Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam

Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam

MỞ ĐẦU Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu dinh dưỡng. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loại enzym đã được thương mại hoá sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và thuộc da. Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ khoảng 2500 ha, với sản lượng hàng năm khoảng 100 nghìn tấn, có giá trị tương đương 4,5 triệu USD [6,34]. Đu đủ là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới mắc rất nhiều bệnh, trong đó bệnh đốm vòng do papaya ringspot virus (PRSV) gây ra là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng quả đu đủ. Bệnh được truyền do các loài rệp cây nên lan rộng rất nhanh chóng. Đến nay, toàn bộ diện tích trồng đu đủ ở nước ta cũng như các vùng khác trên thế giới như Australia [39], Thái Lan [46]. Hawaii [37,45]… đều bị nhiễm bệnh virus đốm vòng. Những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PRSV chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này, hơn nữa lại đòi hỏi nhiều thời gian và công sức. Gần đây, với việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh chuyển vào cây để tạo ra các cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đã thu được các kết quả đáng khích lệ, như đu đủ chuyển gen CP (coat protein) kháng PRSV đã được thương mại hoá trên thế giới [25], cây khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY (potato virus Y) [18] . Một trong những thách thức vẫn còn tồn tại là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Chẳng hạn các giống đu đủ chuyển gen CP của Hawaii hoàn toàn không có khả năng kháng lại các dòng PRSV của Việt Nam. Vì vậy, việc khảo sát tính đa dạng di truyền của gen chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Nghiên cứu về đánh giá tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam, Chu Hoàng Hà và cộng sự (2004) cho biết 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của Việt Nam có mức độ giống nhau về trình tự gen CP từ 89,7% đến 99,8%. Trong đó 4 dòng virus Tuyên Quang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ có tính đại diện cao nhất [4]. Trên cơ sở đó, 4 chủng PRSV trên đã được lựa chọn cho nghiên cứu “Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam” nhằm tìm hiểu sự đa dạng ở mức độ phân tử ở gen NIb của 1 cỏc dũng virus ny v to nguyờn liu cho nghiờn cu to cõy u chuyn gen khỏng PRSV Vit Nam. Chơng 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Giới thiệu chung về cây đu đủ 1.1.1. Phân loại Cây đu đủ (Carica papaya L.) thuộc ngành Mộc lan (hạt kín, Magnoliophyta), lớp Mộc lan (hai lá mầm, Magnoliopsida), phân lớp Sổ (Dilleniidae), liên bộ Hoa tím (Violananae), bộ Hoa tím (Violales), họ Đu đủ (Caricaceae) [11]. Carica l chi lớn nhất trong họ với 23 loài. 1.1.2. Nguồn gốc Mặc dù có ý kiến cho rằng nguồn gốc của C. papaya ở châu Mỹ nhiệt đới [32], nhng nó có thể bắt nguồn từ vùng đất thấp thuộc phía đông của Trung Mỹ, từ Mexico tới Panama [38]. Hạt của nó đợc phát tán tới Carribean và Đông Nam á nhờ những ngời thám hiểm Tây Ban Nha vào thế kỷ 16, từ đó nó đợc lan đi nhanh chóng tới ấn Độ, Thái Bình Dơng và châu Phi [44]. Đu đủ đã đợc trồng ở Việt Nam cách đây vài trăm năm và hiện nay đang đợc trồng phổ biến trong các vờn cây từ Bắc chí Nam [10]. Theo các nhà khoa học, những giống đu đủ đầu tiên nhập vào nớc ta bằng hạt vì hạt đu đủ vừa nhiều, vừa nhỏ, lại có thể bảo quản lâu. Bắt đầu từ khi những cha cố ngời Pháp, Tây Ban Nha khoảng thế kỷ 17, rồi sau này các chuyên gia nông nghiệp Pháp, Mỹ và nhiều quốc tịch khác, không ai biết bao nhiêu giống đu đủ đã vào Việt Nam. Đu đủ lại là giống cây ăn quả ngắn ngày thụ phấn ngoại hoa, nhiều biến dị. Nhiều giống đã hình thành từ địa phơng với các tên gọi không thống nhất [10]. 