Một số đặc điểm sinh hóa và giá trị dinh dưỡng của trùn biển 4

Một số đặc điểm sinh hóa và giá trị dinh dưỡng của trùn biển

Chương bo LA 2.1 VAT LIEU Trùn bién (Sipunculus nudus) huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa thu nhận vùng ven bờ biển thuộc vào thời điểm khác mùa khô mùa mưa năm 2065 - 2004 Chuột trắng Aus musculius var, Albino tuần tuổi cấp Viện Pasteur Tp.HCM 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp định đanh trùn biển [32] Tiến hành thu nhận xử lý mẫu trùn biển cách cho vào hộp nhựa kích thước 1§x12cm chứa 1⁄3 lớp cát biển lấy khu vực đánh bắt, chuyển đến phịng thí nghiệm Động vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM vòng 24 để định danh mẫu động vật dựa hình thái cấu trúc thể, Mẫu trùn biển rửa nước cất, ngâm dung dịch MgCI; 10% đến xúc tu trùn biển bung ngồi thể, sau cố định alcol 70% Tiến hành định danh theo khóa phân loại động vật cua Linnaeus (1766) 2.2.2 Phương pháp xác định số tiêu sinh lý trùn biển 2.2.2.1 Hàm lượng nước thể[§], [L7] Chọn mẫu mội cách ngẫu nhiên cân tổng trọng lượng tươi, sau sấy khơ mẫu nhiệt độ cố định 70 °C xác định trọng lượng khô không đối Ở thời điểm 2,3, sau sấy, lấy mẫu khỏi tủ sấy, cho vào bình hút ẩm, để nguội, cân lại trọng lượng mẫu Người ta xem bốc nước hoàn toàn hai lần cân thứ cách vài mg (tối đa 5mg) Từ kết trọng lượng tươi trước sấy trọng lượng khô không đổi tính tỷ lệ nước co thé tran biển 2.2.2.2 Xác định pH dịch thể pH môi trường sống trùn biển [17] - Chọn mẫu ngẫu nhiên, rửa mẫu nước cất, mổ khoang bụng thu dịch thể Sử dụng máy đo pH (pH 526) ghi nhận giá trị pH dịch thể trùn biển - Sử dụng pH kế cầm tay (ECO pH - Singapore) đo trực tiếp giá trị pH mẫu nước khu vực đánh bắt trùn biển, 2.2.2.3 Khảo sát khả điều hòa muối thể trùn biển [17] Tạo môi trường lỏng khác với cịng dung tích - Mơi trường Ï: - Mơi trường lÏ: dung dịch muối NaCl từ 15- 30%o - Môi trường HT: nước cất Chọn dung dich Ringer mẫu ngẫu nhiên xác định trọng lượng mdi Vat Cho mẫu trùn biển vào ba mơi trường nói cho chúng ngập dung dịch 120 phút, sau cân xác định lại trọng lượng con, đồng thời kiểm tra lại nổng độ muối ba mơi trường Thí nghiệm thực nhiều lô, lô 10 con, ghi nhận số liệu thống kê tính trị số trung bình 2.2.3 Phương pháp thu mẫu phân tích mẫu phiêu sinh vật Trùn biển sinh sống vùng biển triểu, chúng bắt mồi xúc tu bao quanh miệng, thức ăn trùn biển chủ yếu phiêu sinh lơ lửng môi trường nước biển Chúng tiến hành khảo sát hệ phiêu sinh thực vật phiêu sinh động vật môi trường nước biển vùng triểu hệ tiêu hóa trùn biển nhằm tìm hiểu thành phân thức ăn chúng Tiến hành thu nhận mẫu nước biển (hệ phiêu sinh thu nhận lưới vớt chuyên dụng kiểu lJuday, cố định formalin 5% trường thu mẫu) mẫu nước cất hòa tan thành phần ruột trùn biển (được cố định =1 ba bang formalin 5%) Sau d6, đem đến phịng thí nghiệm Thực vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM tiến hành quan sát hình thái kính