Xác định chỉ tiêu hiếu khí trong thực phẩm áp dụng theo TCVN 4884:2005 ISO 4833:2003 [2].
3.5.4.1. Nguyên tắc
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ± 10C trong thời gian từ 24 - 48 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu sản phẩm TP kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
Chuẩn bị mỗi đậm độ hai đĩa rót sử dụng môi trường cấy qui định và một lượng mẫu thử qui định.
Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC trong 72h.
Tính số lượng vi sinh vật trong 1ml hoặc trong 1g mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn.
3.5.4.2. Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử và pha loãng mẫu:
Hút chính xác mỗi loại mẫu 5ml cho vào bình chứa sẵn 45ml nước muối pepton. Lắc đều 2 - 3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối pepton. Lắc đều trong 2 - 3 phút, thu được dung dịch 10-2.
Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4.
Phương pháp tiến hành
Bước 1: Đổ đĩa
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và một pipet vô trùng.
Lấy 1ml dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri.
Nên chọn các đậm độ pha loãng tới hạn (ít nhất hai dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy các đĩa petri sao cho thu được số đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa.
Thạch (PCA) đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ± 10C trong điều kiện vô khuẩn.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng từ 12ml đến 15ml môi trường thạch đếm đĩa ở 44oC. Thời gian từ khi chuẩn bị xong dung dịch pha loãng 10-1 đến khi rót môi trường vào các đĩa không vượt quá 45 phút.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa sang trái 3 lần, sang phải 3 lần.
Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang khi thạch đã đông, lật úp các đĩa.
Bước 2: Ủ ấm
Lật úp các đĩa đã cấy mẫu và đặt vào tủ ấm ở 370C ± 1oC trong 48 – 72 ± 3h. Không xếp chồng cao quá 6 đĩa. Các chồng đĩa cần được tách khỏi nhau và cách xa thành và nóc tủ.
Bước 3: Đếm khuẩn lạc và tính kết quả - Đếm khuẩn lạc:
Sau giai đoạn ủ, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa. Các khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa.
- Tính kết quả:
+ Chọn những đĩa có từ 15 - 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N) khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng tổng số có khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:
∑C N=
(n1 + 0,1 n2).d Trong đó:
C : Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
n1, n2 : Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn ở đĩa thứ 2 d : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1
Sau đó làm tròn số kết quả có được chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).
+ Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính theo trung bình cộng.
+ Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc ở đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm.
1ml 1ml 5ml mẫu 45ml dung dịch pha loãng 9ml 9ml 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml 12-15ml thạch PCA 12-15ml thạch PCA 12-15ml thạch PCA Ủ ấm 300 C/72h Tính toán kết quả
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định mức độ nhiễm Coliforms, E. coli, TSVSVHK trong nước giải khát tại chợ Thái, chợ Đồng Quang, chợ Nông Lâm trên địa bàn thành phố Thái Nguyên
4.1.1. Mức độ nhiễm TSVSVHK
Để xác định mức độ nhiễm TSVSVHK của nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên chúng tôi tiến hành lấy mẫu nước giải khát ở các địa điểm khác nhau(mỗi loại 5 mẫu) và tiến hành xác định theo phương pháp như mục 3.5.4. Kết quả thể hiện trên bảng 4.1, hình 4.1 và hình 1 phụ lục 2.
Bảng 4.1: Mức độ nhiễm TSVSVHK trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên Địa điểm Stt Mẫu Kết quả(CFU/ml) Tiêu chuẩn(CFU/ml) Kết quả 1 ST KPH 102 Đạt 2 PS KPH 102 Đạt 3 CO KPH 102 Đạt 4 OD KPH 102 Đạt 5 BD 101 102 Đạt 6 C2 KPH 102 Đạt 7 ST KPH 102 Đạt 8 PS KPH 102 Đạt 9 CO KPH 102 Đạt 10 OD KPH 102 Đạt 11 BD KPH 102 Đạt 12 C2 5×101 102 Đạt 13 ST 1,1×102 102 Không đạt 14 PS KPH 102 Đạt 15 CO KPH 102 Đạt 16 OD 1,1×102 102 Không đạt 17 BD KPH 102 Đạt 18 C2 1,3×102 102 Không đạt 19 ST 7×101 102 Đạt 20 PS 2,5×101 102 Đạt 21 CO 1,5×102 102 Không đạt 22 OD 102 102 Đạt 23 BD 3,2×101 102 Đạt 24 C2 102 102 Đạt
25 ST 1,6×102 102 Không đạt 26 PS KPH 102 Đạt 27 CO KPH 102 Đạt 28 OD 1,5×101 102 Đạt 29 BD 2,5×101 102 Đạt 30 C2 KPH 102 Đạt
Hình 4.1: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu TSVSVHK
Từ bảng 4.1, các kết quả thu được cho thấy:
Các loại nước giải khát thu thập tại chợ Thái, chợ Đồng Quang, chợ Nông Lâm: Trong tổng số 30 mẫu lấy và phân tích thì tỷ lệ nhiễm TSVSVHK quá giới hạn cho phép là 5/30 (17%) và 25 (83%) mẫu đạt giới hạn cho phép về TSVSVHKtrong nước giải khát không cồn theo QĐ 46/2007 - BYT.
Trong đó Pepsi và trà bí đao đạt 100% về giới hạn cho phép trong 1 số loại thực phẩm thông dụng theo QĐ 46/2007 - BYT, đạt 80% là Coca Cola, trà xanh O độ và trà xanh C2, Sting đạt 60% trong đó cao nhất là 1,6.102(CFU/ml) so với giới hạn cho phép.
Trên 3 địa điểm thu mẫu thì mẫu thu tại chợ Thái đạt 100% giới hạn cho phép về TSVSVHK theo QĐ 46/2007-BYT. Trong tổng số 12 mẫu thu tại chợ Thái có 2 mẫu dương tính nhưng không vượt quá chỉ tiêu cho phép.
Tổng 12 mẫu thu tại chợ Đồng Quang có tới 8 mẫu là dương tính trong đó có 4 mẫu vượt quá giới hạn cho phép, mức độ nhiễm TSVSVHK cao.
Tại chợ Nông Lâm tiến hành thu 6 mẫu, mỗi loại một mẫu, có 4 mẫu dương tính nhưng chỉ có một mẫu vượt quá chỉ tiêu. Mức độ nhiễm TSVSVHK thấp hơn so với mẫu thu tại chợ Đồng Quang.
4.1.2. Mức độ nhiễm Coliforms
Chúng tôi tiến hành xác định Coliforms theo phương pháp như mục 3.5.2 và tiến hành lấy mẫu nước giải khát phổ biến (mỗi loại 5 mẫu). Kết quả thể hiện trên bảng 4.2, hình 4.2 và hình 2 phụ lục 2:
Bảng 4.2. Mức độ nhiễm Coliforms trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên
Địa điểm
Stt Mẫu Kết quả(CFU/ml) Tiêu chuẩn(CFU/ml) Kết quả
Chợ Thái 1 ST KPH 10 Đạt 2 PS KPH 10 Đạt 3 CO KPH 10 Đạt 4 OD KPH 10 Đạt 5 BD KPH 10 Đạt 6 C2 KPH 10 Đạt 7 ST KPH 10 Đạt 8 PS KPH 10 Đạt 9 CO 9 10 Đạt 10 OD 15 10 Không đạt 11 BD KPH 10 Đạt 12 C2 KPH 10 Đạt Chợ Đồng Quang 13 ST 11 10 Không đạt 14 PS KPH 10 Đạt 15 CO KPH 10 Đạt 16 OD KPH 10 Đạt 17 BD KPH 10 Đạt 18 C2 KPH 10 Đạt 19 ST 4 10 Đạt 20 PS KPH 10 Đạt 21 CO 2×101 10 Không đạt 22 OD 9 10 Đạt 23 BD 9 10 Đạt 24 C2 9 10 Đạt Chợ Nông Lâm 25 ST KPH 10 Đạt 26 PS KPH 10 Đạt 27 CO KPH 10 Đạt 28 OD KPH 10 Đạt 29 BD 1,5×101 10 Không đạt 30 C2 KPH 10 Đạt
Hình 4.2: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu Colifroms
Kết quả bảng 4.2 cho thấy các loại nước giải khát thu tại thành phố Thái Nguyên: Trong tổng số 30 mẫu lấy và phân tích thì tỉ lệ nhiễm Coliforms quá giới hạn cho phép là 4/30 (13%) và 26/30 (87%) mẫu đạt giới hạn cho phép về
Coliforms trong 1 số loại thực phẩm thông dụng theo QĐ 46/2007 - BYT.
Trong đó loại nước Pepsi và trà xanh C2 đạt tỷ lệ 100% về tiêu chuẩn kỹ thuật theo QĐ 46/ 2007 - BYT. Các loại nước còn lại nhiễm với tỷ lệ nhỏ, đạt 80% tiêu chuẩn, nhiễm với số lượngcao nhất là 2×101 (CFU/ml).
