Flavonoids là polyphenols

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU TỚI HẠN

MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình ảnh .v Đặt vấn đề .1 Chương 1 - TỔNG QUAN .3 1.1. Đại cương về phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn .3 1.1.1. Định nghĩa .3 1.1.2. Dụng cụ .5 1.1.3. Nguyên tắc hoạt động 6 1.1.4. Ưu nhược điểm 7 1.1.5. Ứng dụng .7 1.2. Tổng quan về hành tây 8 1.2.1. Thực vật học 8 1.2.2. Thành phần hoá học 10 1.2.2.1. Sulphur hữu cơ 10 1.2.2.2. Saponin 11 1.2.2.3. Flavonoid .12 1.2.2.4. Các thành phần khác 13 1.2.3. Tác dụng và công dụng .14 1.2.3.1. Hành tây trong y học cổ truyền .14 1.2.3.2. Tác dụng dược lý của hành tây theo y học hiện đại .15 1.2.3.3. Công dụng và cách dùng 16 1.2.3.4. Một số chế phẩm hiện đại từ Hành tây .17 1.3. Tổng quan về quercetin .18 1.3.1. Khái quát .18 1.3.2. Tác dụng trên một số bệnh 19 i 1.3.3. Tính an toàn .20 1.3.4. Liêu dùng .20 Chương 2 - PHẦN THỰC NGHIỆM .21 2.1. Chiết xuất quercetin bằng carbon dioxide siêu tới hạn 21 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn 21 2.1.2. Trang thiết bị .21 2.1.3. Quá trình chiết xuất .23 2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu .23 2.1.5. Kết quả và bàn luận .24 2.2. Chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn .28 2.2.1. Nguyên liệu và thiết bị 28 2.2.2. Quá trình chiết xuất .29 2.2.3. Quy trình phân tích bằng HPLC 30 2.2.4. Tối ưu hoá các thông số chiết xuất 31 2.2.4.1. Tác động của nhiệt độ .31 2.2.4.2. Tác động của thời gian chiết xuất 32 2.2.4.3. Tỷ lệ mẫu và DE 33 2.2.5. Kết quả và bàn luận .34 2.2.5.1. Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn .34 2.2.5.2. So sánh SWE với các phương pháp chiết khác .36 2.3. Kiểm nghiệm nguyên liệu hành tây .37 Chương 3 - KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 38 3.1. Kết luận .38 3.2. Nhận định 38 Tài liệu tham khảo .39 Phụ lục PL ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MeOH Methanol EtOH Ethanol CO 2 Carbon dioxide HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction) Pc Áp suất tới hạn Tc Nhiệt độ tới hạn DE Tảo cát trái đất (diatomaceous earth) SWE Chiết bằng nước siêu tới hạn (subcritical water extraction) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp chiết siêu tới hạn .4 Bảng 1.2. So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn .4 iii Bảng 1.3. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L 11 Bảng 1.4. Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg) 13 Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ 24 Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE .34 Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE và nguyên liệu vỏ củ hành ban đầu .35 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất .3 Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn .5 iv Hình 1.3. Hệ thống máy chiết lỏng siêu tới hạn .6 Hình 1.4. Thân, củ và hoa Hành tây .9 Hình 1.5. Chế phẩm Maderma .17 Hình 1.6. Chế phẩm Allium capa 6C .17 Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon dioxide siêu tới hạn 22 Hình 2.2. Biểu đồ tương quan giữa lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol .25 Hình 2.3. Biểu đồ tương quan giữa thể tích ethanol trong mỗi ống và thời gian .26 Hình 2.4. Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ chiết xuất và thời gian 26 Hình 2.5. Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn .28 Hình 2.6. Sắc ký đồ của quercetin từ dịch chiết vỏ củ hành tây 30 Hình 2.7. Ảnh hưởng nhiệt độ lên phương pháp chiết quercetin bằng SWE cho các lần chiết với thời gian 10 phút và 15 phút .31 Hình 2.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất quercetin bằng SWE ở nhiệt độ 165 o C và 170 o C .32 Hình 2.9. Ảnh hưởng tỷ lệ vỏ củ hành và DE trong chiết xuất quercetin bằng SWE 33 Hình 2.10. So sánh các phương pháp chiết 36 v ĐẶT VẤN ĐỀ --------- Flavonoids là polyphenols có rất nhiều trong trái cây, rau củ, và ngũ cốc. Flavonoids được chia thành nhiều nhóm nhỏ, chúng bao gồm các anthocyanidins, chủ yếu tạo các màu đỏ và xanh trong trái cây, nước trái cây, rượu vang và các loài hoa; các catechin, có nhiều trong lá trà; các flavonones và flavanone glycosides, tìm thấy trong cam quýt và mật ong; và các flavon, flavonols và flavonol glycosides, có nhiều trong lá trà, trái cây, rau củ, mật ong. Flavonoids được biết đến với khả năng chống oxy hóa, tạo phức với các ion kim loại hoá trị 2, có lợi cho sức khỏe con người. Các hợp chất này có tác dụng chống lại dị ứng, viêm nhiễm, virus, cao huyết áp, viêm khớp, và được báo cáo ngăn ngừa đột biến, ung thư và AIDS [15]. Quercetin được nghiên cứu bởi Caltagirone rằng quercetin và apigenin ức chế sự tăng trưởng, việc xâm lấn và tiềm năng di căn của khối u ác tính [4]. Quercetin có tiềm năng để trở thành một liệu pháp hóa trị ung thư tuyến tiền liệt như báo cáo của Xing (2001) [25]. Flavonols này cũng được xem là có chức năng chống oxy hóa [19]. Có hai nhóm chất chống oxy hóa chính: tổng hợp và tự nhiên. Một trong các xu hướng quan trọng nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm hiện nay là nhu cầu tìm về và sử dụng các chất chống oxy hoá tự nhiên. Chúng an toàn hơn, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn các chất chống oxy hoá tổng hợp. Củ hành chứa rất nhiều quercetin glucosides (quercetin-3,4'-diglucoside và quercetin- 4'-monoglucoside). Lớp vỏ ngoài cùng của củ hành chuyển sang màu nâu và khô trong quá trình già đi, và các glycosides của quercetin chuyển dạng thành quercetin tự do. Herrmann (1976) cũng cho rằng trong củ hành khô chứa chủ yếu là dạng quercetin tự do hơn là dạng glycoside. Theo Bilyk er al. (1984) thì lớp vỏ khô phía ngoài có nhiều quercetin hơn lớp bên trong ở tất cả tám giống hành được nghiên cứu. Giống cao nhất chứa tới 34,15g quercetin/ kg vỏ hành khô. Các giống khác chứa từ 1,14 – 16,53g quercetin/kg [11]. 1 Chiết xuất flavonols từ mô hành trong các nghiên cứu ở trên được thực hiện bằng cách chiết với dung môi methanol. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải methanol, độc tính của methanol còn lẫn trong sản phẩm,…. Do đó, phương pháp chiết quercetin một cách nhanh chóng, rẽ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện, tự động hóa và thân thiện với môi trường. Hy vọng bài báo cáo này sẽ cung cấp thêm một số thông tin về chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn, góp phần hiện đại hoá các phương pháp chiết xuất các hợp chất thiên nhiên trong tương lai. 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU TỚI HẠN [2],[9], [16],[21],[26]: Được biết đến cách đây rất lâu từ năm 1879, nhưng đến những năm 1980, phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ nghệ để chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị và nhất là hoa bia. 1.1.1. Định nghĩa: Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn. Ở trạng thái siêu tới hạn, hợp chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn là phương pháp chiết sử dụng dạng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn. Trạng thái rắn Trạng thái lỏng Điểm ba Điểm ba Điểm tới hạn Chất lỏng siêu tới hạn T 0 C Pc Nhiệt độ Áp suất Khí Hình 1.1. Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất 3 Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng và khí giao nhau. Các đường cong là nơi hai trạng thái cùng hiện diện. Quan sát dọc theo đường cong khí - lỏng hướng lên cao gặp 1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau. Điểm này được gọi là điểm siêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn. Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ có các giá trị được gọi lần lượt là áp suất tới hạn (Pc) và nhiệt độ tới hạn (Tc). Hai giá trị này là đặc trưng cho từng chất. Bảng 1.1. Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp chiết siêu tới hạn Dung môi Nhiệt độ tới hạn Áp suất tới hạn Nước 374 218 EtOH 241 61 MeOH 240 80 Aceton 235 46 NH 3 132 115 Propan 97 42 Clorodifloromethan 96 50 Propen 92 45 Ethan 32 48 CO 2 31 73 Xenon 17 59 Ethylen 09 50 Methan -83 45 Bảng 1.2. So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn Trạng thái Khí (0 0 C, 1atm) Siêu tới hạn Lỏng Tỷ trọng (g/cm 3 ) 10 -3 0,2-0,5 0,6-2 Hệ số khuếch tán (cm 2 /s) 10 -1 10 -3 -10 -4 10 -5 Độ nhớt (g/cm/s) 10 -4 10 -4 10 -2 4 Trong số đó dung môi CO 2 là thông dụng nhất vì - Áp suất và nhiệt độ tới hạn thấp - Giá tiền rẻ - Bền về hóa học - Không độc, không dễ cháy - Độ nhớt thấp - Khả năng khuếch tán cao - An toàn, độ tinh khiết cao - Dễ loại ra khỏi dịch chiết bằng cách giảm áp suất - Có thể pha thêm MeOH, EtOH để chiết những chất phân cực. 1.1.2. Dụng cụ: Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Hệ thống gồm một nguồn cung cấp CO 2 , một máy bơm, một bộ làm lạnh, một bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách thu sản phẩm và bình ngưng tụ. Bình chứa CO 2 Bình tách Bình chiết Làm lạnh Bơm Làm nóng Điều chỉnh P, t 0 C Bình ngưng tụ (CO 2 lỏng) 5 [...]... Nghiên cứu thêm là cần thiết để xác nhận các kết quả này 1.3.3 Tính an toàn: Dị ứng Tránh sử dụng ở những người bị dị ứng hoặc quá mẫn cảm với quercetin do ăn hoặc tiếp xúc với da Có thể gây kích ứng đường hô hấp, mắt, da, đường tiêu hóa Phản ứng phụ Là một thành phần phổ biến trong thực phẩm, quercetin nói chung là an toàn và dung nạp tốt ở chế độ ăn uống bình thường Tuy nhiên nó được xem là có liên hệ... ra, hành tây còn có các loại sapogenin khác là diosgenin và cepagenin 12 Sitosterol Oleanolic acid 1.2.2.3 Flavonoid: Flavonoid chủ yếu trong hành tây là dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin diglucoside, quercetin monoglucoside và quercetin tự do Hành tây còn chứa kaempferol nhưng hàm lượng rất ít Quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là flavonoid chính chiếm 80% các chất có chứa... có chứa chứa chất chống oxy hóa là những hợp chất bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do giúp chống lại một số bệnh thoái hóa [29] 1.2.3.3 Công dụng và cách dùng: [30] Hành tây là loại rau được sử dụng phổ biến ở châu Âu trong bữa ăn hàng ngày Ở nước ta, Hành tây cũng thường được sử dụng để xào với các loại thịt, dùng chế dầu giấm và để ăn sống rất được ưa chuộng Để làm thuốc, Hành tây được chỉ dẫn... dây thần kinh răng, mụn cóc, vết thương, loét và trừ muỗi Cách dùng: Thông thường nhất là ăn sống, cũng có thể ngâm trong nước nóng (trị cảm cúm) hoặc đun sôi 10-15 phút (trị ỉa chảy, thấp khớp) hoặc ngâm độ một tuần trong rượu trắng (trị vật ký sinh đường ruột) Người ta còn làm thuốc (ngâm Hành tây trong cồn 90 độ), làm rượu thuốc 20% Dùng ngoài dưới dạng thuốc đắp trị thấp khớp, đau đầu, sung huyết... 1.3.1 Khái quát: Quercetin là một flavonol chủ yếu trong hơn 4.000 flavonoids (chất chống oxy hóa) được tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật chẳng hạn như rượu vang đỏ, hành, trà xanh, táo, quả mọng, và rau Brassica (bắp cải, bông cải xanh, súp lơ, củ cải) Quercetin và Rutin (một flavonol khác) được sử dụng ở nhiều nước trong các bệnh tim mạch (bảo vệ mạch máu) và là thành phần của nhiều chế... thảo dược Quercetin chủ yếu ở dạng glycosides, có nghĩa là chúng được kết nối với đường khác nhau Tuy nhiên, khả năng cơ thể hấp thụ các hợp chất này chưa rõ ràng Quercetin và flavonols khác có nhiều tác dụng sinh học, nhưng các bằng chứng khoa học cho việc sử dụng quercetin trong phòng ngừa hoặc điều trị bệnh là không chắc chắn Quercetin đã được coi là một liệu pháp cho bệnh tim mạch, cholesterol cao,... được tìm thấy trong hành tây là: sitosterol, oleanolic acid và một ít amyrin [13] Các chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 1982 Trong đó sitosterol có cấu trúc thuộc nhóm steroid còn oleanolic acid và amyrin có cấu trúc triterpenoid Gần đây năm 2004, các nhà khoa học đã làn đầu tiên phân lập được 4 saponin trong hành tây đều có cấu trúc ruscogenin là: [14] (25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabino...6 1.1.3 Nguyên tắc hoạt động: - Nạp dược liệu vào bình chiết, khóa nắp lại - Mở dòng CO2 lỏng đi qua bộ phận làm lạnh rồi qua bơm nén Sau đó qua bộ tăng nhiệt Khi đạt nhiệt độ và áp suất, CO2 trở thành dòng siêu tới hạn - Dòng này vào bình chiết Hoạt chất theo dòng CO2 qua bộ phận làm lạnh Tại đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách - Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành... 1.2.3.4 Một số chế phẩm hiện đại từ Hành tây: Kem xoá sẹo Mederma [32] Kem xoá sẹo Mederma của Merzco, Đức được chiết xuất từ Allium cepa, là loại thuốc kích thích tế bào da tái tạo lại hoàn chỉnh, tạo cho da mịn và có sức sống Cách sử dụng: vết thương sau khi đã lành thoa mỗi ngày 3-4 lần tùy vào vết sẹo mới cũ và quá trình sản sinh tế bào da nhanh chậm của từng người Hình 1.5 Chế phẩm Maderma Viên... đưa trở lại bình chứa Quá trình chiết lại tiếp tục Một số lưu ý: - Trong vài trường hợp đặc biệt, mẫu cần chiết có thể được điều chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm thấm ướt Nếu hợp chất có tính phân cực, một lượng nhỏ nước được thêm vào để làm thấm ướt mẫu cần chiết giúp việc chiết thêm dễ dàng Nếu hợp chất chiết có tính không phân cực, một lượng dầu nhỏ hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết Hình 1.3 . chiết................................................................36 v ĐẶT VẤN ĐỀ --------- Flavonoids là polyphenols có rất nhiều trong trái cây, rau củ, và ngũ cốc. Flavonoids được chia thành nhiều nhóm. gọi là điểm siêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn. Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ có các giá trị được gọi lần lượt là áp