hiển vị (vế, chụp hình) định danh lồi phiêu sinh thực vật dựa đặc điểm hình thái [25] Đồng thời, tiến hành định lượng mẫu phiêu sinh thực vật theo phương phdp Sedgewick — Rafter (sử dụng buồng đếm tế bào tích 50x20xÏ ram) Tương tự, tiến hành quan sát xác định loài phiêu sinh động vật phịng thí nghiệm Động vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM dựa đặc điểm hình thái Thực thu nhận phân tích (định tính định lượng) đợi mẫu phiêu sinh vật môi trường nước biển vùng triểu hệ tiêu hóa trùn biển 2.2.4 Phương pháp chuẩn bị mẫu vật trùn biển Trùn biển làm sạch, thu nhận vách thể sấy khô (50°C), Nghiền trần cối sứ xay máy cho nhuyễn sấy lại lần Bột trùn bảo quần bình hút ẩm để thực thí nghiệm phân tích sinh hóa Đối với thí nghiệm vi sinh sinh hóa, trần làm với côn 70” nước cất vô trùng Giải phẫu thu nhận ống tiêu hóa (ruộp) điều kiện vô trùng Tiến hành phân lập vi sinh khảo sát hoạt tính enzym protease, cellulase 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym protease (theo Anson) [8] * Nguyên tắc Casein bị phân giải môi trường kiểm tác dụng protease tạo sản phẩm đoạn pepHd ngắn hòa tan trichloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosin tryptophan hòa tan thuốc thứ Folin *Các hước thực Bước 1: Dung đồ thị chuẩn tyrosin 28 Dung dịch hóa chất Ống nghiệm l 1,0 1,0 0 Dung dịch tyrosin chuan ImM/ (ml) | Lượng tyrosin tương ứng (uM) 0,2 0,4 | 0,6 | 0,8 | 02 | 04 | 0,6 | 0,8 | Dung dich HCl 0,2N (ml) 48 | 46 | 44 | 42 | 4,0 | 5,0 Dung dich NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo mật độ quang bước sóng 660nm 720nm Bước 2: Xác định lượng tyrosIn dung dịch nghiên cứu Dung dịch hóa chất Ống nghiêm Dung dich casein 1% (ml) 5 Dung dich TCA 5% (ml) 10 Enzyme protease (ml) l Dung dich TCA 10 Lắc giữ 35,5°C 5% (ml) Để yên 30 phút, lọc lấy dung dịch bên Lấy ống nghiệm đánh dấu A B Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1, ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm Thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin Lac mạnh, sau 10 phút đo mật độ quang bước sóng 66Ơnm 720nm Tính AOD = ODA - ODạ, dựa vào đồ thị chuẩn suy UM tyrosin *Tính kết Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzym tối thiểu điểu kiện chuẩn (25,%5C, pH 7,6 ) thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1uM tyrosin đồ thị chuẩn uM Tyrosin V.L Hd P= (dvht) Với V: tổng thể tích hỗn hợp ống nghiệm l (ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) m: trọng lượng mẫu enzym xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzym uM tyrosin: lượng HM tyrosin vứm]) suy từ đồ thị chuẩn 2.2.6 Phương phap xac dinh hoat tinh enzym cellulase [8] * Nguyên lắc Cellulase thuộc nhóm enzym thủy phân (hydrolase), enzym thủy phân cellulose cellobiose Để xác định hoạt tính hệ enzym cellulase, thích hợp - CMC (carboxyl methyl cellulose) enzym cellulase tác dụng lên CMC, với cho enzym tác dụng với chất điều kiện xác định Hệ phóng