1.1.3. Giá trị sử dụng Trớc hết đu đủ là một loại thực phẩm thông dụng giàu dinh dỡng. Quả chín là một món ăn bổ dỡng có vị thơm ngon, chứa nhiều vitamin và muối khoáng (Bảng 1). Quả đu đủ có thể dùng làm rợu, mứt đờng, sấy khô và sắc đờng kính [44]. Quả xanh, lá và hoa có thể đợc sử dụng nh một loại rau ăn và chế biến một số món ăn truyền thống (nh hầm thịt vì trong quả và lá xanh có chứa nhiều enzym có tác dụng giống nh pepsin của dạ dày, nhất là giống trypsin của tụy trong việc tiêu hoá chất thịt, hay nấu cháo cùng thông thảo, ý dĩ và móng dò cho các phụ nữ đang cho con bú, hay chế biến món bún chả Hà Nội rất nổi tiếng ). Hơn nữa, đu đủ còn đợc sử dụng trong công nghiệp. Lá và quả xanh có chứa một số protein và alkaloid ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và dợc phẩm. 2 Trong đó papain là enzym thuỷ phân quan trọng nhất đợc sản xuất từ nhựa của quả non, xanh và đã đợc thơng mại hoá, sử dụng trong công nghiệp đồ uống, thức ăn, và dợc phẩm, bao gồm các sản phẩm keo dính, chỉ thị bia lạnh, làm mềm thịt, thuốc chữa bệnh tiêu hoá và chứng hoại th. Papain còn đợc sử dụng trong công nghiệp dệt để kéo tơ, làm mềm len và trong công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng, dầu gội đầu [39,44]. Bảng 1. Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (trên 100g) [43] STT Thành phần 100g quả chín 1 Năng lợng 35 59 cal 2 Nớc 88,40 90,70 g 3 Protein 1,00 1,50 g 4 Chất béo 0,10 g 5 Carbonhydrat 7,10 13,50 g 6 Canxi 11 31 mg 7 Photpho 7 17 mg 8 Sắt 0,60 0,70 mg 9 Natri 2 3 mg 10 Kali 39 337 mg 11 Caroten 1,16 2,43 mg 12 Vitamin B1 0,03 0,08 mg 13 Vitamin B2 0,70 0,15 mg 14 Vitamin B5 0,10 mg 15 Vitamin C 69,30 71,00 mg Đặc biệt đu đủ còn có tác dụng nh một vị thuốc. Papain có tính chất làm dễ tiêu hoá và giải độc. Nó làm triệt tiêu progesteron, một hormon sử dụng cần thiết chuẩn bị cho tử cung thụ thai và duy trì sự sống cho bào thai sau đó. Hạt đu đủ chứa myrosin và kali myronat khi kết hợp với nhau tạo thành tinh dầu mùi diêm sinh hắc. Quả xanh chỉ đợc chỉ định dùng trong chứng thiểu năng tiêu hoá, dạ dày và tụy, trong sự giảm dịch vị hay sự lên men dạ dày, trong viêm dạ dày mãn tính, lên men ruột và viêm dạ dày ruột non của trẻ em. Hạt thờng dùng làm thuốc trị giun. Rễ dùng trị sốt rét và làm thuốc lợi tiểu. Lá dùng tiêu mụn nhọt, lá nấu nớc dùng tẩy sạch vết máu ở vải và rửa vết loét, vết thơng, sát trùng. Nhựa bôi mặt nạ bị tàn nhang và các vết nhơ khác ở da, hắc lào mới phát, các loại lở sần da ngoan cố. Hoa đực dùng trị ho gà [2]. Nh vậy đu đủ rất có ích cho con ngời, có thể sử dụng ở tất cả các phần, từ hoa, quả, lá, rễ cho đến nhựa cây. 3 1.1.4. Năng suất, chất lợng Sản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm. Mỗi kilôgam quả chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 250 - 350 tỉ đồng (khoảng 15 -20 triệu đôla Mỹ) [34]. Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5 triệu tấn, đạt giá trị khoảng 1,5 đến 2 tỉ đôla Mỹ [34]. Bảng 2. Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc [12] Nớc sản xuất Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn) 1989-1991 1995 1996 1997 Thế giới 3625 5091 5011 5024 + châu Phi 786 780 786 780 + Bắc Mỹ 404 591 599 599 + Nam Mỹ 1263 2029 2090 2105 + châu á 1156 1610 1518 1520 - Indonexia 342 597 500 500 - ấn Độ 399 490 500 500 - Trung Quốc 94 142 143 143 - Thái Lan 100 120 115 115 - Việt Nam 54 57 58 61 1.1.5. Phân bố Bảng 3. Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam STT Vùng phân bố Diện tích (ha) 1 Vùng núi và Trung du phía Bắc (Sơn La, Lạng Sơn) 500 2 Đồng bằng sông Hồng (Hà Nội, Hng Yên, Nam Hà, Ninh Bình) 250 3 Ven biển miền Trung (Nghệ An, Thanh Hoá) 100 4 Đồng bằng sông Mê Kông (Ninh Thuận, Nha Trang, Tây Ninh, Tiền Giang) 500-550 Đu đủ đợc trồng ở tất cả các nớc nhiệt đới và nhiều vùng cận nhiệt đới trên thế giới [39]. ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà (từ 5 đến 10 cây) của gần 50% hộ nông dân. Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trại 4 vùng đồng bằng sông Hồng, ven biển miền Trung, đồng bằng sông Mê Kông và sờn núi đá vôi. Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập trung (Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà [34]. 1.1.6. Bệnh ở cây đu đủ - Bệnh đốm vòng: Còn gọi là bệnh đốm hình nhẫn là một bệnh rất phổ biến trên cây đu đủ ở nớc ta và nhiều nớc khác trên thế giới, đợc coi là một trở ngại lớn nhất cho nghề trồng đu đủ. Có thể nói ở đâu có trồng đu đủ là ở đó có bệnh này. Bệnh do papaya ringspot virus gây ra. Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản lợng quả bị giảm, lá bị khảm và biến dạng, tạo đốm có dạng nh một cái vòng màu xanh mờ trên quả, cuống lá hay tạo các sọc xanh trên ngọn thân và cuống lá. ở quả khi chín, các vòng lộ rõ có màu vàng, quả bị nhạt, do virut đã làm giảm lợng đờng trong quả. ở mặt trên của các lá gần đỉnh sinh trởng, vùng mô lá ở giữa gân phụ và gân nhánh bị nhăn phồng. Bìa lá non bị cuốn vòng vào theo mặt dới lá. Bìa lá già thì cuốn lên [5]. - Bệnh khảm: do papaya mosaic virus gây ra. Giống nh bệnh đốm vòng, bệnh khảm cũng là một bệnh rất phổ biến trên cây đu đủ. Cây bệnh có lá bị khảm gồm nhiều vết xanh vàng lẫn lộn, khảm càng nặng, lá càng biến sang màu vàng. Lá bệnh bị nhỏ lại, biến dạng, số thuỳ lá gia tăng, nhăn phồng. Lá bị rụng nhiều, chỉ trừ lại chùm lá bị khảm vàng ở ngọn. Quả nhỏ biến dạng, chai sợng [5]. - Bệnh thối gốc: do nấm Pythium spp gây ra, làm cho lá vàng và quả bị rụng, gốc thân nơi tiếp giáp mặt đất bị úng rồi thối, cây sẽ bị đổ và chết. 5 Hình 1. A: Hình ảnh cây đu đủ không nhiễm bệnh. B,C,D: Hình ảnh vườn, cây, lá đu đủ bị nhiễm PRSV. - Bệnh cháy lá: do nấm Helminthosporium gây ra, làm chóp lá bị đốm úng n- ớc, rồi lan dần vào bên trong lá, làm lá bị nâu và khô. Nếu nhiễm nặng, cuống lá bị héo, mềm và lá bị rụng [5]. - Bệnh đốm lá: do nấm Phyllosticta sulata gây ra. Trên lá đốm bệnh có hình tròn, hình trứng hoặc thon dài hay bất dạng. Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng, viền có màu vàng hay nâu, vùng bệnh khô và mỏng dần rồi bị tách [5]. - Bệnh phấn trắng: do nấm Odium caricae gây hại. Lá bệnh bị đóng phấn màu trắng ở mặt dới, nếu nặng lá sẽ phát triển kém, biến dạng ít. Quả cũng bị các đốm phấn trắng tròn hoặc bầu dục và phát triển kém. - Bệnh thối quả: do nhiều loại nấm (Rhizopus, Colletotrichum, Ascochyta, Botryodiplodia, Phomopsis, Macrophoma, Fusarium, Alternaria) gây các triệu chứng khác nhau [5]. - Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis): phá hại rễ. Cây con nhiễm nặng có thể bị chết và cây lớn có thể giảm sức tăng trởng, có thể dùng các thuốc trị tuyến trùng nh Mocap tới xung quanh vùng rễ [5]. 