Xác định một số đặc trưng sinh hóa và giá trị dinh dưỡng của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (panaeus vannamei)

Việc sử dụng nguồn phế liệu từ đầu vỏ tôm đang và sẽ được triển khai tại rất nhiều khu vực trong nước để tạo ra các sản phẩm hữu ích.. Hiện nay, việc tận dụng phế liệu đầu vỏ tôm tập tru

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Kim Cúc và ThS Ngô Thị Hoài Dương đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học

& Môi trường Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được nền tảng kiến thức bước tiếp những chặng đường tiếp theo

Con xin gửi lòng biết ơn đến ba mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho con tất cả tình yêu thương, con sẽ luôn cố gắng sống và phấn đấu với niềm tin yêu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp 49CNSH, đã đồng hành và chia sẽ buồn vui với tôi trong những năm tháng sinh viên, trong suốt khóa học cũng như quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật, chị Như Thường và em Quang lớp 50CNSH đã quan tâm, tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Đề tài

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này!

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Lệ Nin

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM 3

1.1.1 Giới thiệu chung về phế liệu tôm trong chế biến thủy sản 3

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm 3

1.1.3 Cấu tạo vỏ đầu tôm .4

1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm 5

1.1.4.1 Thành phần hóa học của phế liệu tôm 5

1.1.4.2 Giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm 6

1.2 HIỆN TRẠNG XỬ LÝ, THU HỒI PHẾ LIỆU TÔM .10

1.2.1 Các hướng tận dụng phế liệu tôm 11

1.2.1.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi 11

1.2.1.2 Sản xuất chitin, chitosan và glucosamine 11

1.2.1.3 Sản xuất bột màu astaxanthin 12

1.2.1.4 Làm các sản phẩm định hình 12

1.2.1.5 Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị 12

1.2.1.6 Một số sản phẩm truyền thống Châu Á 12

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tận dụng phế liệu tôm 13

1.2.2.1 Nghiên cứu và sản xuất chitin – chitosan 13

1.2.2.2 Nghiên cứu chiết xuất astaxanthin và thu hồi protein 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 15

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ chuyên dụng 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 17

2.3.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret 18

2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 20

2.3.4 Định lượng acid béo tổng số bằng phương pháp Forch 21

2.3.5 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở 1050C 24

2.3.6 Xác định hàm lượng tro 24

2.3.7 Định lượng amino acid bằng GC/FID 25

2.3.8 Xác định hàm lượng khoáng thành phần bằng phương pháp ICP-MS 25

2.3.9 Định lượng acid béo bằng phương pháp ester hóa và phân tích bởi sắc ký khí (GC) 25

2.3.10 Xác định hàm lượng NH3 bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 25

2.3.11 Chiết rút protein 26

2.3.12 Điện di protein bằng phương pháp SDS-PAGE 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả xác định thành phần hóa học của đầu tôm thẻ chân trắng tươi 32

3.2 Kết quả phân tích thành phần acid amin trong đầu tôm thẻ chân trắng tươi 33

3.3 Kết quả phân tích thành phần acid béo trong phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng tươi 34

3.4 Kết quả phân tích hàm lượng khoáng thành phần phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng tươi 36

3.5 Kết quả khảo sát sự biến đổi thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (t0=250C÷330C) 37

3.5.1 Sự biến đổi hàm lượng ẩm 38

3.5.2 Sự biến đổi hàm lượng protein tổng số 39

3.5.3 Sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan 39

3.5.4 Sự biến đổi hàm lượng lipid 41

3.5.5 Sự biến đổi hàm lượng hàm lượng NH3 42

3.5.6 Sự biến đổi hàm lượng hàm tro tổng số 43

3.7 Kết quả xác định trọng lượng phân tử protein đầu tôm bằng kỹ thuật SDS-PAGE 44

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

4.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Sản lượng tôm năm 2009-2010 [9] 3

Bảng 1.2 Sản lượng và giá trị tôm năm 2009 và 8 tháng đầu năm 2010 theo số liệu hải quan Việt Nam 4

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của phế liệu tôm đông lạnh (%) .6

Bảng 1.4 Thành phần cấu tạo của một protein (%) 6

Bảng 2.1 Số lượng mẫu thu 15

Bảng 2.2 Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn 19

Bảng 2.3 Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn 21

Bảng 2.4 Thành phần và các dung dịch điện di protein 30

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của đầu tôm thẻ chân trắng (Panaeus vannamei) 32

Bảng 3.2 Thành phần acid amine của đầu tôm thẻ chân trắng 33

Bảng 3.3 Thành phần acid béo của đầu tôm thẻ chân trắng 35

Bảng 3.4 Hàm lượng khoáng thành phần của phế liệu đầu tôm thẻ 36

Bảng 3.5 Sự thay đổi trạng thái cảm quan của đầu tôm theo thời gian bảo quản 37

Bảng 3.6 Sự biến đổi thành phần hóa học của đầu tôm theo thời gian bảo quản 38

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát sự phân bố về trọng lượng phân tử của các protein trong phế liệu đầu tôm 45

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16

Hình 2.2 Quy trình tiến hành tách chiết protein của M Unlusayin et al (2010) 27

Hình 2.3 Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS SDS có thể phá vỡ các vùng kỵ nước bằng cách phá vỡ các liên kết cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein, làm các phân tử protein duỗi thẳng mạch, đồng thời SDS liên lết với mạch chính protein làm cho các phân tử này trở nên tích điện âm .28

Hình 2.4 Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) 30

Hình 3.1 Sự biến đổi hàm lượng ẩm của đầu tôm theo thời gian bảo quản 38

Hình 3.2 Sự biến đổi hàm lượng protein tổng số của đầu tôm theo thời gian

bảo quản 39

Hình 3.3 Sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan của đầu tôm theo thời gian

bảo quản 40

Hình 3.4 Sự biến đổi hàm lượng lipid của đầu tôm theo thời gian bảo quản 41

Hình 3.5 Sự biến đổi hàm lượng NH3 của đầu tôm theo thời gian bảo quản 42

Hình 3.6 Sự biến đổi hàm lượng tro tổng số của đầu tôm theo thời gian

bảo quản 43

Hình 3.7 Kết quả điện di protein của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng

(Panaeus vannamei) Thang chuẩn protein (M), mẫu 0 giờ (giếng 1), mẫu 4 giờ (giếng 2), mẫu 8 giờ (giếng 3) .44

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của đất nước, ngành thủy sản đã và đang phát triển như một ngành kinh tế - kỹ thuật có những đóng góp ngày càng to lớn cho đất nước, trở thành ngành kinh tế quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Tỷ trọng GDP của ngành thủy sản trong tổng GDP toàn quốc hiện nay là trên 5% và nước ta đã trở thành một trong số 10 nước xuất khẩu thủy sản hàng đầu thế giới

Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành, vấn đề về phế liệu trong chế biến thủy sản lại là một điểm hạn chế, do phế liệu thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản là rất lớn Sự ô nhiễm môi trường do phế liệu thải ra trong các nhà máy chế biến thủy sản đang trở thành vấn đề bức xúc, cần được quan tâm và giải quyết, nhằm làm giảm lượng chất thải cũng như tái sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau

Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ trọng lớn và là mặt hàng xuất khẩu chủ yếu, theo đó cũng tạo ra một lượng lớn phế liệu tôm Việc sử dụng nguồn phế liệu từ đầu vỏ tôm đang và sẽ được triển khai tại rất nhiều khu vực trong nước để tạo ra các sản phẩm hữu ích Hiện nay, việc tận dụng phế liệu đầu vỏ tôm tập trung chủ yếu vào sản xuất thức ăn cho gia súc, các sản phẩm chitin–chitosan, glucosamine…

Hàm lượng dinh dưỡng trong phế liệu đầu vỏ tôm tương đối lớn, đặc biệt là thành phần protein Tuy nhiên, phế liệu đầu vỏ tôm rất dễ bị hư hỏng do sự tấn công của vi sinh vật và các tác nhân khác, nếu không được thu gom hoặc bảo quản kịp thời Điều này xảy ra không những gây ô nhiễm môi trường mà còn gây thiệt hại về kinh tế, vì không thể sử dụng phế liệu hư hỏng để sản xuất các sản phẩm thực phẩm

Vì vậy, việc đánh giá đúng và đủ giá trị sinh học của phế liệu đầu và vỏ tôm, cũng như những hiểu biết sâu về quá trình biến đổi của chúng trong quá trình bảo quản sẽ cho phép nâng cao giá trị thu hồi và sử dụng có hiệu quả hơn nguồn lợi thủy sản-tôm của nước ta

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định một số đặc

trưng sinh hóa và giá trị dinh dưỡng của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Panaeus vannamei)”

Mục đích của đề tài

Xác định giá trị dinh dưỡng và sự biến đổi chất lượng của phế liệu đầu tôm

thẻ chân trắng (Panaeus vannamei) theo điều kiện và thời gian bảo quản

Tính khoa học và thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất chitin với mục đích tận dụng nguồn protein từ đầu tôm, hạn chế sử dụng hóa chất ở công đoạn khử protein trong sản xuất chitin – chitosan nhằm giảm ô nhiễm môi trường và sản xuất

ra chitin – chitosan có chất lượng cao hơn

Nội dung của Đề tài

- Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng

(Panaeus vannamei)

- Xác định thành phần acid amin, thành phần acid béo và khoáng thành

phần của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Panaeus vannamei)

- Xác định trọng lượng phân tử protein của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng

(Panaeus vannamei) theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng

- Khảo sát sự biến đổi chất lượng của phế liệu liệu đầu tôm thẻ chân trắng

(Panaeus vannamei) theo điều kiện và thời gian bảo quản

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM

1.1.1 Giới thiệu chung về phế liệu tôm trong chế biến thủy sản

Phế liệu tôm là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm bao gồm: đầu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu Tùy thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu

có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm Có thể lấy tôm sú Penaeus monodon

làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 40% trọng lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm [5] Đối với

tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ

chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu đầu vỏ tôm thẻ là 37% Do đó việc giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng chính là một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thủy sản đồng thời làm giảm ô nhiễm môi trường

1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm

Theo ước tính phế liệu tôm đông lạnh trên toàn thế giới thải ra khoảng 1,9 triệu tấn/năm Theo Hall và De Silva (1992) phần lớn thải ra từ các nước đang phát

triển như Thái Lan, Chilê, Philippin, Ấn Độ, Pakixtan và Indonesia

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm rất dồi dào, được thu từ hai nguồn chính

là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng Trong những năm gần đây, sản lượng tôm thu được trong cả nước rất lớn

Bảng 1.1 Sản lượng tôm năm 2009-2010 [9]

Sản lượng (nghìn tấn)

Năm 2010 so với năm 2009 (%)

Với sản lượng tôm dồi dào và phong phú đã giúp cho mặt hàng thủy sản tôm đông lạnh ở nước ta tăng trưởng mạnh Hàng chục năm qua, tôm là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của thủy sản Việt Nam và hiện nay đang chiếm hơn 50% kim ngạch xuất khẩu toàn ngành Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2009 là một năm đáng ghi nhận đối với ngành tôm Việt Nam bởi kim ngạch xuất khẩu vẫn tăng ngay cả trong bối cảnh kinh tế thế giới khủng hoảng nghiêm trọng Trong 11 tháng đầu năm 2009, xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 190.490 tấn, trị giá trên 1,518 tỉ đô la Mỹ, tăng 7,4% về lượng và 0,73% về giá trị

so với cùng kỳ năm 2008 Do đó lượng phế liệu từ tôm thải ra từ các nhà máy chế biến là khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [8] Đây là nguồn phế liệu dồi dào để sản xuất chitin – chitosan và các sản phẩm giá trị khác

Bảng 1.2 Sản lượng và giá trị tôm năm 2009 và 8 tháng đầu năm 2010 theo số

liệu hải quan Việt Nam

Loại xuất khẩu

Sản lượng (tấn)

Giá trị (USD)

Sản lượng (tấn)

Giá trị (USD) Tươi và đông lạnh 40.852 242.582.107 23.126 143.936.475

Như vậy hàng năm trên thế giới nói chung và nước ta nói riêng đã thải ra một lượng lớn phế liệu tôm Lượng phế liệu này chủ yếu dùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc mang lại hiệu quả không cao mà còn gây ô nhiễm môi trường Vì dưới tác dụng của các vi khuẩn có trong môi trường và các enzyme nội tại trong phế liệu sẽ phân hủy các hợp chất phức tạp như protit, lipit, gluxit trong điều kiện hiếu khí, kị khí tạo các chất khí có mùi hôi thối như: axit béo không no, mercaptan, CH4, H2S, indol,

NH3, methylamine… nếu không xử lý kịp thời Chính vì vậy, cần có những biện pháp tích cực để tận dụng có hiệu quả nguồn phế liệu từ tôm này

1.1.3 Cấu tạo vỏ đầu tôm [1]

Vỏ tôm được cấu tạo bởi 4 lớp chính là lớp biểu bì, lớp màu, lớp calci hóa,

và lớp không bị calci hóa

+ Lớp biểu bì: không chứa chitin, được bao phủ bằng một lớp màng sáp mỏng bên ngoài cản trở sự hòa tan của lớp này ngay cả trong môi trường acid đặc ở nhiêt độ thường Lớp này thường có màu vàng rất nhạt do chứa polyphenol oxydase

và bị hóa cứng nhờ quinine–tannin

+ Lớp màu: tạo nên do sự hiện diện của những thể hình hạt của các phân tử chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khí hoặc những không bào Ở một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, đó

chính là con đường cho calci thẩm thấu vào

+ Lớp calci hóa: lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ tôm, thường có màu xanh trải đều

+ Lớp không bị calci hóa: là lớp trong cùng, có bề dày tương đối nhỏ so với bề dày của cả lớp vỏ tôm, bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có calci và quinine 1.1.4 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm

1.1.4.1 Thành phần hóa học của phế liệu tôm [5]

Phế liệu tôm chứa nhiều thành phần có giá trị như thịt tôm, protein, chitin, sắc tố astaxanthin, khoáng … Tỷ lệ giữa các thành phần không ổn định, chúng phụ thuộc nhiều vào giống loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý… Tôm đông lạnh bao gồm các dạng:

+ Tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp dông IQF hoặc block

+ Tôm vỏ bỏ đầu cấp dông IQF hoặc block

+ Tôm bóc vỏ bỏ chỉ lưng cấp đông IQF

+ Tôm bóc vỏ bỏ chỉ lưng nấu chín cấp đông IQF

+ Tôm bóc vỏ còn đốt đuôi cấp đông IQF

+ Tôm dạng sản phẩm định hình, làm chín

+ Tôm bóc vỏ đóng hộp

Qua đó ta thấy phần lớn tôm được đưa vào chế biến dạng bóc vỏ bỏ đầu Như vậy phế liệu chính là đầu và vỏ tôm Phần đầu chiếm khoảng 45% trọng lượng của tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10–15% Tỷ lệ này phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng, mùa vụ, phương pháp chế biến…

Trong phế liệu tôm đông lạnh thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể nhất là chitin, protein, CaCO3, sắc tố…

+ Protein: trong vỏ tôm thường là loại protein không tan do đó khó tách ra khỏi vỏ tôm Protein liên kết với vỏ tôm thành từng lớp xen kẽ bởi liên kết cộng hóa trị

+ Enzyme: hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi

+ Chuỗi chitin được hình thành từ liên kết glucozid 1 – 4 của 2 đơn vị bằng

nhau tạo thành vi sợi

+ CaCO3: tồn tại dạng vị thể hoặc vô định hình tạo nên sự vôi hóa của lớp vỏ

+ Sắc tố: trong vỏ tôm chứa astaxanthin là một chất thuộc nhóm sắc tố carotenoid Sắc tố này thường kết hợp với protein, khi protein biến tính thì astaxanthin sẽ tách ra và dễ đi vào môi trường

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của phế liệu tôm đông lạnh (%) [5]

Protein được tạo thành do các acid amin kết hợp với nhau Có hơn 80 acid amin được tìm thấy ở vi sinh vật nhưng chỉ có 20 acid amin là cấu tử thường gặp của protein [1]

Chất đạm trong thức ăn gia súc có thể chia làm hai nhóm: protein và chất đạm phi protein Chất đạm phi protein trong thức ăn gia súc phần lớn cũng có acid amin hoặc chất chuyển hóa từ acid amin, nucleotic, các lipid có đạm, amin, purin, pyrimidin, nitrate và các vitamin B có chứa đạm [1]

Vai trò của protein

Protein là thành phần không thể thiếu trong tất cả các cơ thể sống Protein là vật chất xây dựng nên các tổ chức cơ thể sống, hormone, enzyme, đây là các chất cần thiết để duy trì sự sống của vi sinh vật Protein cùng với mỡ và carbohydrate tạo

ra năng lượng cho cơ thể Ngoài ra, trong cơ thể protein còn là nguồn năng lượng

dự trữ, protein có thể chuyển hóa thành đường, lipid … Protein là thành phần dinh dưỡng quan trọng nhất và được xem là tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng thức ăn Protein là thành phần chiếm chi phí lớn nhất trong bất kì một tổ hợp thức ăn nào Vì vậy, nó được tập trung nghiên cứu nhiều hơn so với các thành phần khác [1]

Protein trong phế liệu tôm

Protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó tách ra khỏi vỏ, tồn tại dưới dạng tự do và dạng phức tạp

− Protein ở dạng tự do thường tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các

cơ gắn phần vỏ tôm Ở phế liệu tôm thì dạng này có nhiều ở phần đầu tôm, đó là phần thịt đầu còn sót lại [1]

− Protein ở dạng phức tạp liên kết với chitin, CaCO3 như một thành phần thống nhất của vỏ tôm Đặc biệt là phức hợp protein–astaxanthin trong vỏ tôm được gọi là hợp chất carotenoprotein, hợp chất này vừa có giá trị dinh dưỡng rất lớn vừa

có những đặc tính sinh học quý của astaxanthin [1]

Protein trong phế liệu tôm chiếm 53,5 % đối với đầu tôm, và chiếm 22,8 % đối với

vỏ tôm [1]

Theo một số nghiên cứu đã công bố, protein trong phế liệu tôm có thể thay

thế bột cá trong khẩu phần thức ăn nuôi trồng thủy sản Protein trong phế liệu tôm

có thể sử dụng để sản xuất thức ăn cho cá rô phi Tác giả Tôn Thất Chất (1999) đã thành công trong việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm tôm làm thức ăn cho cá rô phi

Vai trò của acid amin

Acid amin là đơn vị cơ sở cấu tạo nên cấu trúc protein Có 20 loại acid amin thường gặp trong thức ăn chứa protein và trong cơ thể động vật và chia thành 2 nhóm: nhóm acid amin không thiết yếu và nhóm acid amin thiết yếu Acid amin thiết yếu gồm có 8 loại: lysine, phenylalanine, leucine, isoleucine, threonine, tryptophan, valine và methionine

+ Lysine: làm tăng khả năng hấp thụ canxi, giúp cho xương chắc khỏe, duy trì trạng thái cân bằng nitơ có trong cơ thể, do đó tránh được hiện tượng giãn cơ và mệt mỏi Ngoài ra, lysine còn có tác dụng giúp cơ thể tạo ra chất kháng thể và điều tiết hormone truyền tải thông tin

+ Phenylalanine: có chức năng bồi bổ cho não, tăng cường trí nhớ, tác động trực tiếp đến não bộ và giúp tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da

+ Leucine: có vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh hàm lượng đường trong máu, ngoài ra còn có chức năng duy trì lượng hormone tăng trưởng để thúc

đẩy quá trình phát triển mô cơ

+ Isoleucine: loại acid amin này đóng vai trò sống còn trong quá trình phục hồi sức khỏe sau quãng thời gian luyện tập thể dục thể thao Đồng thời nó giúp điều tiết lượng đường glucose trong máu, hỗ trợ quá trình hình thành hemoglobin và đông máu

+ Threonine: hỗ trợ hình thành collagen và elastin, tăng cường hệ miễn dịch

và thúc đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất

+ Valine: có tác dụng chữa lành tế bào cơ và hình thành tế bào mới, đồng thời giúp cân bằng nitơ cần thiết Ngoài ra, nó còn phân hủy đường glucose có trong

cơ thể

+ Tryptophan: có vai trò trong việc chuyển hóa thành vitamin B3 nhờ gan và cung cấp tiền chất của serotonin - một chất dẫn truyền thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ và tâm trạng

+ Methionine là acid amin chứa lưu huỳnh có tác dụng bảo vệ đặc hiệu tế bào gan, ngoài ra nó còn có tác dụng chống nhiễm độc Methionine còn được sử dụng như một yếu tố ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ

Acid amin trong phế liệu tôm

Acid amin là thành phần cấu tạo nên protein của phế liệu tôm Trong phế liệu tôm chứa đầy đủ các acid amin mà đặc biệt là các acid amin cưỡng bức Vì vậy nên chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao [7]

c Lipid

Trong hóa học, lipid nghĩa là hợp chất béo và là hợp chất hữu cơ đa chức, có

độ nhớt cao, không tan trong nước, tan trong các dung môi như erther, chloroform, benzene, rượu nóng Lipid được tạo nên từ C, H, O tuy nhiên O có tỷ lệ ít hơn các carbonhydrat

Vai trò của lipid

Lipid có giá trị dinh dưỡng cho cơ thể như cung cấp các acid béo bão hòa và các acid béo không bão hòa không thể thay thế, tham gia cấu tạo tế bào, làm mô đệm, cách nhiệt, làm dung môi hòa tan các vitamin tan trong mỡ là A, D, E, K cho

cơ thế hấp thụ Có vai trò dữ trữ năng lượng và cung cấp năng lượng rất cao cho cơ thể, gấp 2,5 lần so với protein

Lipid trong phế liệu tôm

Trong phế liệu tôm chứa lượng lipid đáng kể khoảng 6,1%, chủ yếu là các acid béo chưa bão hòa như eicosapentanoic và các acid béo decosahexaenoic, đây là những acid rất có lợi cho sức khỏe con người và chúng cũng có rất nhiều ứng dụng

d Nước

Hàm lựơng nước trong phế liệu tôm tương đối cao, chiếm 70–85% Đây là nguyên nhân gây ôi thối nếu không xử lý kịp thời lượng phế liệu tôm thải ra, do tạo điều kiện cho enzyme và vi sinh vật phát triển

e Vitamin và khoáng

Lượng vitamin và chất khoáng trong phế liệu tôm đặc trưng theo loài và biến đổi theo mùa Trong phế liệu tôm vitamin được chia làm hai nhóm là nhóm vitamin tan trong chất béo như A, D, E và nhóm vitamin tan trong nước như vitamin nhóm B, PP và vitamin C

Chất khoáng chủ yếu trong phế liệu tôm là Ca, P, Cu , Fe …

f Ngoài ra, trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin được sử dụng

trong điều trị ung thư, ngoài ra trong vỏ tôm còn có một số enzyme khác như

alkaline photphatase, deacetylase, chitinasr, β-N-acetylglucosamidase cũng được

ứng dụng nhiều trong thực tế

Như vậy, trong phế liệu tôm có các thành phần sinh hóa có giá trị cao về dinh dưỡng, do đó việc nghiên cứu tận dụng có hiệu quả phế liệu liệu tôm cần được quan tâm, nếu sử dụng tốt nguồn phế liệu này sẽ mở ra những hướng nghiên cứu mới trong các lĩnh vực của đời sống

1.2 HIỆN TRẠNG XỬ LÝ, THU HỒI PHẾ LIỆU TÔM [5]

Ngày nay khi ngành công nghiệp chế biến sản phẩm tôm đông lạnh ngày càng phát triển thì ô nhiễm từ phế thải đã trở thành một vấn đề ngày càng bức xúc

do việc thải bỏ chất thải rắn cũng như nước thải phát sinh Hiện nay, phế thải tôm đang rất được quan tâm bởi đây là loại phế liệu có rất nhiều ứng dụng mang lại giá

trị kinh tế cao như: sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất chitin-chitosan và glucosamine…

1.2.1 Các hướng tận dụng phế liệu tôm

1.2.1.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Phần lớn nước ta sử dụng phế liệu tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy trên thị trường hiện nay có chứa bột tôm, trong một số trường hợp bột tôm chiếm đến 30% thành phần thức ăn Bột tôm được chế biến tốt có thành phần acid amin tương tự như acid amin trong đậu tương hay trong bột cá Để sản xuất thức ăn gia súc chất lượng cao, phế liệu tôm sử dụng phải là loại tốt và không bị phân hủy, nếu không sản phẩm sẽ có chất lượng thấp

Do vậy việc xử lý và chế biến phế liệu có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất bột tôm Công nghệ chế biến để áp dụng sản xuất bột tôm có ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và acid béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng nếu áp dụng công nghệ chế biến không phù hợp, các carotenoid như astaxanthin có thể bị suy giảm chất lượng nếu xử lý nhiệt quá mức [5]

Có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

là phương pháp sấy khô bằng nhiệt và phương pháp ủ xilô

+ Phương pháp sấy khô bằng nhiệt: có ưu điểm là đơn giản, có thể chế biến nhanh lượng tôm đông lạnh, tính kinh tế cao nhưng chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

+ Phương pháp ủ xilô: sử dụng acid hữu cơ và vô cơ trong việc ủ nhằm làm tăng tác động của enzyme, khử trùng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ, tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt, giá thành cao, phức tạp nhưng không kinh tế

1.2.1.2 Sản xuất chitin, chitosan và glucosamine

Trong thành phần của vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn chitin, vì vậy có thể sử dụng để sản xuất chitin-chitosan, sản xuất chitin-chitosan bao gồm các bước: tách khoáng, tách protein, deacetyl bằng nồng độ cao Sản phẩm chitin đem đi thủy

phân bằng xút đậm đặc thu chitosan hoặc thủy phân bằng HCl đặc để thu glucosamine, chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học [5]

1.2.1.3 Sản xuất bột màu astaxanthin

Thành phần hóa học của vỏ tôm rất giàu protein nên khi sản xuất chitin cần phải xem xét thu hồi protein, phế liệu tôm còn chứa sắc tố astaxanthin tuy hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại rất cao (2.500USSD/kg), hơn nữa astaxanhthin còn là một carotenoid có tác dụng kích thích sinh trưởng, kháng một số bệnh Astaxanthin

là một carotenoid có khả năng tạo màu do đó nên được sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, công nghiệp, thực phẩm và hiện nay vấn đề tận dụng astaxanthin trong công nghiệp chế biến phế liệu tôm là vấn đề đang được nhiều nước quan tâm [5]

1.2.1.4 Làm các sản phẩm định hình

Thịt tôm vụn hoặc không đạt tiêu chuẩn có thể được chế biến thành các sản phẩm định hình như tạo thành hình con tôm hay các hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm Bằng cách tạo ra các hình dạng khác nhau, tẩm ướp tẩm gia

vị hay bao bột, người ta có thể làm ra rất nhiều sản phẩm tôm đẹp mắt Các sản phẩm này thường được làm chín trong các lò vi sóng

1.2.1.5 Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị

Ngoài ra từ phế liệu tôm có thể tận dụng để chế biến thành nhiều sản phẩm khác như đầu tôm sau khi được loại bỏ vỏ có thể chế biến thành mắm tôm và gia vị,

nó cũng được tận dụng làm nguyên liệu tạo mùi cho món súp tôm đặc, tôm vụn được dùng làm món canh tôm

1.2.1.6 Một số sản phẩm truyền thống Châu Á

Bánh phồng tôm hay kroepoek phương Đông Đây là loại đồ ăn nhanh phổ biến ở Đông Nam Á Có thể sản xuất bánh phồng tôm loại tốt sử dụng phế liệu tôm chất lượng cao như đầu tôm và vỏ tôm vụn, những nguyên liệu này có tác dụng như hương liệu và hàm lượng protein cao

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tận dụng phế liệu tôm

1.2.2.1 Nghiên cứu và sản xuất chitin – chitosan

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa, ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan là Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp

Ở Pháp họ đã thành công trong việc sản xuất chitosan từ vỏ tôm phơi khô bằng phương pháp hóa học với hai công đoạn xử lý kiềm đã cho ra sản phẩm chitosan với màu sắc đẹp

Đến nay, thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với những nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ [10], [11]

Ở nước ta, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn nhất trong các sản phẩm đông lạnh Chính vì vậy, vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, sẵn có quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc sản xuất chitin–chitosan Tuy nhiên, công nghệ nghiên cứu sản xuất chitin–chitosan ở nước ta hiện nay còn tương đối mới mẻ, các công trình nghiên cứu về sản xuất và ứng dụng chitin–chitosan chỉ mới được tiến hành trong những năm gần đây Năm 1978, những nghiên cứu tách chiết chitin–chitosan bắt đầu được thực hiện ở trường Đại

học Thủy Sản Đến năm 2003, GS.TS Trần Thị Luyến đã thành công trong việc

nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có chất lượng không thua kém so với quy trình thông thường hai giai đoạn xử lý kiềm

do đó rút ngắn thời gian sản xuất, có lợi về mặt kinh tế Tuy nhiên dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng [10]

Gần đây tác giả Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú đã thành công trong việc nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sinh học, tác giả sử dụng bromelanin trong dịch ép vỏ dứa để tách chiết chitin, kết quả thử nghiệm tách chiết được lượng chitin trung bình 7,4 – 7,5 gam từ 100 gam nguyên liệu bột đầu vỏ tôm khô

1.2.2.2 Nghiên cứu chiết xuất astaxanthin và thu hồi protein

Trong phế liệu tôm, astaxanthin chủ yếu tập trung ở phần vỏ ngoài, chiếm 58 – 87% tổng hàm lượng carotenoid Nó thường vẫn tồn tại ở dạng tự do, dạng mono- hay di-ester với các acid không no mạch dài hoặc dưới dạng phức carotenoprotein của dạng đồng phân quang học (3S, 3’S) Hàm lượng astaxanthin trong vỏ tôm thay đổi đáng kể theo loài (từ 10 – 140mg/kg trọng lượng ướt) Ngoài ra hàm lượng protein trong phế liệu tôm cũng rất cao Chính vì vậy việc nghiên cứu để đưa ra quy trình thu hồi hỗn hợp protein–astaxanthin là rất cần thiết Nếu thu hồi được hỗn hợp này ta có thể sử dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc và thức ăn cho thủy sản [1]

Trong vỏ phế liệu tôm, astaxanthin liên kết chặt chẽ với lớp calci carbonat – chitin, gây khó khăn cho việc chiết xuất astaxanthin Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng acid hay hỗn hợp các acid để loại bỏ calci carbonat (giai

đoạn khử khoáng) trước khi chiết xuất bằng dung môi thích hợp Fukuda và Kozo (1997) đã thành công trong việc khử calcium caronat trong vỏ tôm bằng HCl, rồi trung hòa bằng NaOH trước khi chiết astaxanthin bằng ethanol 80% Rupsankar Chakrabarti (2002) đã thành công trong việc nghiên cứu thu hồi hỗn hợp

carotenoprotein từ vỏ đầu tôm bằng các enzyme như trypsin, papain, pepsin

Astaxanthin và protein là hai thành phần có giá trị cao, công nghệ nghiên cứu thu hồi hỗn hợp astaxanthin–protein ở nước ta hiện nay đang được quan tâm Năm

1995, K.S Nguyễn Văn Ngoạn đã xây dựng thành công quy trình công nghệ thu

astaxanthin, chitin và protein từ phế liệu tôm đông lạnh Quy trình công nghệ này tạo được nhiều sản phẩm, chitin qua nhiều công đoạn tẩy trắng nên có màu trắng đẹp hơn, tuy nhiên tốn nhiều hóa chất và hiệu suất thu hồi astaxanthin thấp Năm

2003, Th.S Hoàng Thị Huệ An đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất

astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm, dùng các dung môi hòa tan được astaxanthin như ete dầu mỏ, ethanol, etyl acetate, etanol… để chiết xuất astaxanthin ứng dụng làm chất

mùi, màu cho surimi [4] Gần đây nhất là nghiên cứu của TS Nguyễn Minh Trí và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ép tách protein từ đầu tôm thẻ (Penaeus vannamei)

trong sản xuất chitin và bổ sung vào chượp trong sản xuất nước mắm [6]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm

- Đầu tôm thẻ chân trắng (Panaeus vannamei): được thu từ Công ty Cổ phần

Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa Nguyên liệu sau khi thu được vận chuyển bằng thùng xốp cách nhiệt có nhiệt độ < 50C về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được để ở nhiệt độ phòng theo thời gian từ 0 giờ - 8 giờ Trong trường hợp nguyên liệu chưa phân tích ngay thì bao gói và bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -200C tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học và Môi trường

Bảng 2.1 Số lượng mẫu thu

Ngày thu mẫu Khối lượng mẫu Nhiệt độ phòng

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ chuyên dụng

Hóa chất: Bộ hóa chất điện di của hãng bio-rad và một số hóa chất khác

Thiết bị chuyên dụng: Máy hút chân không, máy cô quay chân không, hệ

thống chưng cất Kjeldahl bán tự động, máy thủy phân, máy ly tâm lạnh, máy

đo quang phổ protein UV-VIS, thiết bị điện di protein của hãng bio-rad

Dụng cụ: pipet, micropipette, ống nghiệm, eppendorff, bình tam giác, cốc

thủy tinh, bình định mức…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Phế liệu đầu tôm

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Hàm lượng

ẩm (Phương pháp sấy

ở nhiệt

độ cao)

Xác định giá trị dinh dưỡng

t = 2 giờ t = 4 giờ t = 6 giờ t = 8 giờ

Xác định thành phần hóa học

Acid béo tổng số (Phương pháp Forch)

Hàm lượng tro (Phương pháp nung ở nhiệt độ cao)

Hàm

NH3(Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước)

Khảo sát phân bố trọng lượng phân tử của protein (Phương pháp SDS-PAGE)

Đánh giá sự biến đổi về chất lượng phế liệu theo

điều kiện và thời gian bảo quản

2.3.1 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

a Nguyên tắc

Chất đạm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc thành muối (NH4)2SO4, muối này đem tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng ra NH3, lượng NH3 này được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng H3BO3 dư mà ở

đó H3BO3 tự phân ly thành BO2- Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,02N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ

c Tiến hành

Vô cơ hóa mẫu

+ Cân 0,5 - 2g (hoặc ml) mẫu cho vào ống Kjeldahl có dung tích phù hợp (thường 250ml)

+ Thêm một lượng chất xúc tác (CuSO4.5H2O và K2SO4) phù hợp khoảng 0,9 - 1,2g

+ Thêm 20ml H2SO4 đối với gam chất khô đầu tiên của mẫu và thêm 12ml cho mỗi gam chất khô tiếp theo Trộn đều đảm bảo đã làm ướt toàn bộ phần mẫu thử, đặt bộ ống Kjeldahl vào bộ phá mẫu

6-+ Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy Tổng thời gian vô cơ hóa từ 3-4 giờ + Sau khi phá mẫu hoàn tất chất lỏng trong bình trong và có màu xanh da trời nhạt Để nguội nếu thấy quá trình vô cơ hóa xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước cất vào rồi lắc đều

Chưng cất ammoniac

Cài đặt thông số cho máy (dựa vào catalogue) để chưng cất mẫu: H2O (2giây), H3BO3 (3giây), NaOH (5giây)

Thời gian chưng cất: 5 phút

Nhỏ 3 giọt chỉ thị TaShiro vào bình hấp thu và tiến hành chưng cất mẫu

V1 0 ) * * 14 ( −

Trong đó:

WN: Hàm lượng N của mẫu (g/kg)

V1: Thể tích dung dịch HCl 0,02N dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml)

V0: Thể tích dung dịch HCl 0,02N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) c: Nồng độ của dung dịch HCl chuẩn độ

14: Khối lượng phân tử gam của N (M = 14g/mol)

m: Khối lượng của mẫu thử (g)

Hàm lượng protein thô của mẫu được tính theo công thức:

b Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị: Máy đo hàm lượng protein UV/VIS

Dụng cụ: Buret 10ml, 25ml; ống nghiệm; bình định mức 500ml, bình tam giác 500ml, micropipette (100 -1000µl)

Hóa chất: NaOH 10%, CuSO4.5H2O, C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat),

dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 10mg/ml

c Tiến hành

- Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (10g/ml) theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn

Ống nghiệm Dung dịch hóa

Xác định nồng độ protein của mẫu

+ Sau khi ủ: đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vào 4ml thuốc thử biuret, vortex rồi để ở nhiệt

độ phòng 30 phút rồi tiến hành đo ở bước sóng 570nm Thực hiện ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ∆OD Từ đường chuẩn suy ra nồng độ protein mẫu cần phân tích

Tính kết quả

- Nồng độ protein theo công thức sau :

Nồng độ mẫu = nồng độ tính toán × độ pha loãng

- Hàm lượng protein có trong mẫu tính theo công thức sau :

%protein =

] 100 / ) 100 [(

* 1000

C V

−V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng

C: Nồng độ protein trong 1ml (mg/ml)

m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (g)

Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%)

2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

a Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh Coomassie, trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỹ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh và có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm

b Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị: Máy đo hàm lượng protein UV/VIS

Dụng cụ: Buret 10ml, 25ml; ống nghiệm; bình định mức 500ml, bình tam giác 500ml, micropipette (100 -1000µl)

Hóa chất: CBB G250, ethanol 95%, H3PO4 85%, dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100 µg/ml

c Tiến hành

- Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (100 µg/ml) theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn

Dung dịch

BSA (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nước cất

(µl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Nồng độ BSA

(µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

- Hút 100 µl dung dịch protein vừa pha loãng theo bảng trên, thêm vào 500

µl thuốc thử Bradford, lắc đều Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (∆OD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml) Tại mỗi nồng độ tiến hành đo 3 lần, sau đó xác định giá trị OD trung bình

Xác định nồng độ protein của mẫu

- Hút 100 µl dung dịch protein cần phân tích, thêm vào 500 µl thuốc thử Bradford, lắc đều Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm Thực hiện ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ∆OD Từ đường chuẩn suy ra nồng độ protein mẫu cần phân tích

Tính kết quả

- Nồng độ protein theo công thức sau :

Nồng độ mẫu = nồng độ tính toán × độ pha loãng

2.3.4 Định lượng acid béo tổng số bằng phương pháp Forch

a Nguyên tắc

Dùng hỗn hợp dung môi chloroform : methanol với tỉ lệ 2:1 để hòa tan tất cả các chất béo trong mẫu, tách lớp và chiết qua phiễu lọc nhiều lần Sau đó làm bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g mẫu

b Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Dụng cụ, thiết bị: Tủ host, máy đồng hóa, máy cô quay chân không, tủ sấy chân không, bộ thổi khí N2, phễu chiết 250ml và 200ml, bình cầu 100ml, bình định

mức 5ml, ống nghiệm có nắp, ống thủy tinh vial cao 20ml, ống thủy tinh có nắp

4ml, ống xilanh 20ml, giấy lọc GF/C, giá đỡ dụng cụ chiết, micropipette

Hóa chất: methanol 50% (CH3OH:H2O tỉ lệ 1:1), chloroform, NaCl 0.9%

c Tiến hành

Tách lipid từ mẫu

+ Cân 1g mẫu đã được trộn đều, cho vào ống thủy tinh vial cao thể tích 20ml + Cho thêm 600µl nước cất, 5ml methanol, 10ml chloroform Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút

+ Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút

+ Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch lọc chảy xuống hết hoàn toàn

+ Cho thêm 5ml methanol và 10ml chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây

+ Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn

+ Sử dụng piton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu hết 100ml

+ Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu Đảo trộn phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 50C trong 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành hai lớp

Chiết rút dung dịch lipid

+ Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50ml Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hóa hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein …)

+ Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100ml Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và lắng qua đêm ở 50C

Định lượng lipid

+ Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100ml

+ Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 370C đến khi thể tích còn lại khoảng 1ml

+ Hòa tan mẫu còn lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí)

+ Chuyển mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5ml (Vđm)

+ Sau khi xử lý xong dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng + Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông -200C

Xác định hàm lượng lipid tổng

+ Lấy chính xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào một ống thủy

có nắp 4ml đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi

Vm m

Vdm m

Vm T m

Vdm m

m −

Trong đó: Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu

Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g)

m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g)

m: Trọng lượng cân mẫu (g)

Vđm: Thể tích định mức sau xử lý (ml)

Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml)

T: Thành phần khô của mẫu, T = (100 – W)/100

W: Độ ẩm của mẫu (%)

2.3.5 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở 105 0 C

a Nguyên tắc

Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy sẽ tính được hàm lượng nước trong thực phẩm

b Tiến hành

Sấy chén ban đầu ở 1000C – 1050C trong 3 giờ

Cân lại chén sau khi sấy đến trọng lượng không đổi (m0)

Cân 1 lượng mẫu khoảng 2 – 5g (hoặc 5 – 10ml) vào trong chén (m)

Sấy chén chứa mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C – 1050C đến khối lượng không đổi Lấy chén ra để vào bình hút ẩm để 30 phút và tiến hành cân (m2) Tiếp tục sấy trong 1 giờ và cân lại nếu giữa hai quá trình cân không chênh lệch khối lượng không quá 0,01g là dừng

Tính kết quả

Hàm lượng ẩm tính theo công thức:

Hàm lượng ẩm (%) = * 100

0 1

2 1

m m

m m

−

− Trong đó: m1 là khối lượng mẫu và cốc trước khi sấy (g), m2 là khối lượng mẫu và cốc sau khi sấy (g), m0 là khối lượng cốc nung (g)

