a. Nguyên tắc
Nguyên tắc của Realtime PCR tương tự PCR truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được thực hiện nhờ vào sự phát tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang hoặc các mồi được đánh dấu huỳnh quang được thêm vào PCR mix. Sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phản ứng. Realtime PCR sử dụng máy
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
luân nhiệt được trang bị bộ phận đọc tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại và kết quả được hiển thị nhờ sử dụng một phần mềm đặc trưng trên máy tính.
Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao DNA tạo thành.
Chất phát huỳnh quang thường được sử dụng trong phản ứng Realtime PCR là một loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA (ví dụ SYBR Green) hoặc là mẫu dò (probe) đánh dấu huỳnh quang (ví dụ Taqman probe).
b. Phân tích tổng quát một phản ứng Realtime PCR
Trong Realtime PCR, hiển thị cơ bản để người làm thí nghiệm có thể quan sát được kết quả phản ứng trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu đồ khuếch đại. Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.
Đường cong khuếch đại gồm 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase). Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR tăng xấp xỉ gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra, các thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28 – 40, Hình 1.5).
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Phân tích một đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) của một ống phản ứng sau khi hoàn tất được các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng luôn đi kèm với nó, đó là chu kì ngưỡng (Ct, threshold cycle). Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kì nhiệt mà tại đó thiết bị Realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Để có thể xác định được cường độ huỳnh quang nền, thiết bị Realtime thường ghi nhận tín hiệu cường độ huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng ở một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền. Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền này gọi là đường nền (đường ngưỡng). Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diện khuếch đại. Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu mà có những ống phản ứng có Ct sớm và cũng có những ống có Ct xuất hiện muộn hơn. Do vậy, dựa vào giá trị Ct chúng ta có thể đánh giá được lượng DNA ban đầu trong ống phản ứng đây là cơ sở cho hướng định lượng của phản ứng Realtime PCR.
c. Ưu điểm của Realtime PCR
Ưu điểm chính của Realtime PCR so với các phương pháp PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả Realtime PCR vừa là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) và định lượng (số lượng bản sao DNA đích ban đầu). Thêm vào đó, kết quả PCR có thể được đánh giá mà không cần điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.
d. Vấn đề hạn chế đối với Realtime PCR
Ngoài các ưu điểm kể trên thì phương pháp Realtime PCR vẫn còn gặp một số hạn chế như yêu cầu về thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang và máy tính đi kèm và đòi hỏi kỹ năng về thao tác và sử dụng máy.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Tuy nhiên ở những phương pháp trước thì vấn đề hạn chế này cũng tương tự, chính vì vậy phương pháp Realtime PCR là phương pháp tối ưu nhất hiện nay.
1.3. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 1.4.1.Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đang là mối lo ngại của các quan gia trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam. Các vụ ngộ độc thực phẩm trên cả nước ngày càng tăng cao. Trong ”Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2006, cả nước đã xảy ra 22 vụ ngộ độc thực phẩm, với 534 người mắc, trong đó có 14 người tử vong so với năm 2005 là 17 vụ, 174 người mắc, hai người tử vong. Số vụ ngộ độc thực phẩm quy mô trên 50 người là 44 vụ với tổng số 265 người mắc.
Trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao nhất 31,8%; sau đó là do hoá chất 22,7%; do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên 18,2% và 27,3% là các vụ không xác định được nguyên nhân. Trong số các trường hợp ngộ độc do vi sinh vật thì Salmonella được đánh giá là tác nhân gây nhiễm độc nguy hiểm nhất. Vi khuẩn này gây ra hơn 25% các vụ nhiễm độc, nhiễm khuẩn thực phẩm và 66% trường hợp tử vong.
Salmonella có thể lây nhiễm vào cơ thể theo con đường thức ăn hoặc nước uống. Khi đạt đến một số lượng nhất định (105 đến 107 cfu/g) Salmonella trở thành một mối nguy hại rất lớn đối với sức khỏe của cộng đồng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế của quốc gia.
Do vậy việc phân lập, xác định và định lượng gen độc tố của Salmonella
trong mẫu thực phẩm là rất cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, thủy sản và y tế.
