Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcusaureus phân lập từ đất rừng ngập mặn Thái Bình và Nam Định

Bên cạnh đó, khả năng kháng kháng sinh của tụ cầu vàng rất lớn vì vậy cần nghiên cứu các sinh học diệt khuẩn có nguồn gốc từ các vi sinh vật đối kháng đã và đang được các nhà khoa học hư

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Trang 2

Mục lục

Mục lục i

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

Mở đầu 1

Phần1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Xạ khuẩn 3

1.1.1 Xạ khuẩn và sự phân bố trong tự nhiên 3

1.1.2 Cấu tạo của xạ khuẩn 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái, quá trình sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn 5

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 6

1.1.5 Sự hình thành bào tử 6

1.2 Phân loại xạ khuẩn 8

1.2.1 Lịch sử phân loại xạ khuẩn 8

1.2.2 Theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 10

1.2.3 Theo đặc điểm hóa học 11

1.2.4 Theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa 12

1.2.5 Theo phân loại số 12

1.2.6 Theo sự phát sinh chủng loại 13

1.2.7 Phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) 14

1.3 Một số sản phẩm trao đổi chất quan trọng của xạ khuẩn 14

1.3.1 Kháng sinh và cơ chế hình thành chất kháng sinh của vi sinh vật 14

1.3.2 Phân lập xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ tự nhiên 15

1.3.3 Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn 16

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn 18

1.4 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus 19

1.4.1 Đặc điểm phân loại 19

1.4.2 Đặc điểm sinh vật học 20

1.4.2.1 Hình thái và tính chất nuôi cấy 20

1.4.2.2 Đặc tính và yếu tố độc lực 21

1.4.2.3 Khả năng đề kháng 23

1.4.2.4 Sự kháng kháng sinh 23

1.4.2.5 Khả năng gây bệnh 23

Phần 2 : Vật liệu và phương pháp 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Môi trường ( g/l ) 24

Trang 3

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 27

2.2.1.1 Phân lập xạ khuẩn 27

2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn Staphilococcus aureus : 27

2.2.1.2 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 28

2.2.1.3 Tuyển chọn xạ khuẩn 28

2.2.1.4 Bảo quản chủng giống 29

2.2.2 Phân loại xạ khuẩn 29

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái 29

2.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 29

2.2.2.3 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 31

2.2.3 Nghiên cứu động thái của quá trình lên men 33

2.2.4 Tách chiết chất kháng sinh 33

2.2.4.1 Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối 33

2.2.4.2 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc 33

2.2.5 Xác định một số tính chất hoá lý và phân loại kháng sinh 33

2.2.5.1 Xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô 33

2.2.5.2 Xác định pH khuyếch tán của kháng sinh thô 33

2.2.5.3 Phương pháp xác định giá trị Rf 34

Phần 3 Kết quả và thảo luận 36

3.1 Phân lập và tuyển chọn 36

3.1.1 Phân lập xạ khuẩn từ đất rừng ngập mặn 36

3.1.2 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 37

3.1.2 Sàng lọc hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập 40

3.2 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp truyền thống 45

3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn TB10.2 45

3.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá 46

3.2.2.1 Khả năng chịu muôí 46

3.2.2.2 Khả năng đồng hóa nguån đường 46

3.2.3 Mô tả đặc điểm phân loại 47

3.3 Phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử 49

3.4 Nghiên cứu động thái lên men của chủng TB10.2 52

3.5 Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 54

3.5.1 Tách chiết chất kháng sinh 54

3.5.2 Độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô 54

3.5.3 Ảnh hưởng của pH đến độ khuyếch tán của dịch kháng sinh thô 55

3.5.4 Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn chủng S padanus TB10.2 trong một số hệ dung môi 56

Kết luận 58

Tài liệu tham khảo 59

Trang 4

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính là người thầy

đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn phòng tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tác giả

Trang 5

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn

là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Trang 6

Trang 7

Danh mục bảng

Bảng 3.1 Phân loại xạ khuẩn TB theo màu sắc KTKS 36

Bảng 3.2 Phân loại xạ khuẩn NĐ theo màu sắc KTKS 36

Bảng 3.3.Kết quả phân lập vi khuẩn S aureus tại các phòng mổ và phòng thủ thuật 37

Bảng 3.4 Phân loại xạ khuẩn phân lập ở Thái Bình theo nhóm màu và hoạt tính kháng sinh 40

Bảng 3.5 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Tỉnh Thái Bình kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Thái Bình trong môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41

Bảng 3.7 Phân loại xạ khuẩn phân lập tại rừng ngập mặn Tỉnh Nam Định theo nhóm màu và hoạt tính kháng sinh 42

Bảng 3.8 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 43

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 44

Bảng 3.10 Đặc điểm hình thái của chủng TB10.2 45

Bảng 3.11 một số đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn TB110.2 45

Bảng 3.12 Khả năng đồng hóa các nguồn đường 46

Bảng 3.13 So sánh đặc điểm hình thái của chủng TB10.2 với chủng S padanus 48

Bảng 3.14 so sánh trình tự 16S rRNA của chủng TB10.2 trên ngân hàng gen quốc tế 51

Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn S padanus TB10.2 trên các môi trường nghiên cứu 53

Bảng 3.16 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối của chủng S padanus TB10.2 trên môi trường Gauze-1 53

Trang 8

Bảng 3.17 Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng S Padanus TB10.2 sau khi xử lý nhiệt với vi sinh vật kiểm định S aureus (mm) 55

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của pH tới sự khuyếch tán của chất kháng sinh Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.19 Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi 57

Trang 9

Danh mục hình

Hình 1.1 Hình thể Staphylococcus aureus 20

Hình 1.2 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 22

Hình 2.1 Đĩa thạch Gradient pH 34

Hình 2.2 Băng sắc kí trên giấy 35

Hình 3.1 phân lập vi khuẩn S.aureus tại bệnh viện ĐK tỉnh Bắc Ninh 37

Hình 3.2a kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus của bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh 38

Hình 3.2b Kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus do phòng Di truyềnVi sinh vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp 39

Hình 3.3 hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Tỉnh Thái Bình diệt vi khuẩn S aureus 41

Hình 3.4 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đất ngập mặn tỉnh Thái Bình 42

Hình 3.5 hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Nam Định diệt vi khuẩn S aureus 43

Hình 3.6 Hoạt tính kháng sinh của dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn tại đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định 44

Hình 3.7 Hình dạng và bề mặt bào tử chủng TB10.2 45

Hình 3.8 Khả năng đồng hoá các nguồn đường của chủng TB10.2 47

Hình 3.9 Màu của KTKS (A) và màu của KTCC (B) của chủng TB10.2 trên môi trường Gause 1 sau 7 ngày nuôi 48

Hình 3.10 Điện di DNA của chủng TB10.2 sau khi tách từ kit QIAamp DNA Mini Kit 50

Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR gen 16S rRNA của chủng TB10.2 50

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại của chủng TB10.2 52

Hình 3.13 Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus TB10.2 trên môi trường Gauze-1 54

Trang 10

Mở đầu

Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường xuất hiện ở các bệnh viện, chúng gây

ra các mối đe dọa lớn cho bệnh nhân cũng như bệnh viện nếu không có công tác kiểm soát nhiễm khuẩn thực sự tốt Chúng gây nhiễm trùng vết mổ làm ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân Bên cạnh đó, khả năng kháng kháng sinh của tụ cầu vàng rất lớn vì vậy cần nghiên cứu các sinh học diệt khuẩn có nguồn gốc từ các vi sinh vật đối kháng đã và đang được các nhà khoa học hướng đến và xạ khuẩn sinh kháng sinh là trung tâm trong vấn đề nghiên cứu này

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau Chúng ngày càng được biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm thứ cấp có giá trị cao như chất kháng sinh, chất chống ung thư, các chất kích thích sinh trưởng và nhiều hợp chất y dược khác Ngoài ra, xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào nên được sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học trong nông nghiệp và công nghệ xử lý rác thải

Thái Bình và Nam Định là hai tỉnh có diện tích đất rừng ngập mặn lớn của Bắc bộ Việc nghiên cứu đa dạng sinh học vi sinh vật của đất rừng ngập mặn chưa được công bố nhiều, đặc biệt là các sản phẩm trao đổi chất của chúng Vì vậy, để góp phần tìm hiểu về đa dạng sinh học xạ khuẩn ở đất rừng ngập mặn và hoạt tính chất kháng sinh của chúng đối với vi khuẩn tụ cầu

vàng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh

kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t t r

*/ Mục tiêu của đề tài:

- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu thập tại một số khu vực đất rừng ngập mặn thuộc 2 tỉnh Thái Bình và Nam Định

Trang 11

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng xạ khuẩn phân lập, từ đó

Staphylococcus aureus

*/ Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nhiệm vụ sau:

Bắc Ninh

- Thu thập mẫu đất từ các vùng đất ngập mặn thuộc tỉnh Thái Bình và Nam Định

- Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất,

- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với vi sinh vật kiểm định để tuyển chọn ra chủng có hoạt tính cao