thích phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt tính enzym *+Các bước thực Bước 1: dựng đồ thị chuẩn glucose Bước 2: tạo hỗn hợp phần ứng gồm 3ml dung dich CMC, Im] dung dịch đệm acetat Iml dung dich enzym, ú 40°C Đun cách thủy phút Sau thêm (hoặc pha lỗng với độ pha lỗng L¿) hóa chất dùng định lượng đường khứ theo phương pháp Schaffer-Hartmanmn (mục 2.2.15) Thực tương tự với ống thử không Đựa vào hiệu số thể tích dùng để định lượng ống thử không thử thật, vào đồ thị chuẩn suy lượng glucose (x) tao thành, * Tính kết Mội đơn vị hoạt tính enzym cellulase lượng enzym sau Ì thủy phan cellulose tao Img glucose (6 điều kiện chuẩn pH 5,0, 40°C) 30 HdC=x.V.L,.b: (dvht) Với x : số mg glucose suy từ đường chuẩn V : tổng thể tích phần ứng thủy phân (ml) L, : dd pha loãng mẫu enzym L¿: độ pha loãng dung dịch sau phản ứng thủy phân 2.2.7 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzym thủy phân protein cellulose hệ tiêu hóa trùn biển [S] Mẫu trùn biển thu nhận khu vực khảo sát chuyển nhanh đến phịng thí nghiệm (khoảng sau đánh bất) Chúng tiến hành mổ lấy toàn đoạn ruột, nghiền cối sạch, thu dịch chiết tiến hành phan ứng định lượng hoạt tính enzym protease cellulase theo mục 2.2.5 2.2.6 Tại thời điểm bên ruột trần biển cịn thức ăn từ mơi trường tự nhiên Bên cạnh đó, mẫu trùn biển sau đánh bắt ni phịng thí nghiệm sứ dụng tảo Spirulina làm nguồn thức ăn Sau thời gian ni 72 giờ, tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzym thủy phần nều 2.2.8 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí ky khí (theo Koch) [6] * Nguyên tắc Cấy thể tích xác định dịch huyển phù cần nghiên cứu lên mơi trường đặc trưng sau đếm khuẩn lạc mọc lên Mỗi khuẩn lạc xem kết phát triển từ tế bào Mỗi trường cao thịÈt - pepton (cao thịt 0,5%, pepton 1%, NaC] 0,5% agar 2%, nước biển 1000 ml), Mật độ vi sinh vật biểu diễn đơn vị khuẩn lạc CFU/ gram mau * Các bước tiến hành Bước 1: chuẩn bị dịch pha loãng theo bậc 10 Bước 2: cấy môi trường thạch đĩa petri 3 Bước 3: tính số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian điều kiện nuôi xác định, phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng loại vi sinh vật cần phát *1ính kết Số lượng vi sinh vật 1g chất ban đầu với mức xác suất tin cậy 99% (Py) (x £ 2,7 8x) K ——(CFU/g) V Với x: số khuẩn lạc trung bình mọc từ độ pha lỗng chọn ơx: độ lệch bình phương trung bình NO ,7 chuẩn tin cậy t P= 0,99 K: độ pha loãng dùng để cấy V: thể tích địch huyền phù dùng để cấy 2.2.9 Phương pháp định danh số ching vi khuẩn hiếu khí phân lập từ hệ tiêu hóa trùn biển - Đối với chủng vị khuẩn hiếu khí Gr(+), tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào, ghi nhận số đặc điểm sinh lý sinh hóa, dựa vào khóa phân loại Bergey để định danh chúng vi khuẩn [30] - Đối với chủng vi khuẩn hiếu khí Gr(-), s¥ dung bé kit Bisl4 GNE (Công ty Nam Khoa, TP HCM) để khảo sát số đặc điểm sinh hóa ching vi khuẩn, từ định danh đến giống