Phát hiện vi khuẩn salmonella bằng phương pháp realtime PCR

PCR cổ truyền khác nhưng hiện nay ở nước ta chưa có một công trình nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được công bố.. Xuất phát từ thực tế

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Thu Thủy và TS Nguyễn Văn Duy đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường cùng quý thầy cô giáo trong Viện đã tận tình dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, giúp tôi có một nền tảng vững chắc để bước vào đời

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi, luôn bên cạnh an ủi và động viên tôi giúp tôi có thêm sức mạnh để vượt qua những khó khăn và có niềm tin vào cuộc sống

Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Minh Nhật, bạn Phạm Thị Huế lớp 49 SH và 2 em Lê Thị Vân và Nguyễn Thị Ngọc Bích lớp 50 SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

LỜI NÓI ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 3

1.1.1 Phân loại Salmonella 3

1.2.2 Các đặc điểm sinh học của Salmonella 4

1.2.3 Kháng nguyên của Salmonella 7

1.2.4 Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella 9

1.2.5 Gen độc tố invA của Salmonella 11

1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra 14

1.2.1.Trên thế giới 14

1.2.2 Ở Việt Nam 15

1.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella 16

1.3.1 Phương pháp PCR 17

1.3.2 Phương pháp Realtime PCR 19

1.4 Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 22

1.4.1 Tính cấp thiết của đề tài 22

1.4.2 Mục tiêu của đề tài 22

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Mẫu 24

2.1.2 Thiết bị chuyên dụng 24

2.1.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phân lập và nuôi cấy Salmonella 31

2.3.2 Nhuộm Gram 34

2.3.3 Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System 35

2.3.4 Xác định nồng độ DNA bằng điện di gel agarose và đo OD 36

2.3.5 Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella 38

2.3.6 Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 43

3.2 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram 46

3.3 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 47

3.3.1 Khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella 47

3.3.2 Khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella 50

3.4 Tách chiết DNA tổng số 51

3.5 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52

3.5.1 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52

3.5.2 Kết quả chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 53

3.5.3 Kết quả khảo sát nồng độ mồi invA1,2 55

3.5.4 Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 56

3.6 Phản ứng Realtime PCR khuếch đại đoạn gen invA 57

3.6.1 Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 57

36.2 Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 58

3.6.3 Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại 60

3.6.4 Kết quả xây dựng đường chuẩn Realtime PCR phát hiện Salmonella 62

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp : Base pair

BPW : Nước pepton đệm (Buffer Pepton Water)

CFU : Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit)

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate

dsDNA : Double Strand Deoxyribonucleic Acid

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ELISA : Kỹ thuật miễn dịch men (Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay) FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (Food and Drug Administration) LDC : Lysine Decarboxylase

OD : Mật độ quang (Optical Density)

PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)

PE : Polyethylene

RNA : Ribonucleic Acid

RV : Rappaport – Vassilisdis

SPI : Hệ thống gen gây độc (Salmonella pathogenicity island)

TBE : Tris Boric acid EDTA

TNF : Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)

TSA : Tryptone Soya Agar

VP : Voges – Proskauer

WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella 4

Bảng 1.2 Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella 7

Bảng 1.3 Kháng nguyên của một số chủng Salmonella 9

Bảng 1.4 Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen 12

Bảng 2.1 Các thông số của cặp mồi invA1,2 39

Bảng 3.1 Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng 45

Salmonella phân lập được 45

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella 50

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn Salmonella 51

Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi 5

Hình 1.2 Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella 8

Hình 1.3 Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S typhimurium 13

Hình 1.4 Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S typhimurium 13

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR 20

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 30

Hình 2.2 Quy trình phân lập Salmonella 32

Hình 3.1 Các chủng Salmonella sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường RV ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 44oC 43

Hình 3.2 Các khuẩn lạc của Salmonellas sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường XLD ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37oC 44

Hình 3.3 Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn S2 sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37oC 44

Hình 3.4 Tế bào của chủng vi khuẩn S2 sau khi nhuộm Gram 47

Hình 3.5 Thí nghiệm lên men đường của các chủng vi khuẩn Salmonella 49

Hình 3.6 Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 51

Hình 3.7 DNA tổng số của các chủng Salmonella 52

Hình 3.8 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 53

Hình 3.9 Kết quả khảo sát độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 54

Hình 3.10 Kết quả khảo sát nồng độ mồi của cặp mồi invA1,2 56

Hình 3.11 Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 57

Hình 3.12 Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58

Hình 3.13 Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59

Hình 3.14 Biểu đồ nóng chảy (Melt curve chart) của phản ứng Realtime PCR 61

Hình 3.15 Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Melt curve peak chart) của phản ứng Realtime PCR 62

Hình 3.16 Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR 63

LỜI NÓI ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm hiện đang là vấn đề cấp thiết và đáng lo ngại của toàn cầu Số vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng cao đặc biệt là các vụ ngộ độc thực phẩm hàng loạt Các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể là do tác nhân sinh học (vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng ), tác nhân hóa học, tác nhân vật lý hay do các tác nhân khác Trong đó tác nhân sinh học là nguyên nhân phổ biến và nguy hiểm nhất đặc biệt là các vi khuẩn và độc tố của chúng tiết ra Chúng không chỉ gây hại cho sức khỏe của người tiêu dùng một cách tức thì mà còn có thể

gây ra những hậu quả nghiêm trọng và lâu dài

Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có hơn 2.500

kiểu huyết thanh (serotype), là các trực khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí tùy ý,

có thể di động, có khả năng sinh hơi khi lên men dextrose Chúng được tìm thấy phổ biến trong các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như: các loại thịt,

trứng, hải sản và các sản phẩm từ chúng Vi khuẩn này được xác định là tác nhân

gây nhiễm độc thức ăn nguy hiểm nhất hiện nay Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn

ở người, Salmonella còn gây ra các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương

hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh

về đường hô hấp ở cả người và động vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe và nền kinh

tế của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Việt Nam

Do vậy, việc phát hiện sớm Salmonella là rất cần thiết Tuy nhiên ở Việt Nam, việc phát hiện Salmonella hầu hết chỉ dựa trên phương pháp truyền thống:

nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch Các quy trình này rất phức tạp, độ nhạy thấp và đặc biệt là rất tốn thời gian ít nhất phải mất từ 2 đến 6 ngày Đó cũng là lý do giải thích vì sao để tìm được nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm phải mất cả tuần Kỹ thuật Realtime PCR là kỹ thuật sinh học phân

tử mới được phát triển từ kỹ thuật PCR truyền thống có độ nhạy cao, vừa cho kết quả định tính vừa kết quả định lượng và đặc biệt là rút ngắn thời gian phát hiện (<

24 giờ) so với các phương pháp truyền thống và các phương pháp sinh học dựa trên

PCR cổ truyền khác nhưng hiện nay ở nước ta chưa có một công trình nào về ứng

dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được

công bố

Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng

phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:

 Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua

tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa

 Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở

khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm

 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

1.1.1 Phân loại Salmonella

a Phân loại khoa học

Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:

Loài: Salmonella bongori & Salmonella enterica

b Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên

Ðến nay người ta đã xác định được hơn 2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi

Salmonella Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S enterica và S bongori S enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S enterica (S enterica I), S salamae (S enterica II), S arizonae (S enterica IIIa), S diarizonae (S enterica IIIb), S houtenae S enterica IV) và S indica (S enterica VI) Loài S bongori còn được gọi là Salmonella V ( Popoff, 2001)

Các kiểu huyết thanh này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen) (Popoff, 2001; WHO, 2005) Kháng nguyên O là chuỗi phức hợp lipopolysaccharide nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn Kháng nguyên H được tạo thành bởi các tiểu phần protein roi (flagellin) Sự đa dạng về vùng giữa của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H Một

số kiểu huyết thanh như là S typhi, S paratyphi C, S dublin còn có thêm kháng

nguyên vi Đây là loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polysaccharide của vi sinh vật, có liên quan đến tính độc riêng với tế bào chủ

Các kiểu huyết thanh gây bệnh cho người và động vật máu nóng chủ yếu

nằm trong S enterica I chiếm tới 99,5% Dưới loài này có 1.478 kiểu huyết thanh

S enterica II có 498 kiểu huyết thanh, S enterica IIIa có 94 kiểu huyết thanh, S enterica IIIb có 327 kiểu huyết thanh, S enterica IV có 71 kiểu huyết thanh, S enterica VI có 12 kiểu huyết thanh và S.bongori (V) có 21 kiểu huyết thanh (Bảng

1.1)

Bảng 1.1 Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella

(Nguồn: Popoff, 2001)

1.2.2 Các đặc điểm sinh học của Salmonella

a Đặc điểm hình thái của Salmonella

Năm 1880, Eberth là người đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella được

phân lập từ lát cắt lách, hạch bạch huyết của bệnh nhân sốt thương hàn dưới kính

hiển vi điện tử

Loài Salmonella Dưới loài Số kiểu huyết thanh

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi

(Tế bào vi khuẩn có hình que, có lông xung quanh ) Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, là vi khuẩn

Gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 µm x 2 – 5 µm (Holt, 2002) Đa số các loài đều có khả năng di động mạnh do có lông xung quanh thân trừ

S gallinarum và S pullorum gây bệnh cho gia cầm Vi khuẩn dễ nhuộm màu với

các thuốc nhuộm thông thường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, bắt màu đều ở toàn thân hay đậm ở hai đầu

b Tính chất nuôi cấy

Salmonella vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt độ

thích hợp là 37oC nhưng có thể phát triển được từ 6 – 42oC, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9 (Holt, 2002) Ở pH > 9 hoặc < 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 15 phút và 100oC trong 5 phút

- Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn đều, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, hơi ướt và trông lóng lánh

- Trên môi trường Macconkey: Ở 35 – 37oC sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa

- Trên môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): Nuôi cấy ở nhiệt độ

37oC vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn bóng, lồi, có chấm đen ở giữa,

đế môi trường màu hồng đậm (Aspinall, 1992)

- Trên môi trường SS (Salmonella – Shigella): Ở nhiệt độ 35 – 37oC, sau 18 – 24 giờ vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, không màu, nhẵn bóng và có chấm đen

ở giữa

- Trên môi trường KIA (Kliger – Iron – Agar): Vi khuẩn lên men đường glucose

và không lên men đường lactose, nên phần thạch nghiêng vẫn giữ màu đỏ, phần thạch đứng đổi màu vàng, nếu vi khuẩn có sinh H2S môi trường màu đen, vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch (Aspinall, 1992)

Ở một số loài như S paratyphi B, S cholerae suis khi nuôi cấy trên thạch

peptone dày, sau 1 – 2 ngày khuẩn lạc hình thành bờ có chất dính, chất keo bọc Trên thạch thường, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (Rough) nhám, mặt trong mờ

c Đặc tính sinh hoá

Salmonella có những đặc tính sinh hoá chủ yếu mà dựa vào đó mà người ta

có thể định hướng và phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác Mỗi loại

Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi Phần lớn các chủng Salmonella lên men có sinh hơi các loại đường như glucose, mantose,

mannitol, galactose, arabinose (WHO, 2010)

Một số loài Salmonella cũng lên men các đường trên nhưng không sinh hơi như: S abortus equi, S abortus bovis, S abortus ovis, S typh suis, S typhi,

Riêng S pulllorum không lên men đường mantose, S choleraesuis không lên men

đường arabinose Hầu hết các Salmonella không lên men lactose, saccharose

Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không

sản sinh indol, một số sử dụng được cacbon ở dạng citrat, phân giải xanh methylen,

phản ứng MR (Methyl red), catalase dương tính (trừ S choleraesuis, S gallinarum

và S pulllorum), phản ứng H2S dương tính (trừ S paratyphi A, S abortus equi, S typhi suis) (Funk và cs, 2000; WHO, 2003)

Bảng 1.2 Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella

1.2.3 Kháng nguyên của Salmonella

Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O); kháng nguyên roi (H) và kháng nguyên vi Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ lipopolysaccharide

gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn Nội độc tố gồm 3 lớp: lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A)

(Nguồn: http://www.kilobooks.com)

a Kháng nguyên thân O

Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O (lipopolysaccharide) khác nhau

Kháng nguyên O có cấu trúc dạng sợi lipopolysaccharide được bộc lộ trên bề mặt tế bào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh Kháng nguyên O gồm hai phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang Phần nhân cơ bản giống nhau

trong tất cả Salmonella Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị oligosidic

lặp lại Chính các chuỗi ngang này quyết định tính đặc hiệu của mỗi nhóm

Salmonella

b Kháng nguyên vi

Kháng nguyên vi là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vi khuẩn, nó

có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành Chức năng chính của kháng nguyên vi là khả năng kết dính, tương tác với vi khuẩn và với các nhân tố khác

Kháng nguyên vi có ở một số kiểu huyết thanh như: S typhi, S paratyphi C và S dublin

Kháng nguyên H (Roi)

Màng trong

Lớp peptidoglycan

Kháng nguyên Vi Kháng nguyên O

Màng ngoài Tua riềm

Nội bào

Hình 1.2 Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella

c Kháng nguyên roi H

Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các

kiểu huyết thanh của Salmonella Các protein này vừa tham gia chức năng cấu trúc

vừa có khả năng đáp ứng miễn dịch cao Do đó kháng nguyên H được chọn làm đối tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ cho việc tạo vacxin tái tổ

Kháng nguyên O (somatic)

Kháng nguyên roi H (flagella)

Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người hoặc chỉ gây

bệnh cho động vật, nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người và vừa gây bệnh

cho động vật Trong đó những loài Salmonella có thể gây bệnh cho người được

quan tâm nhiều hơn cả Ví dụ:

- S typhimurium và S enteritidis: Vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có

khả năng gây bệnh cho động vật, có thể gặp ở các nước khác nhau trên thế giới Chúng là căn nguyên chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do

Salmonella

- S typhi: Chỉ gây bệnh cho người, là vi khuẩn quan trọng nhất trong các căn

nguyên gây bệnh thương hàn (typhoid fever)

- S paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ phân lập đứng sau S typhi

- S choleraesuis: Là nguyên nhân thường gặp trong các ca nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta

- S paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh cho người, nhưng cũng có thể gây bệnh cho

động vật Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập cao hơn ở nước ta

- S paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây

bệnh viêm dạ dày – ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường gặp ở các nước Đông Nam Á

b Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn (typhoid fever) do S typhi và các S paratyphi A, B, C gây

ra Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 105 đến 107 cfu/g

Sau khi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột Ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàng bắt đầu xuất hiện Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác, tới gan theo mật đổ xuống rồi được đào thải qua phân; Tới thận, một số vi khuẩn được đào thải ra ngoài theo nước tiểu

Vi khuẩn thương hàn gây bệnh bằng nội độc tố Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị trí tổn thương thường ở các mảng payer Đây là biến chứng hay gặp do bệnh nhân ăn sớm chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng

Nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất

ba Giai đoạn toàn phát thân nhiệt tăng cao, sốt “hình cao nguyên” Thân nhiệt tăng

nhưng nhịp tim không tăng Bệnh nhân thường có dấu hiệu li bì, có thể hôn mê, trụy tim mạch, tử vong Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng lâm sàng khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại trong túi mật Tình trạng này có thể kéo dài nhiều năm Họ trở thành nguồn lây bệnh rất nguy hiểm

Bệnh phó thương hàn (paratyphoid fever) có những triệu chứng như bệnh sốt thương hàn nhưng nhẹ hơn

c Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bệnh xảy ra thường là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm

bị nhiễm Salmonella S typhimurium và S enteritidits là tác nhân chính gây ra các

vụ ngộ độc thực phẩm ở người 75% các vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm như hải sản, thịt, trứng bị nhiễm 2 chủng vi khuẩn này (Lee và cs, 2009)

Thời gian ủ bệnh trung bình kéo dài từ 10 đến 48 giờ Đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ vài giờ Sau thời gian ủ bệnh, bệnh nhân lên cơn sốt, nôn và ỉa chảy Khác với sốt

thương hàn, bệnh nhân ngộ độc do nhiễm Salmonella chỉ sốt nhẹ có trường hợp

không có dấu hiệu sốt Ở người lớn, rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi tự khỏi

Một số rất ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn, có thể kéo dài nhiều tháng

1.2.5 Gen độc tố invA của Salmonella

Đến nay genome của nhiều chủng Salmonella đã được giải trình tự và công

bố (Bảng 1.4) Bộ gen của Salmonella dài hơn 4,5 Mbp trong đó thành phần GC

chiếm 50 – 52% Genome của các chủng Salmonella không giống nhau khác nhau

ở chiều dài hệ gen và thành phần GC Ví dụ như chiều dài hệ gen của S.typhi là 4.809.037 bp, trong đó thành phần GC chiếm 52,09% còn của S typhimurium là

4.857.432 bp và 52% Theo nghiên cứu gần đây nhất, hệ gen 2 chủng này khác nhau 10 – 15%

Bảng 1.4 Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen

Chủng huyết thanh (Serovar) Đơn vị thực hiện

Diarizonae CDC 01-0005 Đại học Washinton St Louis

Paratyphi A ATCC9150 Đại học Washinton St Louis

(Nguồn: http://www.salmonella.org) Genome của Salmonella có 5 hệ thống gen gây độc là SPI – 1 (Salmonella

pathogenicity island), SPI – 2, SPI – 3, SPI – 4 và SPI – 5 Tất cả các kiểu huyết

thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm

vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh Cụm

gen này nằm trong hệ thống gen SPI – 1 có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S enterica I InvA là một bản gen luôn có mặt trong cụm gen inv Do vậy trong nhiều nghiên cứu, gen invA được sử dụng để xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella (Rahn

và cs, 1992; Chiu và Ou, 1996; Daniele và cs, 2006) Ngoài gen invA người ta còn

sử dụng trình tự 16S rRNA (Fey và cs, 2004), agfA (Doran và cs, 1993), viaB (Hashimoto và cs, 1995), spvR (Mahon và Lax, 1993), spvC (Chiu và Ou, 1996)

1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra

1.2.1.Trên thế giới

Salmonella là một trong những chủng vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay

Bất kỳ thực phẩm tươi nào có nguồn gốc từ động vật như thịt gia súc, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm của chúng, hải sản cùng với một số rau, quả đều có thể nhiễm

vi khuẩn Salmonella (Malonry và cs, 2004) Salmonella có thể xâm nhiễm và gây

bệnh cho người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dưới nước và trên cạn Đây là nguyên căn chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm, bệnh thương hàn và phó thương hàn ở nhiều quốc gia trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới có

hơn 1,3 tỉ trường hợp bị nhiễm Salmonella trong đó xấp xỉ 3 triệu trường hợp tử

vong (Lee và cs, 2009)

Trong đó, chỉ tính riêng ở Mỹ, hàng năm có tới 1,34 triệu người nhiễm

Salmonella (Lee và cs, 2009) Trong số đó có 25,6% trường hợp phải nhập viện và

khoảng 30,6% trường hợp tử vong gây tổng thiệt hại kinh tế lên tới hàng tỉ USD

Trong thời gian gần đây, các vụ ngộ độc hàng loạt do Salmonella liên tiếp xảy ra ở

Mỹ Sau biến cố ngộ độc thực phẩm do cà chua nhiễm khuẩn Salmonella xảy ra vào

tháng 6 năm 2008 khiến trên 250 người mắc bệnh và làm một người chết, đến năm

2009, Salmonella lại xuất hiện trở lại trong các sản phẩm có chất bơ như bánh quy

giòn, các thanh kẹo và kẹo bơ đậu phộng của ít nhất 343 công ty thực phẩm ở 46

tiểu bang của Mỹ làm trên 400 người bị bệnh và ba người tử vong Ngoài ra các

sản phẩm khác như trứng, xúc xích cũng bị nhiễm Salmonella với tỷ lệ rất cao, gây

ra các cơn đại dịch Salmonella ở đất nước này Các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi

hơn 560 tấn xúc xích do Công ty Daniele International sản xuấtdo nghi bị nhiễm vi khuẩn này Đặc biệt là theo thống kê gần đây nhất của Trung tâm an toàn về Trứng (Egg Safety Center) vào năm 2010 cứ 20.000 quả trứng ở Mỹ lại có một quả có

chứa vi khuẩn Salmonella (chiếm hơn 1% số lượng trứng tiêu thụ mỗi năm) trong

đó vi khuẩn S enteritidis chiếm tỷ lệ cao nhất đã làm cho 1.300 người mắc bệnh

trong vòng từ tháng 5 đến tháng 7 nhiều gấp ba lần so với mức trung bình hằng năm của giai đoạn này

Cũng tương tự, ở Đan Mạch, theo thống kê năm 1995 có 2.911 trường hợp

nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và

các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này Đến năm 2001, tổng chi phí để khắc

phục hậu quả do Salmonella lên tới 25 triệu USD

Theo số liệu thống kê của Pháp năm 1995, trong số 7.449 bệnh nhân bị

nhiễm độc thức ăn đã có tới 3.131 bệnh nhân do Salmonella gây ra

Năm 1999, ở Hàn Quốc nghiên cứu cho thấy 25,9% mẫu thịt gà tươi sống

cũng bị nhiễm Salmonella

S enterica nhóm I hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan trọng nhất trong số các chủng Salmonella

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, mặc dù chưa có thống kê nào về thiệt hại do Salmonella gây

ra, nhưng theo báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho thấy, mức độ nhiễm khuẩn trong các sản phẩm chăn nuôi như thịt lợn, thịt bò, thịt

gà ở Hà Nội là 100%, trong đó 40% là nhiễm Salmonella Salmonella có thể nhiễm

vào các sản phẩm này ở tất cả các khâu tính từ khâu chăn nuôi, giết mổ, vận

chuyển đến khâu bảo quản Ở nước ta tỷ lệ động vật nuôi bị nhiễm Salmonella là

rất cao đặc biệt là ở lợn và bê ghé

Ngoài ra, trong những sản phẩm được coi là đảm bảo để xuất khẩu cũng

chứa Salmonella Chỉ trong 3 tháng cuối năm 2001, Cơ quan Lương thực và Dược

phẩm Mỹ (FDA) đã tịch thu và tiêu huỷ hàng trăm lô thực phẩm được nhập khẩu từ

Việt Nam, đặc biệt là mặt hàng hải sản bị nhiễm Salmonella Thiệt hại kinh tế do

vấn đề tiêu huỷ lên đến hàng trăm ngàn USD Điều này không những ảnh hưởng đến nền kinh tế mà còn thực sự là mối lo ngại cho an toàn sức khoẻ cộng đồng

Ở nước ta hướng nghiên cứu về gen độc tố của Salmonella còn ít, các đề tài nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập và định danh các chủng Salmonella

trên các đối tượng là động vật nuôi như lợn, bê nghé (Nguyễn Thị Oanh, 2003; Cù

Hữu Phú, 1999; Trần Xuân Hạnh, 1995) Trong đó, việc xác định Salmonella chủ

yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống mất nhiều thời gian và công sức Hiện chỉ có một số ít công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cổ điển để phát

hiện Salmonella được công bố như đề tài “Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm

bằng phương pháp PCR” của Trần Linh Thước (2005) hay đề tài “Phát hiện

Salmonella spp trong thực phẩm bằng PCR” của Phẩm Minh Thu và cộng sự

(2000) Tuy nhiên sử dụng kỹ thuật này chỉ xác định sự có mặt của vi khuẩn mà không cho kết quả định lượng chính xác số lượng bản sao DNA đích có trong mẫu phân tích

Những năm gần đây phương pháp Realtime PCR một trong những phương pháp cải tiến mới nhất dựa trên nguyên lý PCR đã được ứng dụng chủ yếu vào việc phát hiện các virus gây bệnh trên người và tôm Cụ thể là công ty Nam Khoa đã phát triển các kít Realtime PCR để đưa vào ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có trang bị PCR tại Việt Nam như kít Realtime PCR phát hiện và định

lượng HBV (Hepatitis B virus); kít RT Realtime PCR phát hiện và định lượng HCV (Hepatitis C virus) – RNA và kít RT Realtime PCR định lượng HIV1 (Human immunodeficiency virus1 ) – RNA Bệnh viện Nhi đồng 1 Thành phố Hồ

Chí Minh cũng đã thực hiện thành công kỹ thuật Realtime – PCR để chẩn đoán xác định các tác nhân gây viêm não ở trẻ em hay các công trình nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật này trong việc phát hiện các virus gây bệnh trên tôm như virus gây bệnh đốm trắng (Phạm Thị Mỹ Hạnh, 2005), bộ kít Realtime PCR phát hiện virus gây hoại tử khối u của công ty Nam Khoa Tuy nhiên chưa có một công trình nghiên cứu nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR để phát hiện và định

lượng Salmonella trong các mẫu thực phẩm được công bố

1.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện Salmonella như phương

pháp nuôi cấy truyền thống, quan sát hình thái dưới kính hiển vi, kiểm tra các đặc tính sinh hóa, phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot) và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR,

Trong đó các phương pháp nuôi cấy truyền thống, quan sát hình thái dưới

kính hiển vi, kiểm tra các đặc tính sinh hóa chỉ cho phép phân tích định tính

Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong mẫu, không

cho phép phân biệt được các chủng Salmonella hiện diện trong mẫu, hơn nữa các

phương pháp này có nhiều trở ngại là tốn thời gian phải mất từ 5 – 7 ngày, tốn công sức và có độ nhạy thấp

Sử dụng phương pháp miễn dịch học (dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu

kháng nguyên – kháng thể) giúp phân biệt được các chủng Salmonella, tuy nhiên

phương pháp này gặp phải một nhược điểm là dễ tạo kết quả dương tính giả

Ngoài ra, các phương pháp sinh học phân tử cũng được sử dụng để phát

hiện Salmonella như phương pháp PCR, mutiplex PCR, Realtime PCR, Trong

đó, so với các phương pháp dựa trên PCR cổ điển (PCR, mutiplex PCR, nested PCR) thì phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn như có độ nhạy cao hơn, cho kết quả sớm hơn do không cần phải chạy điện di sau phản ứng

và đặc biệt phương pháp này giúp định lượng chính xác được Salmonella trong

mẫu và rút ngắn thời gian phân tích

 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được tăng lên 94 – 96°C, làm phá vỡ các liên kết

hydrogen để tách hai sợi DNA ra

 Giai đoạn gắn mồi: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống

nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 45 – 60oC, để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn

 Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC, enzyme DNA polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới

b Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR

 Khuôn DNA

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn

100 ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao

 Mồi

Mồi (primer) là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR Để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao thì mồi sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại và phải tuân thủ theo những nguyên tắc về sự bắt cặp giữa các mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính, nồng độ mồi,…

 Nhiệt độ bắt cặp của mồi

Nhiệt độ bắt cặp của mồi thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer

sẽ gắn với DNA khuôn mẫu Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer

có khoảng 20 oligonucleotide:

Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5 o C (1.1) (Ta: nhiệt độ bắt cặp của mồi)

Tuy nhiên, công thức này chỉ có tính tương đối Trên thực tế nhiệt độ bắt cặp của mồi còn phụ thuộc vào các điều kiện, thành phần của phản ứng như: dung dịch đệm,

 Enzyme

Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1 – 2,5 đơn vị (u) cho 100 µl dung dịch phản ứng Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25 µl Nếu nồng độ Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu

và làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn

 Nồng độ các dNTP

Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphate) thường được sử dụng là

20 – 200 µM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ ký sinh’’ Bên cạnh đó,

sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Mất cân bằng trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

 Nồng độ Mg 2+

Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, là cofactor cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ hoạt động kém và hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ

Mg2+ cao làm tăng hiện tượng bắt cặp giả và cho ra những sản phẩm không đặc hiệu Chính vì vậy phải có nồng độ tối ưu cho từng phản ứng Thông thường, Mg2+được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 – 4 mM

 Dung dịch đệm

Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR Nồng độ, pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng

1.3.2 Phương pháp Realtime PCR

a Nguyên tắc

Nguyên tắc của Realtime PCR tương tự PCR truyền thống Tuy nhiên phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay cả khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được thực hiện nhờ vào sự phát tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang hoặc các mồi được đánh dấu huỳnh quang được thêm vào PCR mix Sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phản ứng Realtime PCR sử dụng máy

luân nhiệt được trang bị bộ phận đọc tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại và kết quả được hiển thị nhờ sử dụng một phần mềm đặc trưng trên máy tính

Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao DNA tạo thành

Chất phát huỳnh quang thường được sử dụng trong phản ứng Realtime PCR

là một loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (ví dụ SYBR Green) hoặc là mẫu dò (probe) đánh dấu huỳnh quang (ví dụ Taqman probe)

b Phân tích tổng quát một phản ứng Realtime PCR

Trong Realtime PCR, hiển thị cơ bản để người làm thí nghiệm có thể quan sát được kết quả phản ứng trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu đồ khuếch đại Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt

Đường cong khuếch đại gồm 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase) Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR tăng xấp xỉ gấp đôi sau mỗi chu kỳ Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra, các thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28 – 40, Hình 1.5)

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR

Phân tích một đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) của một ống phản ứng sau khi hoàn tất được các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông

số hết sức quan trọng luôn đi kèm với nó, đó là chu kì ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kì nhiệt mà tại đó thiết bị Realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền Để có thể xác định được cường độ huỳnh quang nền, thiết bị Realtime thường ghi nhận tín hiệu cường độ huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng ở một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền này gọi là đường nền (đường ngưỡng) Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diện khuếch đại Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu mà có những ống phản ứng có Ct sớm và cũng có những ống có Ct xuất hiện muộn hơn Do vậy, dựa vào giá trị Ct chúng ta có thể đánh giá được lượng DNA ban đầu trong ống phản ứng đây là cơ sở cho hướng định lượng của phản ứng Realtime PCR

c Ưu điểm của Realtime PCR

Ưu điểm chính của Realtime PCR so với các phương pháp PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với độ chính xác và độ nhạy cao Kết quả Realtime PCR vừa là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) và định lượng (số lượng bản sao DNA đích ban đầu) Thêm vào đó, kết quả PCR có thể được đánh giá mà không cần điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống kín giúp làm giảm nguy

cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại

d Vấn đề hạn chế đối với Realtime PCR

Ngoài các ưu điểm kể trên thì phương pháp Realtime PCR vẫn còn gặp một

số hạn chế như yêu cầu về thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang và máy tính đi kèm và đòi hỏi kỹ năng về thao tác và sử dụng máy

Tuy nhiên ở những phương pháp trước thì vấn đề hạn chế này cũng tương

tự, chính vì vậy phương phápRealtime PCR là phương pháp tối ưu nhất hiện nay

1.3 Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài

1.4.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đang là mối lo ngại của các quan gia trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam Các vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước ngày càng tăng cao Trong ”Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2006, cả nước đã xảy ra 22 vụ ngộ độc thực phẩm, với 534 người mắc, trong

đó có 14 người tử vong so với năm 2005 là 17 vụ, 174 người mắc, hai người tử vong Số vụ ngộ độc thực phẩm quy mô trên 50 người là 44 vụ với tổng số 265 người mắc

Trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao nhất 31,8%; sau đó là do hoá chất 22,7%; do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên 18,2% và 27,3% là các vụ không xác định được nguyên nhân Trong

số các trường hợp ngộ độc do vi sinh vật thì Salmonella được đánh giá là tác nhân

gây nhiễm độc nguy hiểm nhất Vi khuẩn này gây ra hơn 25% các vụ nhiễm độc, nhiễm khuẩn thực phẩm và 66% trường hợp tử vong

Salmonella có thể lây nhiễm vào cơ thể theo con đường thức ăn hoặc nước

uống Khi đạt đến một số lượng nhất định (105 đến 107 cfu/g) Salmonella trở thành

một mối nguy hại rất lớn đối với sức khỏe của cộng đồng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế của quốc gia

Do vậy việc phân lập, xác định và định lượng gen độc tố của Salmonella

trong mẫu thực phẩm là rất cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, thủy sản và y tế

1.4.2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được tiến hành với các mục tiêu sau:

 Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua

tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa

 Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa

học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm

 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu

Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú) và thịt gà được thu mua từ các cơ sở chế biến

thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang (chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ)

2.1.2 Thiết bị chuyên dụng

 Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

 Máy Real time PCR (IQTM

5 Biorad, Mỹ)

 Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

 Thiết bị điện di (Biorad, Mỹ)

 Kính hiển vi (Motic BA 300, Mỹ)

 Máy so màu (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)

 Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha)

 Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)

2.1.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử

a Hóa chất

 Bộ kít tách chiết DNA Wizard ®

SV Genomic DNA Purification System (Promega)

 Dung dịch đệm TE 1X (Tris 10 mM – EDTA 1mM)

 Proteinase K 20 mg/ml

 Rnase 4 mg/ml

 Wizard SV Lysis Buffer

 Wizard SV Wash Solution

 Nước loại nuclease

 Hóa chất cho PCR

 iTaq buffer 10 X (Biorad)

 MgCl2 50 mM (Biorad)

 dNTPs 10 mM (Biorad)

 iTaq polymerase 5 u/µl (Biorad)

 Cặp mồi invA1,2 do công ty IDT (Integrated DNA Technologies) cung cấp

 Hóa chất cho Realtime PCR

 iQTM SYBR® Green Supermix (Biorad)

 Hóa chất cho điện di

 Thang DNA chuẩn1 kb (Fermentas, Mỹ)

- Cân chính xác 25,5 g BPW cho vào bình thủy tinh 1 lít

- Thêm nước cất cho đủ 1 lít, dùng đũa thủy tinh khuấy đều

- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ

121oC, 1 atm, trong 15 phút

 Môi trường lỏng RV (Rappaport – Vassilisdis): 5,4 g/l, pH = 6,0 ± 0,2 ở nhiệt

- MgCl2.6H2O: 400 g

- Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Dung dịch Malachite green oxalate:

- Malachite green oxalate: 0,4 g

- Nước cất: đủ 100 ml Môi trường hoàn chỉnh:

- Môi trường cơ bản: 1 lít

- Dùng pipet hút 5 ml RV cho vào từng ống nghiệm

- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ

121oC, 1 atm, trong 15 phút

 Môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): 55 g/l, pH = 7,4 ± 0,2

ở nhiệt độ 25 o C

 Thành phần trong 1 lít:

- Cân 11 g XLD cho vào bình tam giác 250 ml

- Thêm nước cất cho đủ 250 ml, dùng đũa thủy tinh khuấy đều

- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem đun trong lò vi sóng đến khi dung dịch đồng nhất và tan hoàn toàn (không khử trùng)

 Môi trường thạch TSA (Trypticase Soy Agar): 40 g/l, pH = 7,3 ± 0,2 ở nhiệt độ

- Thêm nước cất cho đủ 250 ml, dùng đũa thủy tinh khuấy đều

- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ

đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp, khử trùng ở nhiệt độ

121oC, 1atm trong 15 phút Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy

 Môi trường lên men đường (Môi trường cơ bản): pH = 7,0 ± 0,2

2.2 Nội dung nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu của đề tài được sơ đồ hóa trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài

Khảo sát độ nhạy, phân tích nhiệt độ nóng chảy và xây dựng đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR

Khuẩn lạc thuần chủng

Phân lập Salmonella

Cấy ria

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập và nuôi cấy Salmonella

Quy trình phân lập và nuôi cấy Salmonella thực hiện qua 4 bước và sơ đồ

hóa ở Hình 2.2

 Tăng sinh trên môi trường BPW

 Tăng sinh chọn lọc trên môi trường RV

 Phân lập Salmonella trên môi trường rắn XLD

 Khẳng định bằng các test sinh hóa