Tổng số 12 mẫu thu thập tại chợ Thái có 2 mẫu dương tính nhưng chỉ có mẫu 10 – OD là vượt quá chỉ tiêu giới hạn cho phép về Coliforms.
Địa điểm chợ Đồng Quang, 12 mẫu có 6 mẫu dương tính, chiếm ½ mẫu thu thập tại đây, có 2 mẫu vượt quá giới hạn cho phép theo QĐ 46/2007 – BYT.
Tại chợ Nông Lâm tiến hành thu 6 mẫu có một mẫu dương tính và vượt qua giới hạn cho phép về Coliforms.
Mẫu nhiễm Coliforms cao nhất tại chợ Đồng Quang, cho thấy độ tin cậy về nguồn gốc, chất lượng nước giải khát ở đây không cao.
Mẫu nhiễm với lượng 2×101 (CFU/ml) đã vượt quá giới hạn cho phép, gây ảnh hưởng cho người tiêu dùng, nhưng tỷ lệ nhiễm này là rất ít, để nhận biết ngoài thị trường thì khó khăn. Do vậy cần chú trọng trong khâu chế biến bảo quản, tiêu thụ, kiểm tra phát hiện loại bỏ hàng giả, hàng kém chất lượng, đảm bảo VSATTP và uy tín cơ sở sản xuất.
4.1.3. Mức độ nhiễm E. coli
Để xác định khả năng nhiễm E.coli trong các mẫu thu thập được tiến hành xác định như phương pháp trong mục 3.5.3. Kết quả nuôi cấy mẫu trong canh thang Lauryl Sunfate và cấy chuyển mẫu sang canh thang EC và được thử Indol
Kết quả xét nghiệm E. coli trong 30 mẫu thực phẩm được lấy từ 3 địa điểm khác nhau tại thành phố Thái Nguyên thể hiện trong bảng sau. Kết quả nhiễm E. coli trong các loại thực phẩm tính trên 1g hay 1ml sản phẩm (giới hạn theo QĐ 46/2007 - BYT) thể hiện trên bảng 4.3 hình 4.3 và hình 2 phụ lục 2.
Bảng 4.3: Mức độ nhiễm E. coli trong nước giải khát tại thành phố Thái Nguyên
Địa
điểm Stt Mẫu quả(CFU/ml)Kết chuẩn(CFU/ml)Tiêu Kết quả
1 ST KPH 0 Đạt 2 PS KPH 0 Đạt 3 CO KPH 0 Đạt 4 OD KPH 0 Đạt 5 BD KPH 0 Đạt 6 C2 KPH 0 Đạt 7 ST KPH 0 Đạt 8 PS KPH 0 Đạt 9 CO KPH 0 Đạt 10 OD 4 0 Không đạt 11 BD KPH 0 Đạt 12 C2 KPH 0 Đạt 13 ST 3 0 Không đạt 14 PS KPH 0 Đạt 15 CO KPH 0 Đạt 16 OD KPH 0 Đạt 17 BD KPH 0 Đạt 18 C2 KPH 0 Đạt 19 ST KPH 0 Đạt 20 PS KPH 0 Đạt 21 CO 4 0 Không đạt 22 OD KPH 0 Đạt 23 BD KPH 0 Đạt 24 C2 KPH 0 Đạt Chợ 25 ST KPH 0 Đạt 26 PS KPH 0 Đạt 27 CO KPH 0 Đạt 28 OD KPH 0 Đạt 29 BD 7 0 Không đạt 30 C2 KPH 0 Đạt
Hình 4.3: Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu đạt và không đạt chỉ tiêu E. coli
Các loại nước giải khát thu từ thành phố Thái Nguyên: Trong tổng số 30 mẫu lấy và phân tích thì tỉ lệ nhiễm E. coli quá giới hạn là 4/30 (13%) và 26/30 (87%) mẫu đạt giới hạn cho phép về E. coli trong 1 số loại thực phẩm thông dụng theo QĐ 46/2007 - BYT.
Trong đó có loại Pepsi và trà xanh C2 đạt tỷ lệ cao 100% về tiêu chuẩn kỹ thuật theo QĐ 46/2007 - BYT, loại còn lại nhiễm với tỷ lệ thấp.
Mẫu thu tại chợ Thái có một mẫu dương tính và không đạt giới hạn theo QĐ 46/2007-BYT trong tổng số 12 mẫu.
Với tổng 12 mẫu thu tại chợ Đồng Quang có 2 mẫu dương tính vượt quá giới hạn cho phép E.coli trong nước giải khát không cồn.