đến loài (nếu được) 2.2.10 Phương pháp khảo sát khả phân giải protein, cellulose ching vi khuẩn [24] Chuẩn bị môi trường thạch cao thị - pepton (mục 2.2.8) có chứa casein (để phát hoạt tính protease) CMC (để phát hoạt tính cellulase), chia Cấy chủng vi khuẩn cần khảo sát vào hộp petri ủ nhiệt độ 24 giờ, ghi nhận tăng trưởng chúng vị khuẩn 32 Tiến hành nhuộm mơi trường thạch có chứa casein thuốc tht HgCl, (15% HgCh, 20% v/v HCl) 5-10 phút Ghi nhận đo kích thước vịng phân giải (nếu có) chủng vi khuẩn Tương tự, tiến hành nhuộm mơi trường thạch có chứa CMC thuốc thử Lugol Quan sát đo đường kính vịng phân giải cellulose (nếu có) vi khuẩn 2.2.11 Phương pháp thử nghiệm bổ sung vi khuẩn vào bể ni trùn biển điều kiện phịng thí nghiệm Chúng tiến hành lô thử nghiệm bổ sung chủng vi khuẩn phân lập từ đoạn ruột trùn biển vào mơi trường ni điều kiện phịng thí nghiệm nhằm chứng minh vai trị hỗ trợ q trình phân giải thức ăn trần biển chủng vi khuẩn chủ yếu phân lập từ hệ tiêu hóa trùn biển Trùn biển sau thu nhận trải khay vòng 48 để chúng thải toàn cặn bã thức ăn thừa hệ tiêu hóa, sau tiến hành bố trí lơ thí nghiệm ni trùn biển bể có kích thước 15x40x25em Các chúng vi khuẩn (5 ching vi khuẩn gồm chủng hiếu khí chủng ky khí) ni cấy môi trường thạch nghiêng (môi trường cao thịt - pepton) Sau 48 thu nhận toàn khuẩn lạc vi khuẩn vào nước cất vơ trùng (thể tích dịch vi khuẩn 100ml tương ứng với 10 ống thạch nghiêng, ống/chủng vi khuẩn) Các thí nghiệm bố trí sau: Thí nghiệm (NTI): trùn biển (khơng cho ăn) Thí nghiệm (NT2): trùn biển + chủng vi khuẩn Thí nghiệm (NT3): trùn biển + tảo Spirulina Thí nghiệm (NT4): trùn biển + tảo Špirulina + chủng vi khuẩn Theo dõi ghi nhận khả sống trùn biển biến động tổng số vi khuẩn nghiệm thức sau 24 2.2.12 Phương pháp định lượng protein (theo Lowry) [3], [46] * Nguyên tắc Hầu hết protein chứa tyrosin tryptophan Hàm lượng acid amin tùy thuộc vào loại protein, Vì protein loại với có hàm lượng acid amin giống Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành phức chất có màu Cường độ màu phức chất tỷ lệ với hàm lượng tyrosin tryptophan (cũng hàm lượng protein) Vì ta dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protem Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung địch mẫu chifa vai chuc ug protein Tuy nhiên, phương pháp không dùng để định lượng protein không chứa acid amin vòng thơm gelatn *Các bước thực Hút 0,4ml dụng địch protein cần xác định cho vào ống nghiệm sấy khơ Thêm vào 2ml dung dịch C Dung dịch € hỗn hợp dung dịch A (2g Na¿CO; hòa tan NaOH 0,1N thành 10Ôm]) dụng địch B (0,5g CuSO,.5SH;O pha dung dich natri citrat 1% thành 100ml) theo tỷ lệ 49:1 Lắc để yên nhiệt độ phòng phút Tiếp tục thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc 5-10 phúi, thêm nước cất đủ 5ml Đo mật độ quang bước sóng 750nm Lập đề thị chuẩn Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có nồng độ: 0, 59, 100, 150, 206, 250me/ml tt dung dich albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nước cất theo tý lệ khác Lấy ống nghiệm, đánh số từ - 5, cho vào chất tham gia phản ứng theo bảng sau: 34 Ống số | Protein 0,1% (ml) | 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 HạO (ml) | Nồng độ protein (mg/ml) | 10 9,5 9,0 8,5 8,9 7,5 ! 50 100 150 200 250 Hút 0,4m] dung dịch protein có nơng độ khác từ ống nghiệm vừa pha theo thứ tự từ O đến vào bảy ống nghiệm khác (gồm hai ống thử không năm ống từ đến 5) Thêm vào 2ml dung dịch C Lắc để yên nhiệt độ phòng phút Sau đó, thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc — 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, Đo mật độ quang bước sóng 750nm * Tính kết Từ đồ thị chuẩn so sánh mật độ quang ống nghiệm chứa mẫu protein Từ suy hàm lượng protein nguyên liệu a (y/mÙ) Lượng protem (M) có Ígø ngun liệu tính theo công thức: a 10°.n M =—— m (mg protein/g) Với a: hàm lượng protein (y/ml dung dịch) n: hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích 2.2.13 Phương pháp định lượng ammonlac [1ó] * Ngun tắc Sử dụng chất kiểm mạnh ammoniac để muối amonl thể tự (kiểm mạnh ảnh hưởng đến thực phẩm) Dùng nước kéo ammoniac giải phóng thể tự sang bình chuẩn độ, định lượng HạSO,0,1N chất thị 1a alizarin natri sulfonat 2NH,CI + Mg(OH); _—> 2NH, + 2H»,O + MeCh với 35 2NH3 + H,SO, —- (NH,).S80, * Các bước thực Bước 1: Rửa máy cất ammonlac Bước 2: Chưng cất đạm + Tính kết Hàm lượng NHạ 100 gram thuc pham: 1,7 (V-V,) 100 1000 m Vdi V: thé tich H)SO, 0,1N cho vao binh chuan dé, V„: thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng H;SO/ thừa m: khối lượng mẫu dùng định lượng 2.3.14 Phương pháp định lượng đường tổng số hòa tan phan ung mau [8] * Nguyên tắc Đường nhiều chất hữu với điện H;SO, cho phản ứng màu đặc trưng Sự xác kết phụ thuộc vào : -_ Độ dụng cụ sử dụng -_ Độ tinh khiết thuốc thử, -_ Nhiệt độ phải cế định suốt thời gian Ổn nhiệt, *Cách trích đường Cho vào cốc thủy tỉnh (50ml) 0,5g nguyên liệu thêm lƠml 90” Dun sơi cách thuỷ lần Khuấy đều, để nguội lọc qua lọc không tro Tiếp tục cho IƠml cồn §0” vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi cách thuỷ Để nguội, lọc Chiết rút khoảng lần, sau đưa bã lên lọc tráng thêm 2- lần 80” nóng Cho bay rượu cách đun nhẹ sôi nồi cách thủy Sau cho rượu bay hơi, mẫu giữ bình hút ẩm 36 Pha lỗng cặn khơ thành 50ml Khi đem làm màu, dung dịch pha loãng thêm lần Phản ứng màu dung dịch đường thực theo ba cách: dùng phenol, antron orcinol Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp dùng phenol Thực hành: Lần lượt hút xác vào bình định mức 100ml lượng dung dịch saccharose mẫu 0,1% theo thứ tự: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml cho nước cất tới vạch, lắc Sau cho Iml vào ống nghiệm tiến hành nhuộm màu phenol H;SO/, Số ống 10 | 1] ml saccharose 0,1% mau ml nước cất 1 1 1 1 0 |0 Nông độ đường mỗi| | | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 ml đường định