XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS FROM LEAVES, RIND FRUITS OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP EX BENTH BY HIGH- PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ĐÀO HÙNG CƯỜNG Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng ĐẶNG QUANG VINH HV Cao học khố 2004-2007 TĨM TẮT Axit hữu lá, vỏ bứa khô xác định phương pháp sắc ký lỏng cao áp Lá tươi vỏ bứa khô chiết với nước nhiệt độ 127 0C thời gian 30-60 phút áp suất 0,15 MPa Đồng thời, vỏ bứa khô chiết dung môi (axeton metanol) chiết soxhlet nhiệt độ 75 0C thời gian Mẫu bơm vào máy sắc kí lỏng cao áp với axit photphoric 0,01 M metanol với tốc độ dòng 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm Axit hữu chủ yếu lá, vỏ bứa khơ tìm thấy axit (-) hyđroxy xitric hàm lượng 2,863 15,221 % Phần axit lại lá, vỏ bứa lượng nhỏ axit xitric Đây kết xác định thành phần axit hữu từ bứa (Garcinia oblongifolia Champ ex Benth.) ABSTRACT Organic acids in fresh leaves and dried rinds fruits of Garcinia oblongifolia Champ ex Benth were determined by high-performance liquid chromatography Fresh leaves and dried rinds fruits were extracted with water at 127 °C for 30-60 under 0,15 MPa pressure Also, dried rinds were extracted with solvents (acetone and methanol) using a Soxhlet extractor at 75 °C for h each The samples were injected to HPLC under gradient elution with 0.01 M phosphoric acid and methanol with a flow rate of 0.7 mL/min using UV detection at 210 nm The major organic acid was found to be (-)-hydroxycitric acid present in leaves and rinds fruits to the extent of 2.863 and 15.221%, respectively Citric acids is present in leaves and rinds fruits in minor quantities This is the first report on the composition of organic acids from Garcinia oblongifolia Champ ex Benth Mở đầu Trong vài năm gần đây, cấu tử có khối lượng nhỏ phức tạp chiết từ nhiều loài bứa (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia antroViridis) có axit (-)-hyđroxy xitric (HCA; 1,2-di hydroxy propan-1,2,3 tri cacboxylic axit; hình 1), lacton (-) axit hydroxy citric (hình 1)) có tính sinh học lý thú gây ý nhà hoá sinh bác sỹ chuyên khoa sức khoẻ Đó khả điều chỉnh q trình tổng hợp axit béo, hình thành lipit, ngon miệng, giảm cân Đồng phân (-)-HCA góp phần lớn lĩnh vực dược học tác nhân có vai trị quan trọng mục đích giảm cân, bảo vệ tim mạch, hiệu chỉnh trạng thái bất bình thường lipid, khả chịu đựng luyện tập thể thao [3] [4] [5] [6] Vỏ bứa có tính săn da đắng, mát, độc, có tác dụng tiêu viêm, hạ nhiệt, làm săn da, hàn vết thương; trị: Loét dày, loét tá tràng; Viêm dày ruột, tiêu hoá; Viêm miệng, bệnh cặn răng; Ho máu Dùng trị bỏng, mụn nhọt, sâu quảng, eczema, dị ứng mẩn ngứa, rút vết đạn đâm vào thịt; Lá bứa có vị chua thường dùng thái nhỏ nấu canh chua; Hạt có áo hạt chua, ăn được, dùng nấu canh chua Nhựa bứa dùng trị bỏng 1 Các nghiên cứu chiết tách nguồn HCA thực lồi bứa Ấn Độ Vì vậy, khám phá axit hữu bứa Việt Nam cần thiết, bứa có tên khoa học Garcinia oblongifolia Champ ex Benth., thuộc họ Bứa (họ măng cụt) - Clusiaceae Bài báo trình bày phương pháp chiết tách, xác định thành phần axit hữu có lá, vỏ bứa thông số vật lý khác Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Lá, vỏ bứa (Garcinia oblongifolia Champ ex Benth.) xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng từ thành phố Hồ Chí Minh Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ bứa chuẩn bị theo sơ đồ phần 2.2.1 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Lá bứa: loại bỏ già, sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm thực chiết tách axit theo sơ đồ sau Quả bứa: loại bỏ hư, dập, chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm sấy khô nhiệt độ 800C, xoay nhỏ làm nguyên liệu để chiết tách axit theo 02 phương pháp sơ đồ sau Lá: Vỏ khô: Phương pháp 1: Phương pháp 2: 2.2.2 Phương pháp chiết tách 10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước 10 g mẫu + 150 mL nước 25 g mẫu+axeton etanol (150 mL) Chưng ninh nồi áp suất: Lá, vỏ bứa tươi khô cắt nhỏ cho vào cốc thuỷ tinh 500 ml,lặcphlạưi ng ninh nồi áp suất áplặspulạấi t 0,15 MPa, nhiệt độ 127 oC Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút 01 lần Nồi áp suất 0,15 MPa, 60 phút 01 lần Chiết Soxhlet 75 0C thời gian 30-60 phút lặp lại 02 lần để chiết tách hết lượng axit hữu có mẫu với dung môi nước Lọc vải muslin Vỏ bứa Lọc vải muslin vào chiết soxhLlọectbằtnigếgniấyhlàọcnvhà ccôhđiặếct Chiết soxhlet: khô xoay nhỏ cho nhiệt độ 75 oC, vòng với dung môi axeton methanol Trộn lẫn dịch 02 lần chiết 2+ 42g.t3ha.nPhương pháTprộntrlọẫnndgịchlư02ợlnầngchiết + 4g than hoạt tính: ngâm nước ấm 30' hoạt tính: ngâm nước ấm 30' Cân khoảng 10g lá, vỏ Bứa tươi cho vào cốc thuỷ tinh đtanđolưvợà caxestoấnychkiêht hơịavtần tbroinếgt khối lượng xác Cho cốc thuỷ tinh có chứa lá, vỏ Bứa vào tủ s2ấ0ymLvnàướscấ+y4ởg t8ha0nohCoạ.t tính Lọc giấySlọacu, thkahn ihosạất tyínhkhoảng giờ,Ltọac blấằnyg gciốấyclọrca, thcahn ohoạvt àtínoh bình hút ẩm cốc thuỷ tinh đượnc rgửua ộ02i lầhnẳvnớit1h5ìmtLiếnnướhc vàành cân tính đkưhợcốriửalư02ợlnầngvtớriê1n5 mcLânnướpchvàân tích Sau đó, khoảng 30 phút ta lọc lại nước rửa lọc lại nước rửa Ngâm nước ấm 30 phút lọc lại tiến hành trình lần khối lượng hai lầbằnngcgâiấny llọicê, nthatniếhopạtltàínhkđhượơcnrgửa đổi hay có sai số khoảng 0.005g dừng q trình sấy 02 lần với 10 mL nước Trộn lẫn dịch lọDc ựvàarửva,àc đcặát đcếnkết thu đTưrộợnclẫ,ntdaịchtílnọchvàđrưửaợ, ccôkđặhtốđếinlượng lá, vỏ Bứa trước sau 20mL, xử lý với 100mL etanol để 15 50mL, xử lý với 100mL etanol để 15 spấhyú.t đTể ừkếtđtủóa,htếat ptcntinh độ ẩm dựaphvútàđoể kcếtơtnủaghếtthpứecctins.au: Dịch chiết góp chung thành 50 mL (chuẩn độ, chạy HPLC, IR) Ly tâm 10 phút, tách phần dịch Ly tâm 10 phút, tách phần dịch kết tủa riêngT Prhoầnnkgếtđtủóa:rửHa 0:2độ ẩm (%); vmà k0ế:tktủha ốriêinlgư Pợhnầngkếlát tủhaorửặac02vỏ tươi trước sấy (g); m1: khối lần với 20mL etanol ly tâm để thu lần với 20mL etanol ly tâm để thu lượnghồlái hếhtoaxặict vỏ sau sấy (g) hồi hết axit 2.2.4 Phương pháp chuẩn độ [2] Trộn dịchXnổái,ccôđđịặnchđếhn àthmể lượng axit tổng số lá, vỏ bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88 Trộn dịch nổi, cô đặc đến thể tích 50 mL lNưuhgỏiữ ởN4aCOđHến k0h,i1N từ burettíxchu5ố0nmgL, vcàhlưou gđiếữnở 4k0Chiđếdnịkchhi thử có màu hồng nhạt bền vững.0 sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR) axit toànsửpdụhnầgn(chthuẩenođộp, chhầạynHtPrLăCm, IR()X 1) tính cơng thức: Tính kết quả: Độ đó: n: số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd: thể tích mẫu đặc; P: trọng lượng mẫu thử, tính gam; K: hệ số loại axit, K = 0,006904 2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học quang phổ (IR) Các phân tử dao động không ngừng Tần số dao động phân tử phụ thuộc vào số lực liên kết khối lượng chúng, nhóm chức khác có tần số hấp thụ khác nằm vùng từ 5000 – 200 cm-1 Mỗi nhóm nguyên tử (nhóm chức) xác định có tần số xác định khơng đổi hợp chất có chứa nhóm ngun tử Vì vậy, phân tích quang phổ hồng ngoại ta xác định nhóm ngun tử mà chất đem phân tích có 2.2.6 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [3] [4] Chất chuẩn (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50-mL chứa 5.0 mL nước, xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+] Hỗn hợp khuấy thời gian 10 phút sử dụng khấy từ Tách lấy phần dung dịch, nhựa rửa với nước có pH trung tính Nước rửa dung dịch dược trộn lẫn làm thành 25 mL, khuấy trộn, lọc sử dụng giấy lọc Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320 ppm Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xitric cho HPLC: Dung dịch chuẩn axit xitric chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ đến 30 ppm sử dụng nước cất lần cất HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng Knauer, lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5m Bộ tổng hợp dung mơi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer Q trình dò thực đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190- 740 nm Pha động gồm (A) metanol MeOH (B) axit photphoric 0,01 M với tốc độ dịng 1,5 ml/m Q trình tách pic tốt chất A B thay đổi từ 10-30% thời gian 0- 25 phút, 90% A B thời gian 30 phút, sau phút cân với 90% A Chất chuẩn mẫu lọc qua Millipore lọc 0,45 m tiêm vào HPLC Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn thực cách dựa vào kết phân tích chuỗi mẫu HCA chuẩn Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10-320 ppm HCA tự tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải thực phần thảo luận trên, kết thu diện tích pic Đường cong HCA vẽ dựa biểu diễn phụ thuộc nồng độ HCA diện tích pic (trung bình 03 lần chạy) Tương tự, đường chuẩn axit xitric tiêm vào HPLC, thực cách thảo luận trên, kết thu diện tích pic Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn xác định dựa vào nồng độ thực HCA có mẫu Khoảng nồng độ tính từ giá trị giới hạn (LLOQ) đến giá trị giới hạn (ULOQ) Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) định nghĩa nồng độ thấp HCA mà xác định với độ tin cậy xác