Phát Triển Bộ Kit Phát Hiện Vi Khuẩn Salmonella Hiện Diện Trong Thực Phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÁT TRIỂN BỘ KIT PHÁT HIỆN VI KHUẨN SALMONELLA HIỆN DIỆN TRONG THỰC PHẨM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths TRẦN THỊ XUÂN MAI SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN THỊ HOÀNG YẾN MSSV:3064433 LỚP:CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Trần Thị Hoàng Yến DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp, tơi nhận giúp đỡ q thầy bạn bè:  Cô Trần Thị Xuân Mai, môn Công Nghệ Gen Thực Vật – Viện Nghiên Cứu phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ tận tình quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên truyền đạt kiến thức quí báu cho tơi suốt q trình thực đề tài năm học vừa qua  Cô Võ Thị Thanh Phương – Khoa Sư Phạm – Trường Đại Học Cần Thơ, Cô Nguyễn Thị Liên Cô Nguyễn Thị Pha, môn Công Nghệ Gen Thực Vật – Viện Nghiên Cứu phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ quan tâm, giúp đỡ, bảo tơi suốt q trình thực đề tài  Thầy Trần Nguyên Tuấn - Viện Nghiên Cứu phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ quan tâm, chia sẻ, động viên năm học vừa qua  Tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh Học – khóa 32 chia sẻ, động viên tận tình giúp đỡ suốt năm học đại học TRẦN THỊ HOÀNG YẾN Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 TÓM TẮT Vấn đề ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella spp gây phổ biến giới Do việc sản xuất Kit phát nhanh vi khuẩn Salmonella nhu cầu cần thiết cho công ty, nhà máy sản xuất thực phẩm, thủy, hải sản… nhằm bảo đảm an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng Trong nghiên cứu này, tiến hành thực phương pháp phát triển Kit cho làm tối ưu hiệu sử dụng Kit Sử dụng phương pháp trích nhanh trích DNA Salmonella xử lí nhiệt 20 phút để tiết kiệm thời gian hóa chất trích, khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính hai loại hỗn hợp thành phần phản ứng PCR (Mix): Mix có thêm Taq DNA polymerase Mix không thêm Taq DNA polymerase, kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ Kit tự sản xuất Từ khóa: Salmonella, PCR, Salmonella PCR Kit i MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC .ii DANH SÁCH BẢNG .vi DANH SÁCH HÌNH .vii TỪ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG 1- GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I Giới thiệu Salmonella .3 Đặc điểm chung Salmonella 1.1 Hình thái 1.2 Tính chất sinh hóa .4 Phân loại Salmonella 2.1.Kháng nguyên O .4 2.2.Kháng nguyên H .5 2.3.Kháng nguyên Vi .5 II – Con đường xâm nhiễm Salmonella triệu chứng nhiễm bệnh .6 III – Các phương pháp kiểm nghiệm Salmonella .8 Phương pháp cấy máu .8 Phương pháp chuẩn đoán huyết xét nghiệm Widal .9 Phương pháp giám định tính chất sinh hóa .9 3.1 Làm phong phú vi khuẩn mẫu thử .9 ii 3.2 Giám định tính chất sinh hóa .9 Phương pháp kiểm nghiệm Western blot .11 Phương pháp thực thử nghiệm ELISA 11 Phương pháp PCR 11 6.1 Tiến hành phản ứng .11 6.2 Sắc ký gel agarose .13 6.