Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

MỞ ĐẦU

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi

ở nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao Quả cà chua ngoài tác dụng làmcác món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước giải khát và những dạng thực phẩm chếbiến cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và chất khoáng, còn có tác dụng chữa bệnhthiếu vitamin C, bệnh về tim mạch, ung thư Diện tích trồng cà chua liên tục tănglên trong những năm gần đây Từ năm 1990 đến 2002 diện tích cà chua trên thế giới

từ 2,8 triệu ha tăng lên 3,7 triệu ha và sản lượng từ 76 triệu tấn tăng lên 100 triệutấn Ở Việt Nam, năm 1996 diện tích trồng cà chua khoảng 8 nghìn ha thì đến năm

2001 lên đến 18 nghìn ha, đóng góp hàng trăm tỉ đồng vào nền kinh tế quốc dân [1]

Năng suất cà chua bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân như: giống,điều kiện canh tác, chế độ chăm sóc, bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng Trong đóbệnh do vi rút được xác định là tác nhân gây hại nghiêm trọng Bệnh do vi rútkhông những làm giảm năng xuất mà còn làm giảm chất lượng của sản phẩm Xoăn

lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV) gây ra là bệnh phổ biến

và gây thiệt hại nặng nề nhất ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [24]

Việc sử dụng các biện pháp canh tác, cách li vùng bị bệnh, loại bỏ cây bịbệnh, phun thuốc trừ sâu để phòng trừ bệnh vi rút vừa hiệu quả thấp vừa gây ảnhhưởng đến cây trồng, môi trường và cả con người Những biện pháp này chỉ làmgiảm sự lan truyền của bệnh và mang tính chất phòng chứ không thể ngăn chặnbệnh một cách triệt để Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học, tạocây chuyển gen kháng lại vi rút được coi là một biện pháp hữu hiệu nhất để ngănchặn và hạn chế tác hại do vi rút gây ra đồng thời đáp ứng yêu cầu phát triển mộtnền nông nghiệp sạch và bền vững Vấn đề đặt ra là các giống cây chuyển genthường có tính kháng đặc hiệu Các giống cây chuyển gen được tạo ra bằng cách sửdụng các vật liệu di truyền từ các vi rút gây bệnh (gen CP, gen mã hoá replicase )chỉ kháng lại được các dòng vi rút gây bệnh có gen được sử dụng để tạo cây chuyểngen hoặc là các dòng vi rút có quan hệ di truyền gần gũi Xuất phát từ thực tế trên,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá tính đa dạng của các virus

gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh

trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ” với mục đích thu được hiểu biết sâu

sắc ở mức độ di truyền phân tử của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua của ViệtNam từ đó làm cơ sở cho việc hoạch định các chiến lược thích hợp cho nghiên cứu

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Đặc điểm phân loại, nguồn gốc, sự phân bố và giá trị sử dụngcủa cây Cà chua

1.1.1 Phân loại

Cà chua thuộc họ Cà (Solanaceae), chi Lycopersicon Chi này gồm 12 loài,

tất cả đều có nguồn gốc từ châu Mĩ Đã có nhiều tác giả đa ra các hệ thống phân loạicho cà chua, nhng cho đến nay hệ thống phân loại của Breznep (1955) đợc sử dụng

rộng rãi và đơn giản nhất [21] Chi Lycopersicon có 2 chi phụ:

- Chi phụ Eriopersicon: quả luôn xanh, có sọc tía, có lông, hạt nhỏ Chi này có

5 loài hoang dại:

Lycopersicon hisrutum Humb Lycopersicon peruviarum Mill Lycopersicon cheesmanii Lycopersicon chilense Lycopersicon glandulosum

- Chi phụ Eulycopersicon: quả chín đỏ hoặc vàng, hoa to Chi này có 2 loài:

Lycopersicon esculentum: cà chua thông thờng Lycopersicon pimpinellifolium: cà chua bán hoang dại

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua anh đào (L esculentum var.

cerrasiforme) đợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Mĩ Từ châu Mĩ, cà

chua đợc các thơng gia Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha đa sang trồng ở châu Âu, châu

á Từ châu Âu, cà chua đợc chuyển sang châu Phi nhờ những thực dân đi khai pháthuộc địa ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua đợc ngời Pháp dunhập vào và nó đã nhanh chóng trở thành một loại rau quả phổ biến và đợc achuộng Hiện nay, cà chua đợc trồng ở hầu hết các tỉnh, trong đó diện tích trồng tậptrung chủ yếu ở các tỉnh Hng Yên, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hà Tây, Nam Định, v.v…[1]

Trong quả cà chua chín có nhiều chất dinh dỡng nh: đờng, vitamin A, vitamin

phần hoá học trong quả cà chua chín gồm có: nớc (94-95%), chất khô (5-6%), trong

đó: 55% đờng, 21% chất không hoà tan trong rợu (nh protein, xenlulôzơ, pectin,polisaccarit), 12% axit hữu cơ (nh xitric, malic, galacturonic, pirolidoncacboxilic),7% chất vô cơ và 5% các chất khác (nh carotenoit, axit ascorbic, chất dễ bay hơi,

Cà chua không những đợc dùng nh rau cung cấp vitamin, chất khoáng màcòn có nhiều tác dụng về mặt y học Trong cà chua có chất licopen (thành phần tạomàu đỏ của cà chua) có khả năng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch Theo VõVăn Chi (1997), quả cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng tạo năng lợng, làm

dụng 100-200 g cà chua sẽ thỏa mãn nhu cầu vitamin và chất khoáng cần thiết [3]

1.2 Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút

1.2.1 Đặc điểm của bệnh xoăn lá cà chua do vi rút

Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl) rất phổ biến ở khu

vực Đông Nam châu á, các nớc Trung Cận Đông và Đông Phi Đây là một trongnhững bệnh do vi rút gây thiệt hại nặng nề nhất cho cà chua Theo thống kê củaPolston và Anderson (1997), từ năm 1988 đến năm 1995, bệnh đã làm giảm 5% đến95% sản lợng cà chua ở nớc Cộng hòa Dominica, Venezuela và một số nớc ở Trung

Mĩ, làm thiệt hại cho nền kinh tế tổng cộng 140 triệu đô la Mĩ [28] Bệnh lan truyền

qua vật truyền trung gian là loài bọ phấn (Bemisia tabaci)

Bọ phấn chích hút nhựa cây chủ yếu ở ngọn và lá non, mang TYLCV [4].

Cây bị bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, làm cho lá co quắt, cây thấp nhỏ, hoa pháttriển kém, dễ bị rụng Cây còn nhỏ nếu bị nhiễm bệnh sẽ còi cọc, không thể pháttriển [8]

ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua do vi rút phát triển mạnh trong vụ cà chua

rộ, mật độ bọ phấn trên một cây tăng dẫn đến tăng khả năng truyền bệnh [8]

1.2.2 Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua

1.2.2.1 Đặc điểm phân loại

Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) thuộc họ Geminiviridae, chi Begomovirus Dựa vào sự tơng đồng về trình tự nucleotit, tác nhân truyền bệnh và phổ vật chủ, họ Geminiviridae đợc chia thành bốn chi: Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus và Topocuvirus [37] Trong đó

Begomovirus là chi có số lợng loài lớn nhất trong họ, tác nhân truyền bệnh là bọ

phấn (Bemisia tabaci), vật chủ là cây 2 lá mầm nh: đậu, da hấu, bông, hồ tiêu, thuốc

một vòng ADN sợi đơn, hệ gen của các loài trong chi Begomovirus tìm thấy ở châu

Mĩ có thể gồm hai vòng ADN sợi đơn Trong khi đó, hệ gen của những loài tìm thấy

ở châu á, châu âu và châu Phi có thể có một vòng hoặc hai vòng ADN sợi đơn [36]

1.2.2.2 Đặc điểm cấu tạo

Geminivirus đợc Goodman mô tả lần đầu tiên vào năm 1977 TYLCV có

dạng hình chày, kích thớc khoảng 18 nm x 30 nm Lớp protein vỏ có trọng lợng

b)

c)

Hình 2 Biểu hiện hình thái của bệnh xoăn lá trên cây cà chua

a) Cây đối chứng không bị bệnh; b) Cây bị nhiễm bệnh xoăn lá; c) Ruộng cà chua bị

bệnh xoăn lá

khoảng 28-34 x 103 đvc gồm 22 capsom giống nhau, mỗi capsom gồm 5 phân tửprotein vỏ [25].