Sấy chén ban đầu ở 1000C – 1050C trong 3 giờ - 5 giờ

Cân lại chén sau khi sấy đến trọng lượng không đổi (m0)

Cân 1 lượng mẫu khoảng 2 – 5g vào trong chén (m)

Than hóa mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 5500C - 6000C đến khi mẫu có màu trắng Lấy chén ra và chuyển vào bình hút ẩm để 30 phút và tiến hành cân (m2)

Tiếp tục nung trong 1 giờ và cân lại nếu giữa hai quá trình cân không chênh lệch quá 0,01g là dừng

m m

−

− Trong đó: m1 là khối lượng chén nung và mẫu(g), m2 là khối lượng chén nung và tro trắng (g), m là khối lượng chén nung(g)

2.3.7 Định lượng amino acid bằng GC/FID

- Nguyên tắc và cách tiến hành được trình bày ở phụ lục 2.1

2.3.8 Xác định hàm lượng khoáng thành phần bằng phương pháp ICP-MS

- Nguyên tắc và cách tiến hành được trình bày ở phụ lục 2.2

2.3.9 Định lượng acid béo bằng phương pháp ester hóa và phân tích bởi sắc ký khí (GC)

- Nguyên tắc và cách tiến hành được trình bày ở phụ lục 2.3

2.3.10 Xác định hàm lượng NH 3 bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

a Nguyên tắc

Dùng một chất kiềm mạnh hơn NH3 để đẩy NH3 ra khỏi thực phẩm nhưng chất kiềm này không quá mạnh, sau đó dùng thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước lôi cuốn NH3 cho ngưng tụ vào trong cốc hứng chứa dung dịch H2SO4 tiêu chuẩn rồi định lượng phần acid tiêu chuẩn dư bằng dung dịch NaOH tiêu chuẩn

b Tiến hành

Bước 1: Sục rửa thiết bị và kiểm tra độ kín

Bước 2: Chuẩn bị cốc hứng: cho khoảng 20ml H2SO4 0,1N vào trong cốc thủy tinh sau đó cho thêm vài giọt methyl đỏ, đặt cốc hứng dưới đầu ống sinh hàn sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch trong cốc hứng

Bước 3: Cân khoảng 5g mẫu cho vào trong bình cầu, cho thêm nước vào trong bình cầu tới 2/3 thể tích của bình, cho thêm vài giọt chỉ thị phenolphtalein Tiếp tục cho Mg(OH)2 bão hòa trong bình cho tới khi dung dịch trong bình có màu

hồng, nhanh chóng đậy nút bình cầu, kiểm tra độ kín của thiết bị và tiến hành chưng cất, hơi nước và NH3 trong bình bị lôi cuốn chảy về ống sinh hàn gặp lạnh sẽ ngưng

tụ chảy về cốc hứng Quá trình chưng cất kết thúc khi hết NH3 (dùng bình tia rửa sạch đầu ống sinh hàn sau đó dùng giấy đo pH để kiểm tra xem còn lại NH3 hay không), dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ lượng H2SO4 0,1N còn dư cho tới khi cốc hứng chuyển sang màu vàng, kết thúc quá trình chuẩn độ và đọc thể tích NaOH tiêu tốn

Hình 2.2 Quy trình tiến hành tách chiết protein của M Unlusayin et al (2010)

Hòa tan kết tủa

Kiểm tra hàm lượng

protein

2.3.12 Điện di protein bằng phương pháp SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

là phương pháp được Shapiro và cộng sự giới thiệu năm 1967, kể từ đó nó trở thành một phương pháp được sử dụng rộng nhất để phân tích hỗn hợp protein Phương pháp này điện di protein đứng để phân tách các thành phần protein theo trọng lượng phân tử [21]

a Nguyên tắc

Phương pháp diện di SDS-PAGE dựa trên cơ sở các phân tử tích điện âm, khi ở trong điện trường sẽ dịch chuyển về phía anode Tốc độ dịch chuyển của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử: các phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm và ngược lại Kết quả là từ một điểm chung (giếng tải mẫu) các phân tử protein khác nhau trên cùng một làn (lane) sẽ dịch chuyển về một hướng và phân bố

ở các vị trí (các band) khác nhau tương ứng với trọng lượng phân tử của chúng

Protein bị biến tính bởi đun sôi với sự hiện diện của SDS (sodium dodecyl sulfate) SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide, làm biến tính protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, làm cho các phân tử protein trở thành dạng que (Hình 2.3) [18] Số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein Đây là động lực chính để các protein được di chuyển từ cực âm sang cực dương và phân tách theo trọng lượng phân tử khi điện di trong gel

Hình 2.3 Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS SDS có thể phá

vỡ các vùng kỵ nước bằng cách phá vỡ các liên kết cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein, làm các phân tử protein duỗi thẳng mạch, đồng thời SDS liên lết với mạch chính protein làm cho các phân tử này trở nên tích điện âm [22]

Sự phân tách các phân tử protein trên gel phụ thuộc vào nồng độ gel acrylamide được sử dụng Gel 7,5 % tốt cho điểm khởi đầu phân tách các protein chưa biết Các protein có trọng lượng phân tử >100,000 nên được phân tách trong gel 3-5% Gel 5-10% sẽ phân tách các protein trong khoảng từ 20000-150000, và gel 10-15% sẽ phân tách các protein trong khoảng 10000-80000 [21]

Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và biacrylamide Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học Có hai tác nhân hóa học cần thiết, đó là ammonium persulfate làm vai trò peroxide khởi động (initiator peroxidase) và quanternary amine N.N.N’.N’- tetramethylene diamine (TEMED) làm vai trò chất xúc tác Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động, và TEMED làm tác nhân xúc tác Quá trình hình thành gel có sinh nhiệt, do vậy cần phải tối ưu nồng độ tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình này hoàn

tất không quá nhanh (trong vòng 20 đến 60 phút) [21]

Có hai hệ thống điện di, hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục Trong đó, hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục Vì vậy, hiện nay SDS-PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), cải tiến từ

hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964) [18]

Trong hệ thống đệm không liên tục, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp (Hình 2.4) Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp Stacking gel Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là Running gel Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là Tank buffer Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp Stacking gel Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion