a. Nguyên tắc
Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh Coomassie, trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỹ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh và có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm.
b. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Thiết bị: Máy đo hàm lượng protein UV/VIS.
Dụng cụ: Buret 10ml, 25ml; ống nghiệm; bình định mức 500ml, bình tam giác 500ml, micropipette (100 -1000µl).
Hóa chất: CBB G250, ethanol 95%, H3PO4 85%, dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100 µg/ml.
c. Tiến hành
- Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (100 µg/ml) theo bảng 2.3.
Bảng 2.3. Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dung dịch BSA (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nước cất (µl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
- Hút 100 µl dung dịch protein vừa pha loãng theo bảng trên, thêm vào 500 µl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (∆OD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tại mỗi nồng độ tiến hành đo 3 lần, sau đó xác định giá trị OD trung bình.
Xác định nồng độ protein của mẫu
- Hút 100 µl dung dịch protein cần phân tích, thêm vào 500 µl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Thực hiện ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ∆OD. Từ đường chuẩn suy ra nồng độ protein mẫu cần phân tích.
Tính kết quả
- Nồng độ protein theo công thức sau :
Nồng độ mẫu = nồng độ tính toán × độ pha loãng