Ở chợ Nông Lâm thu 6 mẫu thì có một mẫu dương tính vượt quá giới hạn theo QĐ 46/2007-BYT.
Đánh giá chung mức độ nhiễm E. coli tại các địa điểm thì chợ Đồng Quang có độ nhiễm cao nhất.
4.2. So sánh mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms,E. coli trong nước giải khát khát
Chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ nhiễm 3 loại TSVSVHK, Coliforms và E. coli để xác định trong tổng số 30 mẫu nước giải khát đã phân tích thì loại vi khuẩn nào có tỷ lệ nhiễm cao nhất. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4 và biểu đồ 4.4:
Bảng 4.4: Bảng kết quả so sánh tỷ lệ nhiễm VSV trong nước giải khát STT Chỉ tiêu so sánh Tổng số mẫu Số mẫu dương tính Tỷ lệ % Số mẫu âm tính Tỷ lệ % 1 TSVSVHK 30 16 53,3 14 46,7 2 Coliforms 30 10 33,3 20 66,7 3 E. coli 30 6 20 24 80
Hình 4.4: Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm VSV trong nước giải khát
Kết quả trên cho thấy: Tỷ lệ các mẫu nước giải khát nhiễm TSVSVHK là cao nhất đạt 53,3% tiếp theo là Coliforms 33,3% và tỷ lệ nhiễm thấp nhất là
E. coli 20%.
Như vậy có thể thấy rằng TSVSVHK có khả năng nhiễm lớn nhất trong các loại nước giải khát, nhưng nhìn chung tỷ lệ nhiễm các vi sinh vật trong
các loại nước đã tiến hành thử nghiệm là rất thấp, không vượt qua giới hạn cho phép theo QĐ 46/2007 - BYT.
4.3. So sánh các sản phẩm thử nghiệm không đạt tiêu chuẩn thực phẩm
Tỷ lệ phần trăm các mẫu thử nghiệm vượt quá chỉ tiêu cho phép được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 4.5: Kết quả xác định mức độ nhiễm TSVSVHK, Coliforms, E. coli
STT Kí hiệu sản phẩm Số mẫu kiểm tra
Tỷ lệ các loại VSV có trong các mẫu thử nghiệm vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế quy định
Coliforms E. coli TSVSVHK n % n % n % 1 ST 5 1 20 1 20 2 40 2 PS 5 0 0 0 0 0 0 3 CO 5 1 20 2 40 1 20 4 OD 5 1 20 1 20 1 20 5 BD 5 1 20 1 20 0 0 6 C2 5 0 0 0 0 1 20 Tổng số 30 4 13 4 13 5 17
Ở bảng trên n là ký hiệu số mẫu vượt quá giới hạn vi sinh vật cho phép. Từ bảng kết quả trên cho thấy tổng các mẫu thử nghiệm thì mẫu ST và CO có tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn vượt quá chỉ tiêu cho phép nhiều hơn các mẫu còn lại.
Mẫu ST có mức độ nhiễm vượt quá chỉ tiêu cho phép cụ thể là
Coliforms 20%, E. coli 20%, TSVSVHK 40%, đây là loại nước giải khát có mức độ nhiễm TSVSVHK cao nhất trong các loại nước giải khát đã tiến hành thử nghiệm.
Đối với CO thì mức độ nhiễm quá giới hạn là: Coliforms 20%, E. coli
40%, TSVSVHK 20%. Mẫu CO có mức độ nhiễm E. coli cao nhất trong các loại mẫu thử nghiệm.
Các mẫu OD, BD, C2 mức độ nhiễm vượt quá giới hạn thấp. Mẫu PS đạt 100% tiêu chuẩn theo QDD46/2007-BYT.
Hình 4.5. Biểu đồ so sánh tỷ lệ mẫu không đạt tiêu chuẩn thực phẩm
Chúng tôi chỉ xét đến Coliforms, E. coli, TSVSVHK. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm TSVSVHK là cao nhất trong 3 loại vi khuẩn.
Sự ô nhiễm này làm chúng ta hướng tới những điều kiện để vi khuẩn hiếu khí xâm nhập vào thực phẩm, tình trạng thực phẩm chưa được kiểm soát chặt chẽ.
Sự ô nhiễm này thể hiện tình trạng mất vệ sinh, điều kiện bảo quản và vận chuyển không thích hợp cũng là nguyên nhân gây nên sự phát triển của vi khuẩn.
Mức độ nhiễm các loại VSV Coliforms và E. coli chiếm tỷ lệ thấp không gây nguy hiểm cho con người.
Việc kiểm tra cần được tiến hành trên phạm vi với đầy đủ các chỉ tiêu