a. Nguyên tắc
Dùng hỗn hợp dung môi chloroform : methanol với tỉ lệ 2:1 để hòa tan tất cả các chất béo trong mẫu, tách lớp và chiết qua phiễu lọc nhiều lần. Sau đó làm bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g mẫu.
b. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
Dụng cụ, thiết bị: Tủ host, máy đồng hóa, máy cô quay chân không, tủ sấy chân không, bộ thổi khí N2,phễu chiết 250ml và 200ml, bình cầu 100ml, bình định mức 5ml, ống nghiệm có nắp, ống thủy tinh vial cao 20ml, ống thủy tinh có nắp 4ml, ống xilanh 20ml, giấy lọc GF/C, giá đỡ dụng cụ chiết, micropipette.
Hóa chất: methanol 50% (CH3OH:H2O tỉ lệ 1:1), chloroform, NaCl 0.9%.
c. Tiến hành
Tách lipid từ mẫu
+ Cân 1g mẫu đã được trộn đều, cho vào ống thủy tinh vial cao thể tích 20ml. + Cho thêm 600µl nước cất, 5ml methanol, 10ml chloroform. Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút.
+ Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút.
+ Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch lọc chảy xuống hết hoàn toàn.
+ Cho thêm 5ml methanol và 10ml chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây.
+ Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn.
+ Sử dụng piton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu hết 100ml.
+ Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 50C trong 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành hai lớp.
Chiết rút dung dịch lipid
+ Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hóa hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein …).
+ Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100ml. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và lắng qua đêm ở 50C.
Định lượng lipid
+ Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 370C đến khi thể tích còn lại khoảng 1ml.
+ Hòa tan mẫu còn lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí).
+ Chuyển mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5ml (Vđm).
+ Sau khi xử lý xong dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng. + Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông -200C.
Xác định hàm lượng lipid tổng
+ Lấy chính xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào một ống thủy có nắp 4ml đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi.
+ Làm khô bằng khí nitơ.
+ Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65- 70 (mm Hg) trong 1 giờ.
+ Lipid tổng số (%) tính theo công thức:
%Xt (g/g) = *100 * * ) 0 1 ( Vm m Vdm m m − %Xk (g/g) = *100 * * * ) 0 1 ( Vm T m Vdm m m −
Trong đó: Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu. Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu. m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g).
m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g). m: Trọng lượng cân mẫu (g).
Vđm: Thể tích định mức sau xử lý (ml). Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml). T: Thành phần khô của mẫu, T = (100 – W)/100. W: Độ ẩm của mẫu (%). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});