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 13 6.4 Kỹ thuật PCR đa thành phần .14 IV - Gen mục tiêu để xác định Salmonella 14 V – Bộ Kit PCR dùng chẩn đoán vi khuẩn Salmonella 15 Mục đích sử dụng .15 Nguyên tắc phương pháp PCR 15 Thành phần cần thiết Kit PCR Salmonella 16 Cách bảo quản Kit .16 Các thiết bị nguyên vật liệu cần thiết không cung cấp Kit 16 Những điều cần ý sử dụng PCR Salmonella Kit 17 Qui trình thực phản ứng PCR .18 VI – Một số Kit phổ biến dùng chẩn đốn Salmonella .19 Loopamp® Salmonella Detection Kit .19 Foodproof® Salmonella Detection Kit .19 Takara's Salmonella One Step PCR Screening Kit Ver 2.0 20 Bộ Kit xét nghiệm Salmonella typhi huyết người để chẩn đoán bệnh thương hàn .21 CHƯƠNG - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 I – Địa điểm thời gian 22 II – Phương tiện thí nghiệm .22 Thiết bị 22 iii Hóa chất 23 Nguyên vật liệu 23 III – Phương pháp nghiên cứu 24 Chuẩn bị mẫu 24 Ly trích DNA .24 2.1 Qui trình trích DNA Phenol – Chloroform 24 2.2 Qui trình trích nhanh DNA 20 phút xử lý nhiệt 25 Thiết kế đoạn mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella 26 Kỹ thuật PCR 27 Kỹ thuật PCR đa thành phần 28 Điện di .28 IV – Bố trí thí nghiệm .29 Thí nghiệm 1: So sánh hiệu phát Salmonella phương pháp trích DNA: trích DNA Chloroform trích nhanh DNA 29 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính hai loại Mix PCR: Mix có thêm Taq DNA polymerase Mix không thêm Taq DNA polymerase 30 Thí nghiệm 3: Kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ Kit tự sản xuất 30 CHƯƠNG – KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .31 Thí nghiệm 1: So sánh hiệu phát Salmonella phương pháp DNA: trích DNA Chloroform trích nhanh DNA 31 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính hai loại Mix PCR: Mix có thêm Taq DNA polymerase Mix không thêm Taq DNA polymerase 32 a Mix có thêm Taq DNA polymerase (Mix+Taq) .32 b Mix không pha Taq (Mix-Taq) 35 Thí nghiệm 3: Kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ Kit tự sản xuất 40 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 I – KẾT LUẬN .41 iv II – KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .42 PHỤ LỤC … Phụ lục 1: Thành phần môi trường nuôi vi khuẩn Salmonella Thành phần môi trường Buffered Petone Water ( BPW) Môi trường Rappaport – Vassiliadis R10 Broth ( 1L) ( RV) Môi trường Tetrathionate Broth (1L), (TT) Phụ lục 2: Các hình ảnh số thiết bị chủ yếu phụ vụ cho đề tài v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Nồng độ (%) Agarose ………… 13 Bảng 2: Thành phần Kit PCR ………….16 Bảng 3: Thành phần Kit Foodproof® Salmonella ………… 20 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi InvA ………… 27 Bảng 5: Thành phần cho phản ứng PCR đa thành phần ………… 28 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Salmonella paratyphi ………… Hình 2: Salmonella typhimurium ………… Hình 3: Salmonella enterica ………… Hình 4: Con đường xâm nhiễm Salmonella ………… Hình 5: Sự xâm nhiễm vào biểu mô ruột Salmonella ………… Hình 6: Mơ hình phản ứng PCR ………… 12 Hình 7: Sơ đồ qui trình thực phản ứng PCR Kit chẩn đoán Salmonella ………… 18 Hình 8: Salmonella PCR Kit ………… 19 Hình 9: Bộ Kit xét nghiệm Salmonella typhi huyết người để chẩn đoán bệnh thương hàn ………… 21 Hình 10: Marker dùng chạy điện di ………… 23 Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR ………… 27 Hình 12: Sản phẩm PCR cho mẫu trích phương pháp trích Chloroform .31 Hình 13: Sản phẩm PCR cho mẫu trích phương pháp trích nhanh xử lí nhiệt 20 phút 32 Hình 14: PCR với mix + Taq sử dụng sau pha xong mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) 33 Hình 15 - PCR với mix + Taq giữ tuần mẫu mua vài chợ địa bàn thành phố Cần Thơ .34 Hình 16 - PCR với mix + Taq giữ tuần mẫu mua vài chợ địa bàn thành phố Cần Thơ .35 Hình 