TYLCV lần đầu tiên đợc phân lập hoàn chỉnh vào năm 1991 ở Sardinia [19]

và Israel [26] Hệ gen gồm một vòng ADN sợi đơn, có kích thớc khoảng 2,8 Kb,gồm sáu gen nằm trong hai vùng dịch mã ngợc chiều, ngăn cách bởi một vùng liên

gen có khoảng 300 nucleotit Họ Geminiviridae có vùng khởi đầu sao chép nằm

trong vùng liên gen đều có trình tự là TAATATTAC (vùng có dấu chấm đen) [25], [37]

Bốn gen: C1, C2, C3, C4, có chiều dịch mã ngợc chiều với hai gen V1 và V2.Trong đó gen V1 mã hóa loại protein cần thiết cho sự tạo vỏ ngoài genom, sự lantruyền và nhận ra vectơ truyền nhiễm ; gen C1 mã hóa loại protein cần thiết cho quátrình sao chép của cả hai vùng dịch mã ; gen C2 mã hóa protein có vai trò hoạt hóaquá trình phiên mã gen V1 và V2 ; gen C3 mã hóa loại protein có tác dụng hoạt hóa

Hình 4 Cấu trúc hệ gen của TYLCV có một vòng ADN sợi đơn [25]

Hình 3 ảnh chụp vi rút xoăn lá cà chua dới kính hiển vi điện tử [17]

rút ; gen C4, V2 mã hóa protein liên quan đến sự gây bệnh đối với thực vật và sự vậnchuyển của vi rút [37].

1.2.2.3 Sự đa dạng về hệ gen của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua

Bởi những thiệt hại nghiêm trọng do TYLCV gây ra, nghiên cứu về TYLCV

đợc nhiều nớc quan tâm nh: Thái Lan, Australia, Trung quốc, Brazil, Mĩ, ấn Độ, Đài

ADN sợi đơn ngời ta còn phát hiện ra loại vi rút có hai vòng ADN sợi đơn kí hiệu làvòng ADN-A và vòng ADN-B [15], [27] Trong đó, vòng ADN-A gồm các gen mãhoá protein cần thiết cho sự sao chép và lắp ráp của vi rút, còn vòng ADN-B gồmcác gen mã hoá protein cần thiết cho sự lan truyền của vi rút [36]

Có loại vi rút cũng có hai vòng ADN sợi đơn, một là vòng ADN-A còn vòngthứ hai không phải là vòng ADN-B mà vòng ADN-B đợc thay thế bằng một vòngADN vệ tinh, gọi là vòng ADN-beta [20] Trình tự nucleotit của vòng ADN-beta đợcphân lập ở những vùng khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Ngời ta còn thấy rằng, vớinhững cây cà chua bị nhiễm TYLCV có vòng ADN-beta thì biểu hiện bệnh nặnghơn cây nhiễm TYLCV không mang vòng ADN-beta [40] Chowda Reddy và cộng

sự (2005) đã tiến hành thí nghiệm với 103 mẫu cà chua từ những vùng trồng cà chuachính ở ấn độ, có 81 mẫu cho kết quả dơng tính với vi rút TYLCV Trong đó 65mẫu, hệ gen vi rút gồm hai vòng ADN sợi đơn, một vòng là ADN-A, vòng thứ haihoặc là vòng ADN-B hoặc là vòng ADN-beta [13] Li và cộng sự (2004) đã tiếnhành thí nghiệm với 14 mẫu cà chua thu từ ba huyện trong tỉnh Vân Nam, TrungQuốc Cả 14 mẫu đều cho kết quả dơng tính với TYLCV và những chủng TYLCVnày thuộc vào bốn nhóm khác nhau Nhóm I và III hệ gen đều có vòng ADN-beta.Khi phân lập hoàn chỉnh trình tự nucleotit vòng ADN-beta với ba mẫu ở nhóm III,thì ngời ta thu đợc những trình tự ADN-beta khác với những vòng ADN-beta công

