nguyên

Nội dung 2: So sánh mức độ nhiễm vi khuẩn Coliforms, E coli,

TSVSVHK của nước giải khát trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

3.5 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứuthường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt nam(TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO)

- TCVN 4882:2007 (ISO 4831:2006) Vi sinh vật trong thực phẩm và

thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform - kỹ thuật

đếm số có xắc suất lớn nhất

- TCVN 6846:2007 (ISO 7251:2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và

thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli giả

3.5.1 Kỹ thuật lấy mẫu xét nghiệm và bảo quản mẫu

- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ các quán tại chợĐồng Quang, chợ Thái, chợ Nông Lâm thành phố Thái Nguyên

- Cho mẫu vào túi nilon vô trùng, các lọ, hộp inox hấp sấy tiệt trùng vàghi nhãn có các thông tin cần thiết (số bao gói, tên mẫu, địa chỉ mẫu, lô hàngsản xuất, ngày lấy mẫu, ký hiệu, ) Khối lượng mẫu tối thiểu là 250ml

- Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau và được vậnchuyển tới phòng xét nghiệm trong hộp xốp, bình cách nhiệt có chứa đá Tạiphòng xét nghiệm mẫu được tiến hành xét thử nghiệm, với mẫu chưa tiếnhành thử nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp đối với từng loại mẫu.

3.5.2 Phương pháp xác định tổng số Coliforms có trong thực phẩm

Xác định chỉ tiêu Coliforms áp dụng theo TCVN 4882:2007 ISO

4831:2006 [3]

3.5.2.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật này tiến hành theo phương pháp MPN và sử dụng bảng chỉ số

MPN để tính kết quả Tổng số Coliforms có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm thực

phẩm được xác định bằng số ống dương tính sau khi nuôi cấy vào các ốngcanh thang xanh brilliant lactose mật bò ở 35 ± 2oC/24 - 48 giờ.

3.5.2.2 Môi trường và hóa chất

Canh thang Lauryl tryptose

Canh thang Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

3.5.2.3 Tiến hành

Chuẩn bị dung dịch mẫu thử và pha loãng mẫu:

Hút chính xác mỗi loại mẫu nước giải khát 5ml, cho vào bình nón chứa sẵn45ml nước muối pepton Lắc đều 2 - 3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10-1

Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứasẵn 9ml nước muối pepton Lắc đều trong 2 - 3 phút, thu được dung dịch 10-2

Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thửtương ứng 10-3, 10-4, 10-5

Chú ý: - Dùng một pipet vô trùng mới ở mỗi độ pha loãng

- Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầusâu hơn 1cm

- Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng ban đầu

- Thời gian tiến hành:

* Từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi cấy khôngvượt quá 45 phút

* Từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị cácdung dịch pha loãng tiếp theo không được vượt quá 30 phút

- Độ pha loãng của mẫu phụ thuộc vào độ bẩn sạch của mẫu thử, saocho đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kếtquả âm tính

Phương pháp tiến hành

Bước 1: Nuôi cấy mẫu

- Với một mẫu phải nuôi cấy ở 3 đậm độ, mỗi đậm độ nuôi trong 3 ống môi trường canh thang Lauryl sulfate, mỗi ống cho 1ml dung dịch mẫu thử

- Sau đó lắc đều môi trường và đem nuôi trong tủ ấm 370C từ 24 - 48 giờ

- Xác định ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính làm đục môi trường và sinh hơi, sủi bọt khí)

Bước 2: Cấy chuyển

- Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấychuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang BGBL, mỗi ống 1ăng (tương ứng đậm độ mẫu thử)

- Sau khi cấy chuyển lắc đều, đặt trong tủ ấm 370C trong vòng 24 - 48 giờ

- Xác định số ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: làm đụccanh thang và sinh hơi)

Bước 3: Xác định tổng số Coliforms.

- Xác định ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: làm đục canh thang, sinh hơi và chuyển màu canh thang từ xanh sang xanh nhạt)

- Từ những ống dương tính, tra bảng MPN để xác định tổng số

Coliforms có trong 1ml sản phẩm.

- Biểu thị kết quả

* Lựa chọn các độ pha loãng

Mỗi mẫu xét nghiệm chọn ba độ pha loãng liên tiếp ứng với mộttrong ba trường hợp sau:

Trường hợp 1- Có ít nhất một độ pha loãng cho cả ba ống dương tính

Chọn đậm độ pha loãng cao nhất cho ba ống dương tính cùng với hai

độ pha loãng cao hơn kế tiếp

Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũngcho ba ống dương tính thì chọn tiếp ba độ pha loãng cao nhất trong cả dãy(tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất)

Trường hợp 2- Không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính

Chọn ba độ pha loãng cao nhất trong dãy pha loãng (tức là những độpha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó có ít nhất thu được mộtkết quả dương tính

Trường hợp 3- Các trường hợp đặc biệt

Trong tất cả các trường hợp khi có nhiều hơn một trong ba độ phaloãng được chọn theo trường hợp 1 và trường hợp 2 không cho ống dươngtính, thì hãy chọn từ các độ pha loãng này độ pha loãng thấp nhất khôngcho các ống dương tính và hai độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy phaloãng, trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiênđược chuẩn bị từ mẫu thử trong trường hợp cuối cùng này cần chọn ra ba

độ pha loãng đầu tiên để tính MPN thậm chí loạt ống này bao gồm hai độpha loãng không cho ống dương tính nào