17- PCR với mix - Taq sử dụng sau pha xong mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) 36 Hình 18 – PCR với mix - Taq giữ tuần mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) 37 Hình 19 – PCR với mix - Taq giữ tuần mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) 38 vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 10 11 12 600bp Hình 13 – Sản phẩm PCR cho mẫu trích phương pháp trích nhanh xử lí nhiệt 20 phút Giếng 1: Thang chuẩn 100bp; 2: DNA Bò1 BPW; 3: DNA bò2 BPW; 4: DNA Heo BPW; 5: DNA Bò1 TT; 6: DNA Bò2 TT; 7: DNA Heo TT; 8: DNA Bò RV; 9: DNA Bò2 RV; 10: DNA Heo RV; 11: Salmonella enteritidis; giếng 12: Nước Phân tích kết sản phẩm PCR qua hình gel cho thấy phương pháp trích nhanh hay trích Chloroform xuất băng 600bp gen InvA Điều chứng minh phương pháp trích nhanh DNA vi khuẩn Salmonella áp dụng Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính hai loại Mix PCR: Mix có thêm Taq DNA polymerase Mix không thêm Taq DNA polymerase a Mix có thêm Taq DNA polymerase (Mix+Taq) Thành phần mix bao gồm thành phần liệt kê bảng – trang 27 Mix sau pha trữ tủ lạnh - 60C Tiến hành thí nghiệm cách kiểm tra khả hoạt động mix qua mốc thời gian sau:  Sử dụng sau pha mix xong: Để theo dõi ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính mix PCR, sản phẩm mix sau pha trộn xong kiểm tra hoạt tính ngay, mix có hoạt tính tốt trữ lại nhiệt độ 4-60C kiểm tra hoạt tính sau tuần, tuần tháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Mix + Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 14 – PCR với mix + Taq sử dụng sau pha xong mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) Giếng: 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Bò RV15; 3: Bò RV25; 4: Bò RV305: Bò RV40; 6: Bò RV15; 7: Bò RV25; 8: Bò RV30 9: Bò RV40; 10: Đối chứng âm (Nước) Sau pha mix xong tiến hành kiểm tra hoạt tính mix + Taq mẫu DNA dương tính với Salmonella ly trích trước Kết cho thấy mix có hoạt tính tốt việc kiểm tra DNA vi khuẩn Salmonella Do vậy, mix trữ lại tủ lạnh – 0C tiến hành cho thí nghiệm kiểm tra độ hoạt động mix + Taq theo mức thời gian tuần, tuần, tháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sau tuần : Mix + Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 15 - PCR với mix + Taq giữ tuần mẫu mua vài chợ địa bàn thành phố Cần Thơ Giếng : 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Heo RV (Cái Khế); 3: Heo RV(An Nghiệp); 4: Bò RV( Cái Khế); 5: Trứng( An Lạc); 6: Heo RV(Cái Khế); 7: Heo RV (An Nghiệp); 8: Bò RV (Cái Khế); 9: Trứng RV (An Lạc); 10: Đối chứng âm (H2O) Sau tuần tiến hành kiểm tra độ hoạt động mix + Taq mẫu DNA dương tính với Salmonella ly trích trước Kết từ hình 15 cho thấy giếng xuất băng 600bp, điều chứng tỏ mix + Taq sau tuần hoạt động, nhiên so với mix đối chứng độ hoạt mix + Taq bị giảm sút rõ rệt, băng mờ giếng 6, 7, băng xuất rõ ràng Ở giếng băng không xuất mẫu trứng không chứa vi khuẩn Salmonella Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sau tuần : Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ bền mix + Taq sau tuần, thao tác thí nghiệm tương tự thu kết sau: Mix + Taq Mix đối chứng Hình 16 - PCR với mix + Taq giữ tuần mẫu mua vài chợ địa bàn thành phố Cần Thơ Giếng : 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Heo RV (Cái Khế); 3: Heo RV(An Nghiệp); 4: Bò RV( Cái Khế); 5: Trứng( An Lạc); 6: Heo RV(Cái Khế); 7: Heo RV (An Nghiệp); 8: Bò RV (Cái Khế); 9: Trứng RV (An Lạc); 10: Đối chứng âm (Nước) Kết phân tích hình gel cho thấy, sau tuần mix có pha Taq gần khơng hoạt động, băng xuất mờ so với mix đối chứng Điều chứng tỏ thời gian tồn trữ ảnh hưởng đến độ bền mix + Taq b Mix không pha Taq (Mix-Taq) Thành phần mix PCR không pha Taq giống với chất miêu tả bảng – trang 27 không cho Taq chung với mix Mix trữ tủ lạnh 4-60C Sau tiến hành thí nghiệm cách kiểm tra khả hoạt động mix qua mốc thời gian sau: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sử dụng sau pha mix xong: Mix – Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 17- PCR với mix - Taq sử dụng sau pha xong mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) Giếng: 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Bò RV15; 3: Bò RV25; 4: Bò RV305: Bò RV40; 6: Bò RV15; 7: Bò RV25; 8: Bò RV30 ; 9: Bò RV40; 10: Đối chứng âm (Nước) Sau pha mix xong tiến hành kiểm tra hoạt tính mix - Taq mẫu DNA dương tính với Salmonella ly trích trước Kết cho thấy mix có hoạt tính tốt việc kiểm tra DNA vi khuẩn Salmonella Do vậy, mix trữ lại tủ lạnh – 0C tiến hành cho thí nghiệm kiểm tra độ hoạt động mix - Taq theo mức thời gian tuần, tuần, tháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sau tuần: Sau tuần ta tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ bền mix cách: hút lượng mix - Taq cần thiết tube 1.5ml thêm lượng Taq tương ứng vào mix, đồng thời pha mix đối chứng để kiểm tra hiệu mix Sau tiến hành PCR thu kết sau: Mix - Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 18 – PCR với mix - Taq giữ tuần mẫu bò mua chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) Giếng: 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Bò RV15; 3: Bò RV25; 4: Bò RV305: Bò RV40; 6: Bò RV15; 7: Bò RV25; 8: Bò RV30 9: Bò RV40; 10: Đối chứng âm (Nước) Dựa vào kết phân tích hình gel cho thấy so với mix đối chứng sau tuần mix - Taq hoạt động bình thường, cho kết rõ rệt mix đối chứng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sau tuần: Mix - Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 19 – PCR với mix - Taq giữ tuần mẫu bò mua chợ Xuân Khánh (24.12.09) Giếng: 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Bò RV15; 3: Bò RV25; 4: Bò RV30; 5: Bò RV40; 6: Bò RV15; 7: Bò RV25; 8: Bò RV30; 9: Bò RV40 ; 10: Đối chứng âm (Nước) Dựa vào hình gel cho thấy sau tuần mix - Taq hoạt động bình thường, thời gian tồn trữ mix kéo dài tuần Tiếp tục tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ bền mix - Taq sau tháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT  Sau tháng: Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ bền mix - Taq sau tháng, thao tác thí nghiệm tương tự thu kết sau: Mix -Taq Mix đối chứng 600bp Hình 20 – PCR với mix không Taq giữ tháng mẫu bò mua chợ Xuân Khánh (24.12.09) Giếng: 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Bò RV15; 3: Bò RV25; 4: Bò RV30 5: Bò RV40; 6: Bò RV15; 7: Bò RV25; 8: Bò RV30; 9: Đối chứng âm (Nước) Dựa vào kết phân tích hình gel cho thấy sau tháng mix - Taq hoạt động bình thường, so với mix đối chứng kết cho băng rõ ràng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Thí nghiệm 3: Kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ Kit tự sản xuất Sau hồn tất thí nghiệm cần thiết để phát triển Kit, ta tiến hành thử nghiệm số mẫu thực phẩm tươi thành phố Cần Thơ với phương pháp thiết kế sản xuất Kit nhằm kiểm tra lại hiệu Kit như: ni mẫu 24h, trích DNA phương pháp trích nhanh PCR mẫu với mix - Taq (mix - Taq giữ tháng) Cuối thu kết sau: Mix - Taq Mix đối chứng 10 600bp Hình 21 – PCR với mix - Taq giữ tháng mẫu mua vài chợ địa bàn thành phố Cần Thơ Giếng : 1: Thang chuẩn 100bp; 2: Heo RV (Cái Khế); 3: Heo RV(An Nghiệp); 4: Bò RV( Cái Khế); 5: Trứng( An Lạc); 6: Heo RV(Cái Khế); 7: Heo RV (An Nghiệp); 8: Bò RV (Cái Khế); 9: Trứng RV (An Lạc); 10: Đối chứng âm (Nước) Kết phân tích hình gel tương tự thí nghiệm thêm vào mix hoạt động sau tháng Qua khẳng định hiệu phương pháp thí nghiệm để phục vụ cho việc sản xuất Kit thêm hoàn thiện tối ưu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I – KẾT LUẬN o Sử dụng phương pháp trích nhanh xử lí nhiệt 20 phút phát Salmonella mà tiết kiệm thời gian hóa chất o Sử dụng Mix PCR + Taq cho hiệu không tốt việc kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella o Sử dụng mix PCR với Taq riêng bảo quản lâu hơn, cho hiệu tốt o Kết hợp phương pháp để tiến hành thử nghiệm mẫu thực phẩm tươi đưa vào sản xuất Kit II – KIẾN NGHỊ o Ứng dụng phương pháp phục vụ cho việc hoàn thiện Kit phát nhanh vi khuẩn Salmonella để đưa vào tiêu thụ thị trường o Tìm cách tối ưu hóa điều kiện khác sản xuất Kit như: cô đặc môi trường nuôi BPW với thể tích nhỏ để thuận tiện việc vận chuyển… o Thử nghiệm Kit mẫu thực phẩm đông lạnh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 41 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban 2006 Công nghệ gen Nhà xuất Khoa hoc Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Duy Thanh 1992 Bệnh truyền nhiễm Xí nghiệp in Tỉnh Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng 2001 Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng 2002 Cơng nghệ gen Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lang 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nông Nghiệp TP HCM Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tấn 2002 Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất y học Tài liệu tiếng anh Angelotti, R 1963 Microbiological quality of food Academic Press, New York Ann – Christine, S., A Anna, J Sara, H Anja and H Per 2005 Salmonella Detetion By Polymerase Chain Reaction After Pre – enrichment of Feed Samples Department of Animal Feed, Department of Bacteriology National Veterinary Institude SE – 751 89 Uppsala Sweden Dawin, K.H., V L Miller 1999 Molecular basis of the interation of Salmonella with the intestinal mucosa Clin Microbial Rev 12: 405 – 428 Gabriela, J.P., K Demnerová 2000 Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay Internatl Microbial 3: 225 – 229 Kaufman 1930 Zentrabl Bakteriol Parsitenkd Infektionskr Hyg Abt I Orig 113:148 Koch, A.L., C L Woldringh 1995 The inertness of the poles of a Gram – negative rod J Theor Biol 171: 415 – 425 Luciana, R.S., N P Vladimir, O D Silvia, F L Maristela, P P Alexandre, R R Aldemir, S P Carlos, L F Rui 2001 Polymerase Chain Reaction (PCR) for the detection of Salmonella in Artificially inoculated chicken meat Rev Inst Med trop S Paulo 43 (5): 247 – 250 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Mazurkiewicz, P., J Thomas, J A Thompson, M Liu, L Arbibe, P Sansonetti, D W Holden 2008 SpvC is a Salmonella effector with phosphothreonine lyase activity on host mitogen – activated protein kinase Mol Microbiol 67: 1371 1383 Mueller 1923 C R Soc Biol (Paris) 89: 434 Rappaport, F., N Konforti, and B Navon 1956 A new enrichment medium for certain Salmonella J Clin Pathol 9: 261 - 266 Shu, J.W., T K Yen, H J Jeng, B.Y Dong 2005 Evaluation of the Takara PCR Kit for Detection of Salmonella in Foods and Feed Samples Chia – Nan Annual Bulletin Vol 33, PP 28-37 Vassiliadis, P., D Trichopoulos, A Kalandidi, E Xirouchaki 1978 Isolation of Salmonellas from sewage with a new procedure of enrichment J Appl Bact 44: 233 – 239 Wilson, M.A., R B Rimler, L J Hoffman 1992 Comparision of DNA fingerprints and somatic serotypes of serogroup B and E Pasteurella multocida isolates J Clin Microbiol 30: 1518 – 1524 Trang web http://www.cdc.gov/Salmonella/typhimurium/update.html (13/12/2009) http://www.med.nagoya-cu.ac.jp/NMJ/43-1-1full.html http://vi.wikipedia.org (13/12/2009) (20/12/2009) http://www.liferiver.com.cnenuploadfile20080903144353268.pdf (20/12/2009) http://www.liferiver.alibaba.com (20/12/2009) http://ci.vbi.vt.edu/pathinfo/pathogens/enterica_2.html#typhi http://www.Salmonella.org/info.html#reptiles http://www.genedb.org/genedb/styphi/ (20/12/2009) (29/12/2009) (29/12/2009) http://www.nature.com/ng/journal/v40/n8/full/ng.195.html http://iai.asm.org/cgi/content/abstract/74/3/1555/ (29/12/2009) (14/1/2010) http://www.fistenet.gov.vn/detailS.asp?Object=71263927&News_ID=2212 64297 (14/1/2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_typhi/ (20/1/2010) http://www.pasteurhcm.org.vn/ng_cuu/nuoc_thucpham/phathien_samonella_ban g_PCR.htm (20/1/2010) http://www.nature.com/nature/journal/v413/n6858/full/413852a0.html (20/1/2010) http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=258111 (19/2/2010) www biology.kenyon.edu (20/2/2010) http:/www.vietbao.vn/Khoa-hoc/Xet-nghiem-benh-thuong-han-Chi-mat-2gio/20566131/189/ (20/5/2010) http://www.salmonellablog.com/ (20/5/2010) http://www.ncbi.nlm.nih.gov (20/5/2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường nuôi vi khuẩn Salmonella Thành phần môi trường Buffer Petone Water ( BPW) Peptone 10.0g Disodium Phosphate 1.5g Sodium Chloride 5g Mono potassium phosphate 1.5g Distilled water 1L pH 7.2 Khử trùng môi trường 1210C 15 phút Môi trường Rappaport – Vassiliadis R10 Broth ( 1L) ( RV) MgCl2.6H2O 28.6g NaCl 7.2g Papaic digest of Soybean milk 4.54g KH2PO4 1.45g Malachite Green oxalate 0.036g pH 5.5  0.2 Autoclave 1160C 15 phút Môi trường Tetrathionate Broth (1L), (TT) (pH 7.5-8.5) Na2SO3 38g CaCO3 25g Casein/ meat peptone (50/50) 18g D – Mannitol 2.5g Yeast Extract 2.9g Glucose 0.5g Sodium deoxycholate 0.5g Brillant Green 0.01g Iodine Solution (6g KI + 5g Iodine) 40ml Phụ lục 2: Các hình ảnh số thiết bị chủ yếu phụ vụ cho đề tài Hình 22 - Máy ủ lắc (GFL 1083) Hình 24 - Bồn điện di (Run One) Hình 23 - Máy PCR (Biorad PTC 200) Hình 25 - Máy chụp hình gel Biorad UV 2000 ... TẮT Vấn đề ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella spp gây phổ biến giới Do vi? ??c sản xuất Kit phát nhanh vi khuẩn Salmonella nhu cầu cần thiết cho công ty, nhà máy sản xuất thực phẩm, thủy, hải sản…... có chứa DNA vi khuẩn Salmonella thực phẩm - Chạy điện di, chụp hình gel kiểm tra sản phẩm PCR Thí nghiệm 3: Kiểm tra diện vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ Kit tự sản... * Mục đích: Đánh giá độ nhạy phát diện vi khuẩn Salmonella Kit số mẫu thực phẩm tươi sống * Tiến hành thí nghiệm : - Ly trích DNA vi khuẩn Salmonella mẫu thực phẩm địa bàn thành phố Cần Thơ