Hình 5 Cấu trúc hệ gen của TYLCV gồm hai vòng ADN sợi đơn [30]

của chủng vi rút TYLCV có một vòng ADN sợi đơn Qua kết quả so sánh cho thấytrình tự nucleotit của chủng vi rút phân lập giống nhất là với TYLCTwV (TYLCV ở

Đài Loan) (76%), so với các chủng vi rút khác thì chúng có sự khác nhau tơng đối[32] Trình tự các gen cấu trúc của vi rút nh gen C1, C2, C3, C4, V1, V2 mã hoá cácprotein chức năng tơng ứng của vi rút cũng có sự khác nhau ở những loại vi rút xâmnhiễm ở cây trồng khác vùng Có loại vi rút có vùng trình tự các nucleotit hoàn toànkhông giống với những vùng tơng ứng của những loại vi rút đã phát hiện trớc đó[39] Xie và Zhou (2003) ở Trung Quốc đã phân lập hoàn chỉnh vòng ADN-A củaTYLCV thì kết qủa cho thấy ADN-A giống nhất với TYLCThV (TYLCV ở TháiLan) giống 84% Vòng ADN-A của chủng vi rút phân lập có vùng từ nucleotit 74-

2071 là giống 95% với TYLCThV, vùng nucleotit 2071-2457 giống 91% vớiPeLCBDV (Pepper leaf curl virus from Bangladesh), và vùng còn lại thì rất khác vớinhững chủng vi rút đợc công bố trình tự trớc đó [39] Qua những nghiên cứu trênchúng ta có thể thấy rằng các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có độ đa dạng rất lớn

về bộ gen Ngoài ra các nghiên cứu này còn cho thấy có xảy ra sự tái tổ hợp của cácchủng TYLCV để hình thành các chủng mới

1.2.2.4 Cơ chế lây truyền của vi rút

TYLCV xâm nhập vào cây trồng qua bọ phấn trắng (Bemisia tabaci) Khi

nhiễm vào tế bào thực vật, phần ADN vòng đơn của vi rút sẽ xâm nhập vào nhân của

tế bào chủ và sử dụng những nguyên liệu của vật chủ để sao chép và tổng hợp raprotein vỏ, hoàn thiện cấu trúc vi rút Theo Revington và cộng sự (1989), sự saochép hệ gen của vi rút bắt đầu từ một vị trí đặc biệt trong vùng mở đầu gồm khoảng

30 nucleotit và diễn ra theo 2 hớng quanh phân tử, tạo thành hai vòng khép kín [28].Một nuclease cắt một trong hai vòng và đầu 3’-OH của sợi bị cắt sẽ làm mồi để gắnthêm các nucleotit Sợi nguyên vẹn bổ sung đợc làm khuôn Nh vậy, đầu 5’-OH bịthay thế và sau đó đợc sao chép Theo cách này phân tử sợi kép đợc tổng hợp có thểdài gấp nhiều lần NST của vi rút, sau đó bị cắt thành những NST của hạt vi rút CácNST này sẽ đợc dịch mã để tạo các protein cần thiết cho vi rút [35]

1.3 cây chuyển gen kháng vi rút và một số thành tựu đ đạt đã đạt đ ợctrong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen

1.3.1 Cơ chế kháng bệnh vi rút của cây chuyển gen

Cây trồng có tính kháng khác nhau với các loại vi rút khác nhau, nó có thể làvật chủ hoặc không là vật chủ của những loại vi rút xác định Vi rút có thể xâmnhiễm vào cây chủ, lan truyền gây bệnh làm cây chủ giảm hay mất khả năng sinh tr-ởng, phát triển, sinh sản Trong quá trình tiến hóa, vi rút dần hình thành những cơchế bảo vệ khỏi tính kháng tự nhiên của vật chủ để dễ dàng xâm nhập và gây bệnh [5]

Với cây chuyển gen, chúng ta đã tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả chocây trồng chống lại vi rút Có nhiều cách giải thích về tính kháng của cây chuyểngen, theo Baulcombe (1996) tính kháng của cây chuyển gen gọi là tính kháng có đ-

ợc nhờ chính yếu tố gây bệnh-PDR (pathogen-derived resistance) [12] Gen đợcchuyển vào cây là những gen có chức năng khác nhau của vi rút nh: gen mã hóa

đoạn lặp lại ngợc chiều PDR có thể có cơ chế thông qua protein (post translation),sản phẩm của những gen đợc chuyển vào sẽ cản trở quá trình tạo lớp protein vỏ, làmquá trình lắp ráp không xảy ra đợc và cản trở sự lan truyền của vi rút trong cây PDR

có thể có cơ chế thông qua ARN (post transcription) Mặc dù cơ chế của nó cha đợcxác định rõ, xong có thể là liên quan đến ARN sợi đôi và những sợi ARN đơn ngắn,RdRps, ARN helicases và RNase [16] Khi vi rút TYLCV xâm nhập, trong tế bàoxuất hiện tín hiệu bảo vệ, sợi ARN đôi đợc tạo thành từ những ARN của vi rút vàARN của những gen chức năng của vi rút TYLCV đã đợc chuyển vào cây trớc đó d-

ới tác dụng của RdRp Sợi ARN này sẽ bị cắt thành những đoạn ARN đôi ngắn, vớihai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, dới tác dụng của Dicer (một nuclease) Những đoạnARN ngắn này có tác dụng làm mồi để tổng hợp nên những sợi ARN đôi, dựa vàonhững ARN lạ làm khuôn (chính là những ARN của vi rút), và nó còn tạo phứcRNase, khi kết hợp với protein elF2C (nhân tố khởi đầu), ARN helicase, Dicer (mộtloại nuclease) Phức này có thể cắt những ARN đôi tiếp tục lại tạo thành nhữngARN đôi ngắn với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, ARN này lại làm mổi, để loại bỏdần những ARN lạ Nh vậy theo mô hình kháng này thì hiệu quả của nó phụ thuộcvào độ tơng đồng của những đoạn ARN làm mồi với ARN lạ

1.3.2 Một số thành tựu đã đạt đợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen

Việc chuyển gen vào cây trồng cho đến nay không là vấn đề còn phải tranhcãi nữa mà đã trở thành kĩ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Đã có hơn 50loại gen đã đợc chuyển nạp vào cây trồng và ít nhất có khoảng 400 loại cây manggen biến nạp đợc trồng thử ở điều kiện đồng ruộng nh cà chua, bông, cải dầu, ngô,khoai tây…[2], với các đặc tính nh: kháng vi rút, kháng côn trùng, chín chậm,

có trên 52,6 triệu ha cây trồng chuyển gen đợc canh tác trên thế giới [18] Các quốcgia hiện nay trồng các cây chuyển gen nh: Achentina, úc, Bungary, Canada, TrungQuốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urugoay, Brazil và Mỹ[10] Bên cạnh những vấn đề cha rõ về cây chuyển gen nh: mối nguy cơ trong việcvô tình đa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dỡng sản phẩm, khả năng phát

không thể phủ nhận những giá trị kinh tế của nó đem lại Do các đặc tính u việt của

nó, cây chuyển gen ngày càng đợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

1.4 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứubệnh vi rút

1.4.1 Kĩ thuật PCR

Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction-chuỗi phản ứng trùng hợp nhờPolymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là kĩ thuật nhânnhanh một đoạn ADN, dựa vào một ADN khuôn (là một đoạn ADN mang đoạnADN ngắn cần nhân) và cặp mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khảnăng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ enzym ADN polimerase

