Xác định chỉ tiêu E.coli áp dụng theo TCVN 6846:2007 ISO 7251:2005 [1].
3.5.3.1. Nguyên tắc
Xác định số có xác suất lớn nhất của E. coli giả định theo bảng MPN ứng với số lượng ống dương tính trong môi trường (EC) và sinh indol trong nước pepton ở 44oC.
3.5.3.2.Môi trường và hóa chất
Môi trường được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn E. coli:
+ Canh thang Trypton lauryl sunfate
+ Canh thang EC: Dùng để cấy chuyển E. coli
+ Nước pepeton kiềm không chứa Indol
+ Thuốc thử Kovacs: Thử khả năng sinh Indol
3.5.3.3. Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử và pha loãng mẫu
Hút chính xác mỗi loại mẫu 5ml cho vào 45ml nước muối pepton. Lắc đều 2 - 3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối pepton. Lắc đều trong 2 - 3 phút, thu được dung dịch 10-2.
Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4.
Phương pháp tiến hành:
Bước 1: Nuôi cấy mẫu
- Sử dụng 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc Lauryl Sunfate. Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử vào từng ống nghiệm nói trên.
- Đối với mỗi độ pha loãng, lấy 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc, mỗi ống 1ml dung dịch. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng.
- Lắc đều mẫu thử với môi trường. - Ủ ấm ở 370C/24 – 48 h.
- Xác định số ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: làm đục canh thang và sinh hơi).
Bước 2: Cấy chuyển
- Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang EC, mỗi ống 1 ăng (tương ứng đậm độ mẫu thử).
- Lắc đề mẫu thử với môi trường. - Ủ ấm ở 440C/24 - 48h.
- Xác định số ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: làm đục canh thang và sinh hơi).
Bước 3: Cấy và ủ môi trường nước pepton
- Từ những ống dương tính ở bước 2, dùng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng sang những ống đựng nước pepton đã được làm ấm trước đến 44oC.
- Ủ ấm ở 440C/ 24 - 48 h. Bước 4: Kiểm tra sự sinh indol
- Thêm 0,5 ml thuốc thử indol vào các ống chứa nước pepton đã được ủ ở bước 3.
- Trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong ống nghiệm xuất hiện 1 vòng nhẫn màu đỏ chứng tỏ có mặt Indol.
Bước 5: Tính kết quả
Tính những ống dương tính với Indol ở mỗi đậm độ trong bước trên, và từ những ống dương tính đó tiến hành tra bảng MPN để xác định tổng số
9ml dung dịch pha loãng 45 ml dung dịch pha loãng 1ml 1ml 10-1 10-2 1ml 5ml mẫu 1ml 2-Nuôi cấy CT Lauryl Sulfat 1- Pha loãng mẫu
4 - Cấy và ủ môi trường nước pepton 5 - Kiểm tra sự sinh Indol và tính kết quả 3- Cấy CT EC 440C/24 – 48h 3- Thử nghiệm sinh Indol y chuyển
Hình 3.2: Sơ đồ phương pháp xác định tổng số E. coli trong thực phẩm theo phương pháp MPN