Chơng 3 Kết quả và thảo luận
3.4.6. Kết quả subclone
1) Kết quả cắt plasmit tái tổ hợp bằng hai enzym giới hạn SphI và BglII
Sau khi xác định trình tự theo chiều xuôi của đoạn gen đợc tách dòng, chúng tôi đã tìm đợc vị trí cắt của enzym BglII cách đầu 5’ của gen khoảng 600bp và tại vị trí PCS đầu 5’của vectơ pGEM-T có vị trí cắt của enzym hạn chế SphI. Chúng tôi đã tiến hành cắt plasmit bằng hai enzym hạn chế BglII và SphI. Theo lý thuyết, nếu phản ứng cắt enzym xảy ra thành công thì chúng tôi sẽ thu đợc hai phân đoạn ADN có kích thớc khoảng 4400bp và 600bp. Trong đó phân đoạn ADN có kích thớc
Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra chiều của gen gắn vào vectơ. M. Thang ADN 1 Kb; Số 1 và 5: TQ; Số 2 và 6: CT; 3 và 7. KT; 4 và 8. SG
khoảng 4400bp là vectơ pGEM-T và phần còn lại của gen NIb (khoảng 1400bp) cần subclone.
Enzym
giới hạn SphI
có hiệu suất cắt 100% trong buffer II, BglII cắt 100% trong buffer III, chỉ cắt đợc 75% trong bufffer II. Do đó, để cắt đồng thời 2 enzym này thì cần sử dụng buffer II và tăng lợng enzym cũng nh thời gian cắt. Sản phẩm cắt enzym đợc điện di trên gel agarose 1% để thu băng quan tâm (băng có kích thớc khoảng 4400bp). Do phản ứng cắt có thể xảy ra không hoàn toàn, nên khi điện di chỉ chạy với hiệu điện thế khoảng 50 vol, vì chạy điện di với hiệu điện thế này có thể phân tách các băng ADN tốt hơn, phần plasmit không đợc cắt trong hỗn hợp phản ứng có thể tách khỏi băng ADN 4400bp. Điều này giúp loại bỏ các plasmit không đợc cắt vì nếu không trong quá trình biến nạp các plasmit này dễ dàng đợc biến nạp vào E. Coli và gây khó khăn trong quá trình chọn dòng
Kết quả điện di trên hình 11, chúng tôi thu đợc hai băng có kích thớc nh dự tính. Nh vậy phản ứng cắt enzym đã thực hiện thành công. Sản phẩm cắt enzym (băng ADN 4400bp) sau đó đợc thôi gel và tinh sạch theo bộ kit QIAquick Spin Miniprep (nh mô tả trong phần phơng pháp 2.2.4).
2) Kết quả biến nạp plasmit vào tế bào E. coli DH5α
Muốn subclone đoạn gen quan tâm thì cần phải gắn hai đầu plasmit đã đợc cắt lại với nhau (hay plasmit tự đóng vòng). Nhng do việc cắt plasmit bằng hai enzym giới hạn SphI và BglII đã tạo ra các đầu dính khác nhau, nên hai đầu vectơ không thể
Hình 11. Kết quả cắt plasmit bằng enzym hạn chế SphI và BglII
M: Thang ADN 1Kb; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG
4400bp
ghép nối lại với nhau. Vì vậy, đoạn gen có kích thớc 4400bp sau khi thôi gel, đợc xử bằng enzym Klenow. Dới sự có mặt của dNTPs tự do, enzym này sẽ xúc tác tổng hợp bổ sung các nucleotit vào các đầu dính để tạo ra hai đầu bằng cho vectơ. Sản phẩm plasmit sau đó đợc tinh sạch để loại bỏ những thành phân d thừa nh dNTPs, đệm, enzym Klenow; rồi đợc gắn lại nhờ enzyme T4 ligase. Plasmit sau khi gắn đợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.
Kết quả biến nạp (đợc trình bày trên hình 12) cho thấy đã thu đợc một lợng lớn các khuẩn lạc kháng Ampicillin. Chứng tỏ vectơ tái tổ hợp đã đợc biến nạp thành công vào E. coli. Tuy nhiên, để biết chính xác khuẩn lạc nào mang vectơ tái tổ hợp nh mong muốn thì cần phải chọn dòng tế bào bằng colony PCR.
3) Kết quả chọn dòng tế bào
5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đã đợc chọn để chạy colony PCR với cặp mồi pUC18-F1 và CP-R3 và đồng thời các khuẩn lạc này đợc nuôi trong môi trơng LB lỏng có bổ sung Ampicilin để tách plasmit. Kết quả colony PCR đợc trình bày trên hình 13.
Kết quả điện di sản phẩm colony PCR (hình 13) cho thấy những đờng chạy số 3, 7, 10 và 16 cho kết quả âm tính, điều này có thể do khuẩn lạc quá bé hoặc quá to nên lợng ADN mẫu cho phản ứng colony PCR quá ít hoặc quá nhiều, làm cho phản ứng không xảy ra. Những đờng chạy còn lại đều cho lên một băng có kích thớc khoảng 1500bp nh mong muốn, là do vectơ có chứa đoạn gen gắn vào có kích thớc khoảng 1400bp. Chúng tôi sơ bộ kết luận đã cắt enzym, biến nạp và chọn dòng
thành công đoạn gen NIb có kích thớc khoảng 1500pb. Tuy nhiên, để có kết luận cụ thể thì phải tiến hành tách plasmit và xác định trình tự đoạn gen subclone.
3.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit
Sản phẩm plasmit đã tinh sạch đợc xác định trình tự trên máy đọc tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc cả hai chiều foward
3.5. kết quả so sánh trình tự