nồng độ ống (ug/ml) 010101010 };0 4} 4] | 10 10 |60|70 | x | x Dung dich phenol 5% ] ] l ] ] l ] l HaS0a đậm đặc 5 5 5 5 5 Để yên 10 phút lắc Sau ổn nhiệt 25 — 30 °C tạo màu Màu bén vai gid Đo mật độ quang bước sóng 490nm * Tính kết Trị số mật độ quang (OD) ống chuẩn sau trừ trị số ống thử không xác định đồ thị mẫu Với dung dịch cần định nồng độ, trừ trị số ống thử không chiếu vào đồ thị mẫu để suy nồng độ x, từ tính % lượng đường có mẫu nguyên liệu % đường = Mp m Với mp: khối lượng đường m: khối lượng nguyên liệu .100% 37 2.2.15 Phương pháp định lượng đường khử (theo Schaffer-Hartmamn) [§] * Nguyên tắc Theo định luật tác dụng khối lượng, pha trộn dung dich ion Cu”? với KI ta có cân hóa học sau: Cu” + 47 2 Cu’ +2041 Nếu có chất nhận hết ion Cu”, ví dụ oxalat kali, dung dịch lúc có chất oxalo Cu” va I, khơng có iod tự Nếu thêm vào lượng thừa KIO; va acid hóa dung dich, 10, gap I sé phong thich mội lượng thừa iod A Nếu ta khử phần hóa hợp oxalo Cu”” thành Cu” (ví dụ đường khử) Cu”” + 2OH > Cu* +H,O0 +0 -CHO +0 -— -COOH Va acid hoa sau: SKI + KIO, + 3H,SO, > 1, + HạO + K;SO¿ lon Cu” kết hợp với lượng T cho Cul Do acid hóa, phần T cịn lại tác dụng với KIO¿ thừa để phóng thích lượng iod a Vì hiệu số (A-a) tương ứng với lượng đường tham dự vào phản ứng * Các hước thực Thực ống nghiệm theo bang sau: Ông số L7 Dung dich glucose mau (0,2mg/l) (ml) Nude cat (ml) Nông độ đường Ong (mg/ml) | Dụng địch đường cần định phân (ml) | | ] ] (0/04 3 0,08 | 0,12 Q 5) |7 I [0,16 9,20) 0 x 0 Cho vào ống 5ml thuốc thử Schaffer- Hartmann, lắc đều, đun sôi cách thủy 15 phút, làm lạnh đưới vịi nước, sau thêm vào ống 5ml H;SÒ, 2N, lắc để yên phút để hịa tan Cu¿O Định phân l; phóng thích với Na;S5;O; N/200 với thị hồ tình bột 38 * Tính kết Lập hiệu số ống thử không va` thử thật Vẽ đồ thị mẫu với hiệu số ống 2, 3, 4, 5, suy nồng độ (x) dung dịch đường ống 2.2.16 Phuong phap dinh lugng lipid thé (theo Soxhlet) [8] * Nguyên tắc Nguyên liệu làm khơ, trích lipid diethy] ether (máy Soxhlet) xác định khối lượng chất béo * Các bước thực Giấy lọc bột trùn sấy khô tuyệt đối Cân ghi nhận khối lượng (khoảng gram) - Cho mau vao may Soxhlet Dé diethyl ether vao binh cau (3/4 thé tích bình cầu) Lắp cột làm lạnh cho nước hoàn lưu -_ Tiến hành đun cách thủy (nhiệt độ 40 — 44 °C) trich lipid khoảng 12 -_ Gắn bình cầu vào ống hồn lưu để thu hồi dung mơi -_ Đổ cặn lipid vào cốc đốt 100ml khô, cân xác trọng lượng Tráng kỹ bình cầu lần 10ml ether đổ vào cốc đốt -_ Đun cách thủy nhẹ đuổi ether, sau sấy 100 — 105 °C -_ Để nguội, đặt bình hút ẩm, cân xác khối lượng cốc * Tính kết Hàm lượng lipid thơ ngun liệu : % lipid = Với 100 (m,; - mạ) m m¡: khối lượng cốc đốt có chứa lipid mạ: khối lượng cốc đốt không m : khối lượng nguyên liệu 39 2.2.17 Phương pháp xác định số lipid [20] 2.2.17.1 Chỉ số acid * Nguyên tắc Độ acid dâu (mỡ) hay số acid dầu (mỡ), số miligram (mg) KOH cần thiết để trung hịa acid béo tự đo có Í gram mỡ * Các bước thực Cho vào erlen gram lipid, 5ml ethanol, giọt phenolphtalem 0,5% côn Chuẩn độ dung địch KOH 0,1N dung địch chuyển sang màu hồng * Tinh két qua im] KOH 0,1N tudng ng 5,6mg KOH Do đó, lượng KOH dùng để chuẩn độ acid béo tự có gram chất béo (lipid) la C = 5,6.V.f Với C: số acid V: lượng dung dịch KOH 0,IN dùng để chuẩn độ f: hệ số điều chinh cha dung dich KOH 0,1N 2.2.17.2 Chi s6 iod Chỉ số iod số gram iod c6 thé phan ting hét vdi 100 gram chat béo (lipid) * Nguyên tắc Xác định số iod đựa khả iod kết hợp với acid béo chỗ liên kết kép: R-CH=CH-R + lạ + HO = RCH-CH-R m [ OH * Các bước thực Cho vao erlen 0,1- 0,2 gram lipid va 10m! ethanol 96%, sau dé cho chinh xac LOml iod 0,1N cén Lac déu, dé yén 15 phút Sau 15 phút, chuẩn độ 40 Na;SzO; 0,1N, có màu vàng nhạt, thêm 1ml hồ tinh bột 1%, chuẩn độ tiếp màu xanh Thực thử không với lượng lipid thay nước cất, * Tính kết 1ml Na;5;O; 0,IN tương ứng 12,69mg I, Chỉ số iod tính theo cơng thức (Vi- V2) f 12,69 100 C= m 1000 Véi V: lugng Na2S,03 0,1N da ding để chuẩn độ bình thử khơng (mì) V¿ạ: lượng Na;S;Os 0,1N dùng chuẩn độ bình thử thật (ml) f: hệ số hiệu chỉnh dung dịch Naz§zOs 0,1N m: lượng lipid dùng cho thí nghiệm (ø) 2.2.18 Phương pháp phân tích thành phần acid amin protid trùn biển Sắc ký lỏng cao 4p (HPLC- High performance liquid chromatography) kỹ thuật tách dựa vào phân bố khác hợp chất hai pha: pha tĩnh pha động [35] Thành phần acid amin protid trùn biển phân tích theo phương pháp sắc ký lồng cao áp Trung tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm TP.HCM Các điều kiện thông số vận hành máy HPLC: - Pha động: gồm pha động A (940ml dung dich CH;COONa + TEA (triethylamin) pha với 60m] acetomitril nguyên chất) pha động B (dung dich acetonitril 60%) - T6c độ dòng: 1,0ml/phút - _ Bước sóng hấp thu: A= 254nm - - Loại cột: PIcoTag 150x3,9mm - Đầu dò: UV - Bơm: LC 10AD (Shimadzu) -_ Nhiệt độ cột: 40— 43C - _ Thể tích mẫu nạp: 20Hl - thời gian phân tích: 30 phút 2.2.19 Phương pháp phân tích thành phần nguyên tố khoáng vách thể trùn biển Thành phần nguyên tố khoáng diện vách thể trần biển phân tích theo phương pháp quang phổ phát xạ Trung tâm Phân tích thí nghiệm thuộc Liên đồn Bán đổ Địa chất Miền Nam 2.2.20 Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát số tiêu sinh lý chuột trắng sử dụng thức ăn bổ sung bột đạm trịn biển Tiến hành thí nghiệm bổ sung bột đạm trùn biển (sinh khối vách thể trùn biển) vào phần ăn chuột trắng đánh giá hiệu tác động dựa vào số chí tiêu sinh lý chuột như: khả tăng trọng; số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin; hàm lượng protein toàn phần, albumin va globulin huyết thanh, trạng thái sinh lý hoạt động chuột Chuột trắng tuần tuổi, khơng phân biệt giới tính, ni ổn dinh | tuần trước tiến hành thử nghiệm Bố trí lơ thí nghiệm, lơ con, bố trí phần ăn sau: ®- Lơ thí nghiệm Í (TNI): chuột ni thức ăn viên Viện Pasteur TP.HCM cung cấp, với thành phần gồm bột