1.2. Giới thiệu về virut gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV) 1.2.1. Phân loại PRSV là virut thực vật, thuộc chi potyvirus, họ potyviridae [29]. PRSV đợc chia thành hai chủng dựa trên khả năng lây nhiễm của chúng là: PRSV-w và PRSV- p. PRSV-p là virut phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất tới đu đủ và bầu bí khắp thế giới, còn PRSV-w chỉ ảnh hởng tới họ bầu bí, nhng trên thực tế không tìm thấy PRSV-P trên cây bầu bí, mà chỉ tìm thấy qua các thí nghiệm [18]. PRSV đợc tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1949 khi phân lập virut từ đu đủ Hawaii và sau đó đợc tìm thấy ở nhiều nớc khác trên thế giới [30]. Hai chủng này có quan hệ rất gần gũi với nhau, có thể PRSV-p tiến hoá từ PRSV-w do đột biến [16]. 1.2.2. Cấu trúc PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, với chiều dài trọn vẹn 760-800nm, đờng kính 12nm (Hình 2). Virion chứa 5,5% axit nucleic là một sợi ARN đơn dơng liên kết với protein (VPg) ở đầu 5 và có đuôi poly(A) đầu 3 [19,29]. 6 Hình 2. Cấu trúc của PRSV A: PRSV dưới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài Hệ gen của PRSV dài khoảng 10326 nucleotit, ngoại trừ đầu poly(A), và chứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotit 86-88 và kết thúc ở vị trí 10118-10120, mã hoá cho một polyprotein với 3344 axit amin [24]. Polyprotein này đợc tự thuỷ phân tạo 12 protein trong đó có protein NIb, là enzym polymerase cần thiết cho sự tái bản của ARN virut. Trình tự bảo thủ cao AAAUAAAANANCUCAACACAUA ở đầu 5 của PRSV cũng đóng vai trò quan trọng cho sự tái bản của potyvirus. Tổ chức gen của PRSV đợc đa ra tạm thời là VPg-5 leader-63K NT-52K HC-Pro-46K-72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35K coat protein- không mã hóa 3- vùng poly(A) (Hình 3) [48]. Hình 3. Bản đồ tổ chức genom của PRSV 1.2.3. Đặc tính gây bệnh PRSV gây bệnh không truyền qua hạt giống, chúng lây bằng hai cách: Một là do tiếp xúc cơ giới (thông qua các vết thơng cơ giới do trong quá trình canh tác con ngời vô ý tạo ra, do ma gió gây xây sát hay do côn trùng hay động vật khác). Hai là do côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae nh Aphis gosipii, Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thờng gây hại nhiều cho các loại rau cải, bầu bí, mớp, da . Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là những cây đợc 5-6 tháng tuổi trở lên [13]. 1.3. Gen NIb của PRSV 1.3.1. Cấu trúc của gen NIb Gen NIb (nuclear inclusion body) nằm giữa gen NIa và gen CP, có kích thớc khoảng 1554 bp, nằm từ vị trí nucleotit 7646 đến 9199. 7 1.3.2. Vai trò của protein NIb Protein NIb là ARN polymerase phụ thuộc ARN (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) của virut, chịu trách nhiệm tái bản phân tử ARN dơng và âm của virut [20]. Có một vài dẫn chứng thực nghiệm trực tiếp về protein NIb potyvirus: Thứ nhất, đặc điểm trình tự nổi bật nhất của protein NIb là một motif glycine-aspartate-aspartate (GDD) đặc trng cho phần lớn virut ARN ở vi khuẩn, động vật và thực vật [32]. Khi so sánh trình tự RdRp của virut ARN dơng và phân tích sự tiến hoá của nó có thể phân loại tất cả các virut thành lớp, bộ, họ và chi [32,33,17]. Thứ hai, gần đây ngời ta đã chứng minh đợc protein NIb có hoạt động RdRp [36]. Họ cũng đã tìm thấy protein NIb có t- ơng tác với cả protein NIa và CP trong tế bào nấm men. Protein NIb tơng tác với vùng VPg của protein NIa và tơng tác này đòi hỏi một vị trí gắn ARN chức năng. Tơng tác này có thể quan trọng cho việc kích thích