(ngày nay sử dụng phổ biến loại enzym bền với nhiệt nh Taq polimerase) xúc tác nối

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp Mỗi chu kì gồm ba b

+ Bớc 1 -Biến tính ADN- ADN đợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm

sợi đơn

tỉ lệ và số lợng từng loại nucleotit của đoạn mồi và kéo dài khoảng 30 giây-1 phút

Taq polimerase hoạt động tốt nhất, để tổng hợp mạch ADN mới bổ sung theo chiều

5’-3’ bắt đầu từ vị trí gắn mồi, thời gian tổng hợp tùy thuộc vào độ dài của trình tựADN cần khuếch đại, từ 30 giây đến vài phút

Số lợng ADN sau mỗi một chu kì tăng lên gấp đôi Vậy sau n chu kì thì số

1.4.2 Kỹ thuật tách dòng

Tách dòng thực chất là nhằm thu một gen hay một trình tự ADN với số l ợnglớn Đầu tiên, là gắn một gen mong muốn vào vectơ tách dòng để tạo nên vectơ tái

tổ hợp sau đó chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Trong các tế bào chủ, cácvectơ tách dòng đợc nhân lên một số lợng lớn bản sao của gen ban đầu Ta sẽ thu đ-

ợc ADN qua các bớc tách chiết Tách dòng gồm 5 bớc:

+ Chọn và xử lí vectơ: Vectơ tách dòng là các phân tử ADN có kích thớc nhỏcho phép gắn các gen, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tếbào Vectơ đợc xử lí bằng các enzym giới hạn, và hai đầu chỗ mối cắt đợc xử lí đểkhông thể nối lại với nhau

+ Xử lí ADN cần đợc tạo dòng: Chọn những đoạn ADN có kích thớc gầngiống nhau và tơng ứng với vectơ đã chọn, sau đó ADN đợc xử lí để có hai đầu tơngứng với vectơ (bằng cách xử lí với cùng loại enzym với vectơ)

+ Tạo vectơ tái tổ hợp: Trộn vectơ tách dòng và các đoạn ADN cần gắn vớimột tỉ lệ xác định, có sự tham gia của ADN ligase để tạo vectơ tái tổ hợp ADN sẽgắn vào vectơ ở hai đầu tơng ứng

+ Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ: Chuyển bằng phơng pháp biến nạp,với mục đích qua tế bào chủ các vectơ tái tổ hợp sẽ đợc nhân lên với số lợng lớn cácbản sao Các tế bào chủ đợc chọn phù hợp với vectơ tái tổ hợp, thờng là tế bào

E.coli.

+ Chọn và sàng lọc ra các thể tái tổ hợp: Nuôi cấy vi khuẩn có vectơ tái tổhợp trong môi trờng thích hợp Sử dụng các gen chỉ thị để tiến hành chọn lọc cáckhuẩn mang gen tái tổ hợp [4]

1.4.3 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmitmang gen mong muốn, nh phơng pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạnchế, hoặc PCR từ plasmit Trong đó phơng pháp colony-PCR cho phép phát hiệnnhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn Phơng pháp này có u điểm lànhanh, ít tốn kém và đơn giản Hiện nay, kỹ thuật này đợc ứng dụng rất rộng rãitrong nghiên cứu sinh học phân tử

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khác

ở chỗ mẫu ADN đợc thay bằng ADN plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ

tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu

1.4.4 Kỹ thuật xác định trình tự ADN

Hiện nay có nhiều phơng pháp xác định trình tự ADN Chúng tôi sử dụng

ph-ơng pháp enzym học của Sanger và cộng sự (1977) [32] Phph-ơng pháp này tiến hànhphản ứng tổng hợp các phân tử ADN, dới xúc tác của enzym ADN polymerase, vớikhuôn là đoạn ADN cần xác định trình tự, trong sự có mặt của một hàm lợng nhỏdẫn xuất dideoxy của các nucleotit (ddNTP) Nhóm 3’OH của nucleotit đợc thaybằng H Điều này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thànhcác cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật đọc

trình tự nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit đợc đánh dấu bằng một fluochrome

có màu khác nhau Nh vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loạidideoxynucleotit sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ramột dãy các phân đoạn ADN hơn kém nhau một nucleotit Thiết bị phát hiện huỳnhquang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất đợc phát hiện trớc.Detector phát tín hiệu lên máy tính Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kếtquả xác định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng

Chơng 2 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1.Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Các mẫu lá cà chua bị nghi nhiễm bệnh xoăn lá đợc chúng tôi thu thập tạinhững vùng chuyên canh cây cà chua thuộc các các tỉnh: Hà Nội, Bắc Ninh, HngYên, Thái Bình, Hải Dơng, Quảng Ninh Do điều kiện thời gian không cho phép nênchúng tôi mới chỉ tiến hành thí nghiệm với 6 tỉnh trên (bảng 1)

Bảng 1 Danh sách các mẫu lá cà chua nhiễm TYLCV đợc sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên vùng thu mẫu Ký hiệu

Bảng 2 Mã số các trình tự gen CP trong Ngân hàng gen quốc tế đợc

sử dụng trong nghiên cứu

STT Mã số trong NCBI Vùng phân lập Viết tắt

30 NC004569 Tây Ban Nha TYLCV-NC004569

2.1.2 Hoá chất, môi trờng nuôi cấy vi khuẩn và thiết bị sử dụng

+ Hoá chất

- Thang ADN chuẩn của hãng MBI Fermentas (Đức)

- Kit thôi gen, Kit tách plasmit của Qiagen (Đức)

- Kit tinh sạch ADN plasmit

- Bộ hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR của Applied Biosystem (Mỹ)

- Các hoá chất thông dụng khác đợc mua của các hãng Merck (Đức), Sigma(Mỹ), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển)

+ Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật

Bảng 3 Thành phần môi trờng nuôi cấy vi sinh vật

Thu thập mẫu TYLCV Khai thác trình tự trong NCBI

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số của lá cà chua nhiễm bệnh đợc tách chiết theo phơng pháp củaAccotto và cộng sự (2000)

- Nghiền 0,15 g lá cà chua nhiễm bệnh trong nitơ lỏng

v/p trong 5 phút

- Chuyển khoảng 500 àl dịch nổi sang ống mới

- Loại protein bằng cách bổ sung 500 àl Phenol:Chloroform:Isoamin(25:24:1) Đảo đều hỗn hợp, li tâm 13.000 v/p trong 15 phút Chuyển 350 àlpha nớc trên sang ống mới

- Bổ sung thêm 350 àl Isopropanol lạnh, đảo đều Li tâm 13.000 v/p trong 5phút

- Rửa ADN bằng 500 àl ethanol 70%

- Để khô tủa và hoà tan trong 100 àl TE (có bổ sung RNase)

Extraction bufer: 100 mM Tris HCL, pH=8 ; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl;1% SDS; 10 mM -mercaptoethanol, hoặc axit xitric 10 mM

2.2.2 Nhân gen đặc hiệu bằng phơng pháp PCR

Trên cơ sở trình tự gen CP đã đợc công bố trong ngân hành gen thế giới, chúng tôi thiết kế cặp mồi, để nhân gen CP của vi rút thông qua phản ứng PCR

Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR

Nớc cất hai lầnBuffer PCR (10X)dNTP MgCl2

142,522

Hình 7 Sơ đồ thí nghiệm

Nhân gen CP bằng PCR

Tách dòng gen

Xác định và so sánh trình tự

prC324NprV889NADN mẫu

Taq ADN polymerase

1120,5

2.2.3 Điện di phân tích ADN trên gel Agarose

Nguyên tắc: Phơng pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc tích điện âm của axitnucleic ADN với những kích thớc và khối lợng khác nhau, sẽ di chuyển với tốc độkhác nhau trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng tạo thành các băng khác nhau