cá, bột đậu nành e L6 thi nghiém (TN2): chuột nuồi viên cám gạo e® Lơ thí nghiệm (TN3): chuột ni viên cấm gạo có bổ sung 10% đạm casein (Trung Quốc) 42 e©_ Lơ thí nghiệm (TN4): chuột ni viên cám gạo có bổ sung 10% bột đạm trùn biển Đánh dấu lơ thí nghiệm, sau ngày tiến hành khảo sát đặc điểm sinh lý con, thời gian theo dõi tuần thí nghiệm lập lại lần 2.2.21 Phương pháp định lượng protein huyết phản ứng Biure [28] * Nguyên tắc Protein (có liên kết pep0d) tác dụng với CuSO¿ NaOH tạo thành phức chất có màu tím hồng So với biểu đồ mẫu để tính lượng protein *Các bước thực Bước 1: Dựng thị chuẩn Bước 2: Định lượng protein tồn phần huyết Cho vào ống nghiệm 0,05ml huyết 0,95m] NaCl1 9%, sau cho 4ml thuốc thử Gocnan Trộn đều, để 30 phút nhiệt độ phịng Đo mật độ quang với bước sóng 550nm Thực tương tự với ống thử không (1ml NaCl 9% 4ml thuốc thử Gocnan) * Tính kết So với đồ thị chuẩn tính lượng protein 100ml huyết 2.2.22 Phương pháp định lượng albumin globulin huyết [28] * Nguyên tắc Globulin kết tủa natrisulphat (Na;SO,) tách riêng ly tâm sau bảo hòa dung dịch với ether ethylic *Các bước thực Cho 0,2ml huyết vào ống ly tâm 4ml Na;SO¿ 23%, lắc Lập tức đong thêm 1ml hỗn hợp để định lượng protein toan phan theo muc 2.2.21 Sau 1ml ether vào hỗn hợp lại Đậy nút, lắc mạnh 20 giây Ly tâm nhanh 10 phút Globulin đóng thành bánh lớp ether dung dịch NaaSO 43 Ống P: 1ml hỗn hợp huyết Na;SOu, Ống A: Iml dung dich Na;SÔ¿ (dùng pipet xuyên qua lớp bánh globulin xuống lớp Na;SO/ bên dưới) Ong T: Iml dung dich Na SO, 23% Thêm vào ống 3ml thuốc thử Gocnan, lắc đều, để tiếp xúc 30 phút Đo mật độ quang với bước sóng 55Ơnm * Tính kết Gọi E mật độ quang học E (ống P) hệ số albumin = protein toàn phần (g)/ 100m1 E (ống A) hệ số albumin = albumin (g)/ 100m Protein toàn phần — albumin = globulin (g)/ 100ml Hệ số albumin = s6 protein toan phan 2" _ 81 2.2.23 Phương pháp xác định số lượng hồng cầu phịng đếm [15], [2§] * Ngun tắc Pha lỗng máu tỷ lệ định, sau cho máu vào phịng đếm biết rõ kích thước, đếm kính hiển vi thể tích định, từ tính số lượng hồng cầu có lmm” mấu * Các bước thực Bước L: sát trùng chích máu Bước 2: hút máu pha loãng ống trộn hồng cầu Hút máu vào ống trộn đến vạch 0,5, hút lần lên tục tránh không để cột máu bị ngắt quãng bọt khí Tiếp tục hút dung dịch đếm hồng cầu đến vạch 101 Lắc ống trộn thật  ... nhận số liệu thống kê tính trị số trung bình 2.2.3 Phương pháp thu mẫu phân tích mẫu phiêu sinh vật Trùn biển sinh sống vùng biển triểu, chúng bắt mồi xúc tu bao quanh miệng, thức ăn trùn biển. .. dựa đặc điểm hình thái Thực thu nhận phân tích (định tính định lượng) đợi mẫu phiêu sinh vật môi trường nước biển vùng triểu hệ tiêu hóa trùn biển 2.2 .4 Phương pháp chuẩn bị mẫu vật trùn biển Trùn. .. (NT2): trùn biển + chủng vi khuẩn Thí nghiệm (NT3): trùn biển + tảo Spirulina Thí nghiệm (NT4): trùn biển + tảo Špirulina + chủng vi khuẩn Theo dõi ghi nhận khả sống trùn biển biến động tổng số vi