tổng hợp ARN virut trong các tế bào nhiễm. Hoạt động polymerase của protein NIb có thể đợc kích thích bởi protein NIa và VPg. T- ơng tác protein CP với NIb có khả năng thay đổi motif GDD. Vai trò của tơng tác này tới hoạt động enzym của protein NIb hoặc chức năng của CP cha rõ ràng, nhng có thể cần thiết cho việc tổng hợp ARN trong tế bào nhiễm virut [22,27]. Ngoài chức năng RdRp, protein NIb của TEV (tobacco etch virus) còn có những chức năng khác, bao gồm những hoạt động dịch chuyển nhân [35]. NIb chứa hai dấu hiệu định vị nhân độc lập (NLS I và NLS II). NLS I nằm ở vị trí axit amin 1 tới 17, và NLS II nằm giữa axit amin 292 và 316. Đột biến điểm cộng gộp dẫn đến thay thế những gốc cơ bản trong các NLS, làm mất hoạt động dịch chuyển nhân. Những đột biến này cũng làm mất sự khuếch đại ARN TEV khi đợc đa vào genom của virut. Việc mất khả năng khuếch đại là do mỗi đột biến NLS đợc bổ sung vào sự dịch chuyển (in trans) các tế bào truyền tin biểu hiện protein NIb chức năng. Điều này chứng tỏ các NLS chồng lớp cần thiết cho chức năng dịch chuyển-hoạt động của NIb. Thực tế chức năng in trans của NIb có nghĩa là nó phải tơng tác với một hoặc nhiều thành phần khác của bộ máy sao chép của genom. Đột biến điểm cộng gộp ảnh hởng motif GDD hoặc NLS II trong vùng trung tâm của protein NIb, nhng không phải đột biến nào cũng ảnh hởng tới NLS I gần đầu N, làm giảm hoặc mất tơng tác. Vùng C-terminal proteinase (Pro) của NIa, chứ không phải vùng N-terminal VPg, tơng tác với NIb. Tác động của những đột biến NIb trong vùng NLS I, NLS II, và motif GDD tới tơng tác giữa NIb và Pro-domain giống với ảnh hởng của những đột biến này tới t- ơng tác giữa chiều dài đầy đủ của NIb và NIa [36]. NIb điều khiển quá trình tái bản phức tạp thông qua một tơng tác với Pro-domain của NIa. RdRp cần thiết cho sự sao chép genom của virut. RdRp cùng các thành phần khác của virut và tế bào chủ, tạo thành một phức hợp sao chép thực hiện quá trình tái 8 bản genom virut. RdRp đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn sớm của sự tái bản virut và làm tăng khả năng ức chế của enzym này, đợc xem nh chìa khoá tổng hợp một phân tử đặc biệt, ví dụ scFv ức chế hoạt động enzym RdRp. Nói cách khác, việc ngăn hay ức chế hoạt động RdRp có thể phá vỡ sự tái bản của virut ở giai đoạn sớm hiệu quả hơn [26]. 1.4. Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virut PRSV là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn tới năng suất và chất lợng cây đu đủ và nhiều loại cây trồng khác có giá trị ở Việt Nam cũng nh thế giới. Vì vậy, trên thế giới đã có rất nhiều nơi nghiên cứu về PRSV. Một số gen của PRSV nh gen CP đã đợc nghiên cứu rất kỹ và đã chuyển vào cây để tạo cây đu đủ chuyển gen. Nổi bật là phòng thí nghiệm tại trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ. Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnh đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng kháng bệnh virut. Các nhà khoa học ở đây đã đa gen CP của dòng virut PRSV HA 5-1 vào vectơ pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn gen, tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy chúng có tính kháng bệnh rất cao (chỉ có 5% của 128 cây đ- ợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virut phân lập ở Hawaii, nhng không kháng đợc các dòng phân lập từ nơi khác. Dòng 55-1 này đã đợc lai với giống Kapoho tạo ra giống đu đủ "Rainbow" đã đợc đăng ký bản quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại hoá đầu tiên trên thế giới