1.4.2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài được tiến hành với các mục tiêu sau:
Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua
tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime
PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm.
Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm.
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu2.1.1. Mẫu 2.1.1. Mẫu
Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú) và thịt gà được thu mua từ các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang (chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ).
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng
Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) Máy Real time PCR (IQTM5 Biorad, Mỹ)
Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam) Thiết bị điện di (Biorad, Mỹ) Kính hiển vi (Motic BA 300, Mỹ)
Máy so màu (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)
Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) Tủ sấy (Binder, Đức)
Nồi khử trùng (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)
Máy chụp ảnh Gel (Geldoc, Biorad, Mỹ) Block nhiệt (VWRTM, Mỹ)
Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)
2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử
a. Hóa chất
Bộ kít tách chiết DNA Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega)
Dung dịch đệm TE 1X (Tris 10 mM – EDTA 1mM) Proteinase K 20 mg/ml
Rnase 4 mg/ml
Wizard SV Lysis Buffer Wizard SV Wash Solution
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Nước loại nuclease Hóa chất cho PCR
iTaq buffer 10 X (Biorad) MgCl2 50 mM (Biorad) dNTPs 10 mM (Biorad)
iTaq polymerase 5 u/µl (Biorad)
Cặp mồi invA1,2 do công ty IDT (Integrated DNA Technologies) cung cấp Hóa chất cho Realtime PCR
iQTM SYBR® Green Supermix (Biorad) Hóa chất cho điện di
Thang DNA chuẩn1 kb (Fermentas, Mỹ) Ethidium bromide 10 mg/ml
Đệm TBE 0,5X Đệm tra mẫu 6X
b. Môi trường
Nước pepton đệm BPW (Buffer Pepton Water): 25,5 g/l, pH = 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ 25oC Thành phần trong 1 lít: - Peptone: 10 g - NaCl: 5 g - KH2PO4: 1,5 g - K2HPO4: 9,5 g - Nước cất: đủ 1 lít Cách pha:
- Cân chính xác 25,5 g BPW cho vào bình thủy tinh 1 lít - Thêm nước cất cho đủ 1 lít, dùng đũa thủy tinh khuấy đều
- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm, trong 15 phút
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Môi trường lỏng RV (Rappaport – Vassilisdis): 5,4 g/l, pH = 6,0 ± 0,2 ở nhiệt độ 25oC
Thành phần các chất trong 1 lít gồm: Môi trường cơ bản:
- Tryptone: 5 g - NaCl: 8 g - KH2PO4: 1,6 g - Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Dung dịch MgCl2: - MgCl2.6H2O: 400 g - Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Dung dịch Malachite green oxalate:
- Malachite green oxalate: 0,4 g
- Nước cất: đủ 100 ml
Môi trường hoàn chỉnh:
- Môi trường cơ bản: 1 lít - Dung dịch MgCl2: 100 ml
- Dung dịch Malachite green oxalate: 10 ml Cách pha:
- Cân 2,52 g RV cho vào bình tam giác 250 ml, dùng ống đong đong 50 ml nước cất cho vào, rồi khuấy đều bằng đũa thủy tinh
- Dùng pipet hút 5 ml RV cho vào từng ống nghiệm
- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm, trong 15 phút
Môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): 55 g/l, pH = 7,4 ± 0,2 ở nhiệt độ 25oC
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà - Cao nấm men: 3 g - L – lysin: 5 g - Xylose: 3,75 g - Lactose: 7,5 g - Sucrose: 7,5 g - Sodium deoxycholate: 1 g - Sodium chloride: 5 g - Sodium thiosulfate: 6,8 g - Ferric ammonium citrate: 0,8 mg
- Phenol red: 0,08 g
- Agar: 12,5 g
- Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Cách pha:
- Cân 11 g XLD cho vào bình tam giác 250 ml
- Thêm nước cất cho đủ 250 ml, dùng đũa thủy tinh khuấy đều
- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem đun trong lò vi sóng đến khi dung dịch đồng nhất và tan hoàn toàn (không khử trùng)
Môi trường thạch TSA (Trypticase Soy Agar): 40 g/l, pH = 7,3 ± 0,2 ở nhiệt độ 25oC Thành phần trong 1 lít: - Trypticase peptone: 15 g - Phytone peptone: 5 g - NaCl: 5 g - Agar: 15 g - Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Cách pha:
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
- Thêm nước cất cho đủ 250 ml, dùng đũa thủy tinh khuấy đều
- Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem khử trùng ở nhiệt độ 121oC,
1 atm, trong 15 phút
Môi trường thử decarboxylase (Môi trường cơ bản): pH = 7,0 ± 0,2
Thành phần trong 1 lít: - Peptone: 5 g - NaCl: 10 g - Cao nấm men: 3 g - Glucose: 1 g - Phenol đỏ: 0,02 g - Amino acid: 5 g - Nước cất vô trùng: đủ 1 lít Cách pha:
Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g của một trong các loại amino acid: L – lysin hoặc L – arginin hoặc L – ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1atm trong 15 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy.
