Ct của một ống phản ứng Realtime PCR thấp hay cao là tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng. Đây là một đặc điểm vượt trội của Realtime PCR so với PCR cổ điển, nhờ đặc điểm này mà ta có thể xác định được số bản sao của DNA đích có trong mẫu thử. Tuy nhiên để Realtime PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, phản ứng Realtime PCR cần được thực hiện đồng thời với các mẫu chuẩn. Mẫu chuẩn là các mẫu chứa số lượng bản sao DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng, thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu chứa DNA pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10.
Sau khi tiến hành phản ứng Realtime PCR mẫu thử song song với các mẫu chuẩn đã biết trước số bản sao DNA chúng tôi đã xây đựng được đường chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng (Hình 3.16). Do các mẫu chuẩn được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, nên số lượng bản sao DNA đích trong các mẫu chuẩn được biểu diễn bằng logarit cơ số 10 (log10). Do vậy trị số 3, 4, 5, 6, 7 trên trục X là tương ứng với các
T ỷ l ệ b i ế n t h iê n cư ờ n g đ ộ h u ỳ n h q u a n g so v ớ i tă n g n h iệ t đ ộ ( Δ R F U /Δ T ) Nhiệt độoC DNA S2 Đối chứng âm
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
số lượng bản sao DNA đích là 103, 104, 105, 106 và107 bản sao trong ống phản ứng. Như vậy dựa vào đường chuẩn Hình 3.16 ta xác định được số lượng bản sao DNA đích trong mẫu thử đã làm thử là 103 bản sao.
Hình 3.16. Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR
Ngoài ra có 2 thông số rất quan trọng hiển thị trên đường chuẩn mà người làm thí nghiệm có thể đánh giá được thao tác kỹ thuật của mình trong quá trình làm thí nghiệm. Hệ số tương quan R2 cho phép đánh giá mức độ chính xác của thao tác kỹ thuật có lấy đúng thể tích mong muốn hay không, R2 ≥ 0,99 thì đường biểu diễn chuẩn mới đạt tuyến tính cao. Hiệu quả phản ứng PCR E% đánh giá độ chính xác của thao tác kỹ thuật có pha loãng mẫu chính xác hay không và PCR lý tưởng là 100% nhưng trong thực tế thì hiệu quả PCR chấp nhận được là 90% – 105%. Từ đường chuẩn (Hình 3.16) cho thấy hệ số tương quan R2 = 0,993 > 0,99 và hiệu quả PCR đạt E = 99,6% một lần nữa đánh giá được thao tác kỹ thuật chính xác và kết quả có độ tin cậy.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Đề tài đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn Salmonella từ các mẫu thực phẩm
được thu mua từ các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ (Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ) ở Thành phố Nha Trang.
2. Đã xác định được hình thái của các chủng Salmonella bằng phương pháp
nhuộm Gram và kiểm tra đặc tính sinh hóa (khả năng sử dụng 5 loại đường và lysin) của 8 chủng Salmonella.
3. Đã tối ưu được quy trình của phản ứng PCR phát hiện Salmonella sử dụng cặp mồi invA1,2 với nồng độ mồi tối ưu và tiết kiệm nhất là 0,04 pM và nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi là 58oC.
4. Đã xây dựng được quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella theo đó độ nhạy đạt 101 bản sao/µl (cao hơn gấp 100 lần so với kỹ thuật PCR là 103 bản sao/µl), độ chính xác đạt 96,6%, tổng thời gian phân tích < 24 giờ và hầu như không tạo dimer primer.
5. Đã xây dựng được đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR, từ đó có thể định lượng chính xác số bản DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra được lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm.
Kiến nghị
1. Thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Salmonella sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang.
2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện nhanh các vi khuẩn Salmonella
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Cù Hữu Phú (1999). Phân lập vi khuẩn Salmonella , E.coli ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh hóa của chủng phân lập được và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998). Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, Hà Nội, 300 tr.
3. Nguyễn Thị Cẩm Ly (2010). Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống tại các chợ ở thành phố Nha Trang. Luận văn tốt nghiệp, Viện CNSH & MT, Trường Đại học Nha Trang.
4. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008). Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh. 152 tr.
5. Nguyễn Thị Oanh (2003). Tình hình nhiễm và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ở vật nuôi (lợn, nai, trâu, bò, voi) tại Dak Lak. Luận Án Tiến Sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội.
6. Trần Linh Thước (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. NXB Giáo Dục, Hà Nội, 230 tr.
7. Trần Xuân Hạnh (1995). Phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella trên lợn 2 – 4 tháng tuổi, tạp chí Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Tài liệu Tiếng Anh
8. Aspinall, S.T., Hindle, M.A. and Hutchinson, D.N. (1992). Improved isolation of salmonellae from faeces using a semi – solid Rappaport – Vassiliadis medium. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: 936 – 939.
9. Chui, C.H. and Ou, J.T. (1996). Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay. J. Clin microbiol. 34: 2619 –
2622.
10. Csordas, A.T., Barak, J.D., Delwiche and M.J. (2004). Comparison of primer for the detection Salmonella enterica serovars using real – time PCR. Letters
in Appl. Microbiol. 39: 187-193.
11. Daniele, M., Nucera, W. Maddox, C., Hoien-Dalen, P. and M. Weigel, R. (2006). Comparison of API 20E and invA PCR for Identification of Salmonella
enterica Isolates from Swine Production Units. J. Clin. Microbiol. 44: 3388 –
3390.
12. Doran, J.L., Collinson, S.K., Burian, J., Sarlos, G., Todd, E.C.D., Munro, C.K., Kay, C.M., Banser, P.A., Peterkin, P.I., Kay, W.W. (1993). DNA –based diagnostic test for Salmonella species targeting agfA, the structural gene for
thin aggregative fimbriae. J. Clin. Microbiol. 33: 2263 – 2273.
13. Fey, A., Eichler, S., Flavier, S., Christen, R., Höfle, G.M. and A. Guzmán, C. (2004). Establishment of a real – time PCR – Based Approach for accurate Quantification of Bacterial RNA Targets in Water, Using Salmonella as a
Moldel Organism. Appl. Environ. Microbiol. 70: 3618 – 3623.
14. Funk, J.A., Davies, P.R., Nichols, M.A. (2000). The effect of fecal sample weight on detection of Salmonella enterica in swine faeces. J. Vet. Diagn.
Invest. 12(5): 412 – 418.
15. González-Escalona, N., S. Hammack, T., Russell, M., P. Jacobson, A., J. De Jesús, A., W. Brown, E. and A. Lampel, K. (2009). Detection of Live
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Trascriptase real – time PCR Targeting invA mRNA. Appl. Environ.
Microbiol. 75: 3714 – 3702.
16. Hashimoto, Y., Itho, Y., Fujinaga, Y., Khan, A.., Sultana, F., Miyake, M., Hirose, K., Yamamoto, H. and Ezaki, T. (1995). Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella typhi. J. Clin. Microbiol. 33: 775 – 777.
17. Holt, K.E., Thomson, N.R., Wain, J., Minh. D.P., Nair, S,, Hasan, R., Bhutta, Z.A., Quail, M.A., Norbertczak, H., Walker, D., Dougan, G., Parkhill, J. (2007). Multidrug – resistant Salmonella enterica serovar Paratyphi A harbors
IncHI1 plasmids similar to those found in serovar Typhi. J Bacteriol. 189(11): 4257 – 4264.
18. ISO 6579 : 2002(E) 4
rd
ed. Microbiology - General guidance on methods for the detection of Salmonella. International Organization for Standardization, Geneve, Switzerland.
19. Jean, S.S., Wang, J.Y. and Hsueh, P.R. (2006). Bacteremia caused by
Salmonella enterica serotype Choleraesuis in Taiwan. J. Microbiol. Immunol.
Infect. 39: 358 – 365.
20. Kim, H.J., Park S.H., and Kim, H.Y. (2006). Genomic sequence comparison of
Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 with Salmonella genomic sequences, and genotyping of salmonellae using PCR. Appl. Environ. Microbiol. 72: 6142 – 6151.
21. Lee, S.H., Jung, B.Y., Rayamahji, N., Lee, H.S., Jeon, W.J., Choi, K.S., Kweon, C.H. and Yoo, H.S. (2009). A multiplex real – time PCR for differential detection and quantification of Salmonella spp., Salmonella enterica serovar Typhimurium and Enteritidis in meats. J. Vet. Sci. 10(1): 43 –
51.
22. Loongyai, W., Promphet, K., Kangsukul, N. and Noppha, R. (2010). Detection of Salmonella in Egg Shell and Egg Content from Different Housing Systems for Laying Hens. World Academy of Science, Engineering and Technology 65.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
23. Mahon, J. and Lax, A. (1993). A quantitative polymerase chain reaction method for the detection in avian faeces of Salmonellas carrying the spvR
gene. Epidemiol. Infect. 111: 455 – 464.
24. Malorny, B., Paccassoin, E., Fach, P., Bunge, C., Martin, A. and Helmuth, R. (2004). Diagnostic real – time PCR for Detection of Salmonella in food. Appl.
Environ Microbiol. 70: 7046 – 7052.
25. McClelland, M., E. Sanderson, K., Spieth, J., W.Clifton, S., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S. Ali, J., Dante, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C., Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L., Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R. and K. Wilson, R. (2001). Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature. 413: 852 – 856.
26. Popoff, M. Y. (2001). Antigennic Formulas of the Salmonella Serovar, 8th Ed. Pasteur Institue, Paris, France.
27. Popoff, M.Y., Bockemuhl, J., Brenner, F.W. and Gheesling, L.L. (2004). Supplement 2002 (no. 46) to the Kauffmann – White scheme. Res. Microbiol.
155: 568 – 570.
28. Rahn, K., De Grandis, S.A., Clarke, R.C., McEwen, S.A., Galan, J.E., Ginocchio, C., Curtiss, R., Gyles, C.L. (1992). Amplification of an invA gene
sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probes. 6: 271 – 279. 29. Radji, M., Malik, A. and Widyasmara, A. (2010). Rapid detection of
Salmonella in food and beverage samples by polymerase chain reaction.
Malaysian J. Microbiol. 6: 166 – 170.
30. Reller, M.E., Tauxe, R.V., Kalish, L.A. and Molbak, K. (2007). Excess salmonellosis in women in the United States: 1968 – 2000. Epidemiol. Infect.
136: 1109 – 1117.
31. Ruiz, J.,Nunez, M.L., Diaz, J., Lorente, I., Perez, J. and Gomez, J. (1996). Comparison of five plating media for isolation of Salmonella species from
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
32. The World Health Organization (WHO). A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health Organization, 4th ed, 2003. 33. Yang, Y.G, Song, M.K., Park, S.J. and Kim, S.W. (2007). Direct detection of
Shingella flexneri and Salmonella typhimurium in human faces by real – time
PCR. J. Microbiol. Biotechnol. 17: 1616 – 1621.
34. Woods, F.D., Reen F.J., Gilroy, D., Buckley, J., G.Frye, J. and Boyd, E.F. (2008). Rapid Multiplex PCR and real – time PCR TaqMan PCR Assays for Detection of Salmonella enterica and the Hight Virilent Serovars Choleraesuis and Paratyphi C. J.Clinical Microbiol. 46: 4018 – 4022.
Tài liệu trên internet