có khả năng kháng lại PRSV [9]. Ngoài ra, gen NIb của PRSV cũng đợc quan tâm nghiên cứu. Đã có nhiều nớc phân lập và xác định trình tự gen NIb nh ở Thái Lan, Poonpipit và cộng sự (2001) đã phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1596bp [40]; ở Trung Quốc, Ye và cộng sự (2002) phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1600bp [47] . Nhng hiện nay việc nghiên cứu chuyển gen NIb vào cây đu đủ để tạo cây kháng bệnh vẫn còn đang đợc tiếp tục tiến hành, cha có giống thơng phẩm nào đợc đa ra thị trờng. Tuy nhiên, đã có nhiều cây trồng chuyển gen NIb kháng virut gây bệnh khác nhau trên thế giới đợc tạo ra nh cây đậu, cây thuốc lá, cây khoai tây . Năm 1998, Jones và cộng sự đã tạo ra đợc ba dòng đậu chuyển gen NIb kháng PSbMV (pea seed-borne mosaic potyvirus), trong đó dòng PSbMV-DPD1 biểu hiện tính kháng cao ngay lần nhiễm đầu tiên. Theo ông, tính kháng của cây đậu phụ thuộc vào mật độ của virut nhiễm trên cây và số bản copy của gen NIb [31]. Khoai tây cũng là đối tợng cây trồng đợc nghiên cứu nhiều về chuyển gen NIb kháng các loại virut khác nhau nh PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus) . Năm 2004, Schubert và cộng sự đã tạo ra đợc cây khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY trong nhà kính 9 [18,21]. ở cây thuốc lá, Suzuki và cộng sự cũng đã chuyển gen sao chép ARNs 1 và 2 của CMV (cucumber mosaic virus) thành công tạo ra những dòng thuốc lá V1 và V2, sau đó đem lai hai dòng này với nhau tạo ra dòng V1V2. Kết quả là dòng V1V2 có tính kháng cao hơn so với dòng V1 và V2 [41]. 1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu bệnh virut 1.5.1. Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng sao mã ngợc (reverse transcription) và PCR để nhân lên một đoạn gen quan tâm từ ARN (Hình 4). Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn: - Tổng hợp sợi cADN thứ nhất: Nguyên lý của phơng pháp này là sử dụng enzym sao mã ngợc (reverse transcriptase) để tổng hợp nên sợi cADN thứ nhất từ ARN. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại ARN đợc sử dụng khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật bậc cao mà không có intron thì ngời ta thờng tổng hợp cADN từ mARN với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật bậc thấp nh vi khuẩn, virut . ngời ta có thể tổng hợp cADN từ ARN tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân lên. Khi mồi gắn bổ sung với sợi ARN khuôn enzym sao mã ngợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cADN từ các nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cADN chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đợc lợng cADN tơng ứng với lợng ARN khuôn ban đầu. Để tăng hiệu quả của quá trình tổng hợp, lợng mồi đợc cho vào lớn hơn rất nhiều lợng ARN khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đợc đa vào để bảo vệ cho ARN khỏi bị cắt bởi RNase. - Khuếch đại gen bằng PCR: 10 [...]... ứng tự đóng vòng) 4) Biến nạp plasmit vào tế bào E.coli DH5 23 5) Tách dòng và xác định trình tự 2.2.10 Phơng pháp xử lý trình tự gen thu đợc Sử dụng chơng trình phần mềm DNAstar để phân tích, so sánh trình tự gen thu đợc Các bớc tiến hành nh sau: + So sánh trình tự gen đợc đọc từ hai đầu xuôi và đầu ngợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen + Xác định đợc vị trí, số lợng các enzym hạn chế trên. .. tính Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kết quả xác định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng Chơng 2 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu Nghiên cứu về đánh giá tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP) cho thấy 16 dòng PRSV phân lập... tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP), Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4), pp 451-459 5 Nguyễn Thành Hối, Dơng Minh (2003), Kỹ thuật trồng đu đủ, NXB Nông nghiệp 6 Vũ Công Hậu (1996), Trồng cây ăn quả ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 7 Lê Đình Lơng, Phan Cự Nhân (1997), Cơ sở di truyền... trên trình tự ADN + Giải mã trình tự nucleotit sang trình tự axit amin theo một trong các khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu và kết thúc dịch mã + Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tơng đồng di truyền của 4 trình tự nucleotit của 4 dòng gen NIb thu đợc với nhau và với trình tự gen NIb của các PRSV từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới đã đợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen. .. M: Thang ADN 1Kb; Số 1-5: TQ; Số 6-10: KT; Số 11-15: CT; Số 16-20: SG 3.4 Kết quả xác định trình tự nucleotit Sản phẩm plasmit đã tinh sạch đợc xác định trình tự trên máy đọc tự động ABI PRIMSđ 3100 Avant Genetic Analyzer Kết quả đọc cả hai chiều foward 3.5 kết quả so sánh trình tự 3.4.1 So sánh sự giống nhau của gen NIb ở mức độ nucleotit 3.4.2 So sánh sự giống nhau của gen NIb ở mức độ axit amin... pháp subclone (tách dới dòng) Đoạn gen cần xác định trình tự có chiều dài khoảng 2000bp, nếu đọc hai chiều thì chỉ đợc 1500-1600bp Một đoạn khoảng 400-500bp vẫn không xác định đợc trình tự Do đó, cần phải tiến hành subclone thì mới xác đình đầy đủ trình tự đoạn gen này Muốn tiến hành subclone trớc hết phải xác định trình tự một chiều nào đó của trình tự gen, sau đó xác định các vị trí cắt của các enzym... 31 trình bày ở hình 10 Kết quả điện di trên hình 10 cho thấy sản phẩm tách plasmit rất sạch, đảm bảo chất lợng và số lợng để tiến hành đọc trình tự và subclone 3.4.5 Kết quả xác định chiều đoạn gen gắn vào vectơ Để đọc trình tự chính xác, chúng tôi tiến hành xác định chiều của đoạn gen gắn vào vectơ nh đợc trình bày ở mục 2.2.7 Nếu đoạn gen gắn vào cùng chiều, thì sản phẩm PCR với cặp mồi pUC18-F1 và. .. microgam ADN vào thí nghiệm Thờng trên thực tế với 1 microgam ADN ngời ta tạo ra đợc 106 đến 107 tế bào biến nạp [8] 1.5.4 Kỹ thuật tách dòng Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này [7] Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm Đầu tiên, ADN ngoại lai đợc nối vào một vectơ... của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech + Thiết bị Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy làm khô ADN (Speed Vac), máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác 2.2 Phơng pháp nghiên cứu Thu thập mẫu PRSV Khai thác trình tự trong NCBI Tách ARN tổng số Thiết kế mồi Nhân gen NIb bằng RT-PCR Tách dòng gen Xác định và so. .. Lơng (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 9 Lâm Đại Nhân (2000), Phân lập và thiết kế gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệng đốm vòng đu đủ ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên , Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nhiều tác giả (2002), Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây ăn quả, NXB Thanh Hoá 11 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (2004), Hệ thống . dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP) cho thấy 16 dòng. trên đã được lựa chọn cho nghiên cứu Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây