a. Khảo sát sự hoạt động của cặp mồi invA1,2 và bộ hóa chất Realtime PCR
Trước hết từ mẫu DNA S2 chúng tôi tiến hành chạy phản ứng Realtime PCR để kiểm tra khả năng hoạt động của cặp mồi invA1,2 và bộ hóa chất Realtime PCR với thành phần phản ứng và chu kì nhiệt như sau:
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
IQ® SYBR Super mix 2X 25
InvA1 0,5 InvA2 0,5 H2O 23 DNA 1 Tổng 50 Chu kì nhiệt:
- Giai đoạn 1: 95oC trong 5 phút.
- Giai đoạn 2: 95oC trong 30 giây, 58oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây. Lặp lại 35 chu kì. Camera ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở bước 58oC.
b. Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Với nồng độ DNA trong mẫu DNA S2 là 6x107 bản sao/µl, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 liên tiếp tới nồng độ 6x101 bản sao/µl và tiến hành 8 phản ứng Realtime PCR cho từng nồng độ với đối chứng âm là ống không bổ sung DNA với thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng như sau: Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích (µl)
IQ® SYBR Super mix 2X 25
InvA1 0,5
InvA2 0,5
H2O 23
DNA 1
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Chu kì nhiệt:
- Giai đoạn 1: 95oC trong 5 phút.
- Giai đoạn 2: 95oC trong 30 giây, 58oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây. Lặp lại 35 chu kì. Camera ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở bước 58oC.
c. Phân tích nhiệt độ nóng chảy chảy của sản phẩm phản ứng Realtime PCR
Ở thử nghiệm này chúng tôi tiến hành 3 phản ứng (2 ống phản ứng từ DNA
S2 và 1 ống phản ứng là đối chứng âm là ống không bổ sung DNA) với thành phần
các phản ứng giống như phản ứng Realtime PCR khảo sát độ nhạy và chu kì nhiệt như sau:
- Giai đoạn 1: 95oC trong 5 phút.
- Giai đoạn 2: 95oC trong 30 giây, 58oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây. Lặp lại 35 chu kì. Camera ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở bước 58oC.
- Giai đoạn 3: Buồng ủ nhiệt sẽ được đưa nhiệt độ lên 95oC trong 1 phút để làm biến tính hoàn toàn các sản phẩm khuếch đại có trong ống phản ứng.
- Giai đoạn 4: Hạ nhiệt độ xuống 55oC trong 1 phút để tất cả các sản phẩm khuếch đại này bắt cặp hoàn toàn thành sợi đôi.
- Giai đoạn cuối: Đưa nhiệt độ buồng ủ từ 55oC lên 95oC trong 80 bước tăng nhiệt độ, mỗi bước tăng 0,5oC và giữ trong 10 giây.
d. Xây dựng đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR
Từ mẫu chuẩn có chứa 107 bản sao/µl chúng tôi tiến hành pha loãng liên tiếp theo hệ số pha loãng bậc 10 đến nồng độ 104 bản sao/µl. Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR các mẫu chuẩn đã biết nồng độ này song song với mẫu thử chứa DNA đích chưa biết số lượng với thành phần và chu kỳ nhiệt như phản ứng Realtime PCR bình thường.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN