a. Điện di gel agarose
Nguyên tắc chung:
Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
(anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di. Qua đó ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ. Trên điện trường các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn.
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử DNA có thể quan sát thấy nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang ethidium bromide. Chất này cho vào sau khi gel đã nấu để nguội đến 45oC, nó có tác dụng gắn kết với DNA bằng cách cài vào xen vào giữa các nucleotide và chúng sẽ được phát sáng khi soi dưới tia UV. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.
Tiến hành:
- Cân 0,48 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X (gel agarose 1,2 %) vào trong bình tam giác 100 ml, đun cách thủy đến lúc gel tan hoàn toàn.
- Sau đó để nguội khoảng 50oC, rồi thêm 2 µl ethidium bromide 10 mg/ml vào gel, lắc đều bình.
- Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40 – 45oC, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. - Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra.
- Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. - Trộn đều 10 µl mẫu DNA tách chiết với 2 µl chất tra mẫu (loading dye 6X), tra
mẫu lần lượt vào từ giếng thứ 2 cho đến giếng thứ 8. Giếng đầu tiên tra thang DNA chuẩn 1 kp.
- Tiến hành chạy điện di với nguồn 120 V, đến lúc DNA chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại.
- Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hình ảnh gel.
b. Xác định nồng độ DNA bằng đo OD
Nguyên tắc chung:
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các base purine và pyrimidine ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
mẫu. Một đơn vị OD260 nm tương ứng nồng độ 50 ng/µl cho một dung dịch DNA sợi đôi. Do đó nồng độ DNA trong mẫu được tính theo công thức sau: CDNA (ng/µl) = OD260 nm * 50 * Hệ số pha loãng (2.1)
Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, giá trị OD ở 280 nm (OD280 nm) được xác định. Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Một dung dịch nucleic acid được xem là có độ tinh sạch cao khi tỷ số: OD260 nm/OD280 nm nằm trong khoảng 1,7 – 2.
Ngoài ra, lượng bản sao DNA trong 1 ng được tính theo công thức sau:
CDNA (bản sao/ng) = (6,022x1023 * 10-9)/(n * 650) (2.2)
Trong đó:
- C: Số bản sao DNA trong 1 ng
- n: Chiều dài bp của chuỗi DNA hoặc RNA
- 650: Trọng lượng phân tử trung bình của 1 nucleotide
Các bước thực hiện
- Pha loãng DNA: hút 5 µl DNA cho vào ống Eppendort 1,5 ml, thêm 45 µl nước loại ion vô trùng, trộn đều. Hút lần lượt 15 µl dung dịch DNA pha loãng 10 lần này cho vào 3 ống eppendort có chứa 1485 µl nước loại ion vô trùng đã chuẩn bị trước, ta thu được 3 ống Eppendort, mỗi ống chứa 1,5 ml dung dịch DNA có nồng độ loãng đi 1000 lần.
- Thực hiện tương tự đối với dịch chiết DNA.
- Đo độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. - Xử lý số liệu theo các công thức 2.1 và 2.2.