Môi trường lên men đường (Môi trường cơ bản): pH = 7,0 ± 0,2
Thành phần trong 1 lít: - Peptone: 10 g - NaCl: 10 g - Cao thịt bò: 3 g - Phenol đỏ: 0,04 g - Cacbohydrat: 5 g - Nước cất vô trùng: đủ 1lít
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Cách pha:
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 5 ml vào các ống nghiệm, khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1atm trong 15 phút.
Pha các loại dung dịch carbohydrate 50% (như: saccharose, lactose, sorbitol, glucose và mannitol) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,5 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.
c. Thuốc thử
Thuốc nhuộm Tím Violet:
- Tím Violet: 1 g - Rượu ethylic: 1 g - Phenol tinh thể: 2 g
- Nước cất vô trùng: đủ 100 ml
Thuốc nhuộm Lugol:
- Iod tinh thể: 1 g
- KI: 2 g
- Nước cất vô trùng: đủ 200 ml
Thuốc nhuộm Fuschin:
- Fuschin kiềm: 1g
- Rượu ethylic 95%: 10 ml - Phenol tinh thể : 5g
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
2.2. Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu của đề tài được sơ đồ hóa trong Hình 2.1
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài
Khảo sát độ nhạy, phân tích nhiệt độ nóng chảy và xây dựng đường chuẩn
của phản ứng Realtime PCR Khảo sát nhiệt độ bắt cặp, nồng
độ mồi, độ nhạy của phản ứng PCR
Khả năng lên men các loại đường
Khả năng sử dụng lysin
Tuyển chọn các chủng Salmonella Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng
phương pháp nhuộm Gram
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa Mẫu Đồng nhất mẫu Ủ Tăng sinh Cấy trang Khuẩn lạc thuần chủng Phân lập Salmonella Cấy ria
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập và nuôi cấy Salmonella
Quy trình phân lập và nuôi cấy Salmonella thực hiện qua 4 bước và sơ đồ
hóa ở Hình 2.2
Tăng sinh trên môi trường BPW
Tăng sinh chọn lọc trên môi trường RV
Phân lập Salmonella trên môi trường rắn XLD Khẳng định bằng các test sinh hóa
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
Hình 2.2. Quy trình phân lập Salmonella
Các bước tiến hành:
Tăng sinh: Cân 25 g mẫu thực phẩm trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 30 giây, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh sau đó chuyển 100 µl dịch này sang 5 ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV trong ống nghiệm đã pha sẵn
Ðồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml môi trường tăng sinh BPW, ủ 37oC trong 18 – 24 giờ
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ 42oC trong 18 – 24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường XLD, ủ 37oC trong 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa:
Khả năng sử dụng đường và phân giải lysin
Kết luận có hay không nhiễm Salmonella
GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà
và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó ủ trong tủ ấm ở 42oC trong 18 – 24 giờ.
Phân lập: Cấy ria trên đĩa thạch XLD rắn, úp ngược các đĩa peptri và ủ trong tủ ấm 37oC trong 18 – 24 giờ.
Thử nghiệm sinh hóa: Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ. Các thử nghiệm sinh hóa tiến hành là lên men 5 loại đường glucose, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol và khả năng sử dụng lysin.
Xác định khả năng lên men đường của các chủng Salmonella
Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường glucose, lactose,