Quy trình phân lập và nuôi cấy Salmonella thực hiện qua 4 bước và sơ đồ
hóa ở Hình 2.2
Tăng sinh trên môi trường BPW
Tăng sinh chọn lọc trên môi trường RV
Phân lập Salmonella trên môi trường rắn XLD Khẳng định bằng các test sinh hóa
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Hình 2.2. Quy trình phân lập Salmonella
Các bước tiến hành:
Tăng sinh: Cân 25 g mẫu thực phẩm trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 30 giây, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh sau đó chuyển 100 µl dịch này sang 5 ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV trong ống nghiệm đã pha sẵn
Ðồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml môi trường tăng sinh BPW, ủ 37oC trong 18 – 24 giờ
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ 42oC trong 18 – 24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường XLD, ủ 37oC trong 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa:
Khả năng sử dụng đường và phân giải lysin
Kết luận có hay không nhiễm Salmonella
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó ủ trong tủ ấm ở 42oC trong 18 – 24 giờ.
Phân lập: Cấy ria trên đĩa thạch XLD rắn, úp ngược các đĩa peptri và ủ trong tủ ấm 37oC trong 18 – 24 giờ.
Thử nghiệm sinh hóa: Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ. Các thử nghiệm sinh hóa tiến hành là lên men 5 loại đường glucose, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol và khả năng sử dụng lysin.
Xác định khả năng lên men đường của các chủng Salmonella
Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường glucose, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol của vi khuẩn.
Nguyên lý: Sản phẩm của quá trình lên men có thể là các loại acid hữu cơ, các loại rượu hay các loại khí, các sản phẩm này sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị để đánh giá khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn.
Các bước tiến hành:
- Pha môi trường cơ bản và pha các loại carbohydrate 50%: glucose, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol trong nước cất, đem hấp khử trùng 121oC, 1 atm trong 15 phút.
- Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8. - Rót 5 ml môi trường cơ bản vào các ống nghiệm. Thêm 0,5 ml dung dịch từng
loại đường vào từng ống nghiệm tương ứng sao cho môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrate là 5%.
- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường chứa các loại đường.
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37oC, quan sát kết quả mỗi ngày trong 5 ngày.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
- Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh ngọn đèn cồn.
- Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
Xác định khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella
Mục đích: Kiểm tra khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn.
Nguyên lý: Enzyme xúc tác thủy phân lysin sẽ được cảm ứng tổng hợp, xúc tác loại bỏ CO2 khỏi lysin. Khí CO2 giải phóng ra sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị ta có thể đánh giá khả năng sử dụng lysin của vi khuẩn. Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6,8.
Các bước tiến hành:
- Pha môi trường cơ bản chứa lysin rồi rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm.
- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín, đem hấp khử trùng 121oC, 1atm trong 15 phút.
- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường.
- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37oC, quan sát kết quả mỗi ngày trong 5 ngày.
- Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh ngọn đèn cồn.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.