Hoá chất: Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X đợc đun sôi, để nguội khoảng

Tra mẫu ADN trộn với đệm tra mẫu (với tỉ lệ 1V mẫu:1V đệm 2X) vào các giếngtrên bản gel Chạy với điện thế 80-120V Quan sát các dải ADN bằng cách nhuộmgel vào dung dịch EtBr 100 àl/l khoảng 5 phút trên máy lắc nhẹ, sau đó rửa bản gelbằng nớc và soi dới ánh sáng tử ngoại 300 nm

2.2.4 Thôi gel, gắn đầu-A và tinh sạch sản phẩm PCR

2.2.4.1 Thôi gel

- Cắt phần gel chứa băng ADN quan tâm cho vào ống Eppendorf 2 ml

gel hòa tan hết Cho dịch thu đợc vào cột QIAquick 50 Li tâm 13.000 v/p trong 1phút Loại bỏ dịch ở phía dới

- Bổ sung 750 àl buffer PE, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch phíadới Li tâm thêm 1 phút để loại bỏ hết PE

Níc cÊt hai lÇnBuffer PCR (10X)dNTP MgCl2

ADN mÉu

Taq ADN polymerase

9433301

- Hòa tan ADN trong 30 l EB.

2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T

Sau khi thu đợc ADN nhân bản từ phản ứng PCR, chúng tôi tiên hành gắn sảnphẩm PCR vào vectơ pGEM-T

Bảng7 Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép

Hỗn hợp đợc để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

2.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 bằng pháp

sốc nhiệt

Phơng pháp biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 đợc tiến hành

theo Cohen và cộng sự (1972) [14] Màng tế bào vi khuẩn dới tác dụng của hoá chất,trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN có thể chui vào Sau đó,các tế bào đợc phục hồi trong môi trờng nuôi cấy và các thể biến nạp đợc phát hiệntrên môi trờng thích hợp

+ Chuẩn bị tế bào khả biến

+ Biến nạp

Bổ sung trực tiếp vào ống đựng tế bào khả biến 10 l ADN plasmit, ủ 30 phút

phút Trải 100 l dịch tế bào lên trên đĩa LB đặc chứa ampicillin nồng độ cuối cùng

Thành phần Thể tích(l)Nớc cất hai lần 2

2.2.7 Kiểm tra sự có mặt của gen CP trong vectơ tách dòng

phút để phá vỡ tế bào Bổ sung các thành phần của phản ứng PCR theo thứ tự sau:

1

x30

1

2.2.8 Tách vectơ tái tổ hợp (ADN plasmit tái tổ hợp) từ E.coli

Song song với PCR kiểm tra sự có mặt của gen CP trong vectơ tách dòngpGEM-T Chúng tôi nuôi các khuẩn lạc trắng tơng ứng vào môi trờng LB lỏng có

bổ sung Amp 100mg/l Những khuẩn lạc PCR dơng tính thì chung tôi tiến hành táchplasmit

- Lấy 2 ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm vào ống Eppendorf 2 ml, li tâm13.000 v/p trong 5 phút, thu tủa

- Bổ sung 250 l P1 (có bổ sung RNase), đảo kĩ cho đến khi khuẩn tan hoàntoàn

- Bổ sung 250 l P2, đảo nhẹ 4-6 lần

- Chuyển pha trên vào cột QIA prep spin, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút

- Bổ sung vào cột bằng 500 l buffer PB, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút

- Rửa cột bằng 750 l buffer PE, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút Li tâm thêmmột phút để loại hết PE

Dịch khuẩnDung dịch đệm (10X)dNTP

MgCl2

pUC-R1pUC-F1

Taq ADN polymerase

162,522110,5

- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml, bổ sung 50 l EB, để yên 5 phút, litâm 13.000 v/p trong 1 phút

2.2.9 Xác định trình tự gen bằng máy phân tích trình tự nucleotid tự động

Analyzer, bằng cách sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDyeđ Terminator v3.1Cycle Sequencing