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loại

một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus đã được tuyển

chọn

- Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chất kháng sinh từ chủng đã phân lập

Trang 12

Phần1 Tổng quan tài liệu

1.1 Xạ khuẩn

1.1.1 Xạ khuẩn và sự phân bố trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là nhóm vi sinh vật đơn bào, cơ thể tạo

thành hệ sợi, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn Chúng phân

bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao, hồ, trong bùn,… Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong tự nhiên, chúng tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa các hợp chất trong đất, trong nước Nói chung, trong 1 gam đất thường có trên 1 triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch) [2] Một vài loài xạ khuẩn kị khí và vi hiếu khí có thể là nguồn

gây bệnh cho động vật, thực vật Một số xạ khuẩn thuộc chi Frankia có khả

năng cố định nitơ và tạo các nốt sần trên các cây không thuộc bộ Đậu [2] Xạ khuẩn có thể tổng hợp được nhiều hợp chất quan trọng như các loại enzyme (proteinaza, amylaza, xenlulaza, glucoizomeraza,…), một số vitamin, axít hữu

cơ, và một đặc điểm rất quan trọng là khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (khoảng 60- 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này) [14]

Trong tự nhiên, hai chi quan trọng nhất, có thành phần loài phong phú

và phạm vi phân bố rất rộng là Streptomyces và Nocardia [6].

1.1.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu tạo hệ sợi như nấm mốc, nhưng kích thước của chúng chỉ tương đương với kích thước của vi khuẩn [8], chưa có nhân thực Màng tế bào xạ khuẩn gồm thành tế bào và màng nguyên sinh chất

Thành tế bào xạ khuẩn được cấu tạo chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dày

khoảng 60-120Å, khi già có thể dày tới 150Å Thành tế bào cấu tạo từ các lớp

glucopeptit gồm các gốc axetylglucozamin liên kết với axit axetylmuzamic bằng các liên kết 1,4-glucozit, thành tế bào bị phá hủy khi xử

N-lý bằng lizozim do các liên kết trên bị phá vỡ, màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần (Protoplast) Cấu trúc sợi của

Trang 13

thành tế bào bị mất đi khi xử lý bằng hỗn hợp ete, clorofooc và các dung môi hòa tan lipit [6] Điều này chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào cấu tạo từ các lipit

Dưới lớp thành tế bào là màng tế bào có nguồn gốc từ hệ thống màng sinh chất Màng tế bào của xạ khuẩn có cấu tạo từ photpholipit và protein, dày khoảng 30 nm, được cấu tạo theo mô hình khảm láng Hai lớp photpholipit sắp xếp theo nguyên tắc đầu ưa nước quay ra ngoài và vào trong tế bào, đuôi

kị nước quay lại với nhau Protein xen vào lớp photpholipit, có hai loại protein của màng tế bào đó là protein rìa màng và protein xuyên màng Protein màng có các chức năng như vận chuyển, dẫn truyền, thô cảm [8] Khi tạo thành các vách ngăn, lớp protein ngoài của màng nguyên sinh gắn với thành tế bào và không tham gia tạo thành vách ngăn Các lớp còn lại tạo thành vách ngăn Màng nguyên sinh chất có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào (điều hòa sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của tế bào) và tham gia vào quá trình hình thành bào tử

Phía trong màng nguyên sinh chất là mezoxom đây là phần màng tế bào gấp nếp vào trong tế bào Các thể này có dạng hình phiến hay hình ống Vai trò của thể mezoxom là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất, và

do đó sẽ làm tăng hoạt tính enzyme, tăng vận chuyển điện tử,…

Tế bào chất của xạ khuẩn giống tế bào chất của vi khuẩn [8] Tế bào chất là khối keo bán lỏng, chứa khoảng 80-90% là nước Thành phần chủ yếu của nó là phức chất, lipoprotein Thể keo của tế bào chất có tính dị thể (các hạt keo có bản chất và kích thước khác nhau phân tán trong tế bào chất) Trạng thái thể keo phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và tuổi của tế bào sống Nhiệm vụ cơ bản của tế bào chất là chứa các cơ quan bên trong tế bào, là nơi tổng hợp nhiều hợp chất của tế bào, tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào

Các thể vùi trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphotphat (có dạng hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm SoudanIII), các màu polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol), không bào, hạt voluntil Tuy nhiên, tế bào chất của xạ khuẩn không có ty thể [8]

Trang 14

1.1.3 Đặc điểm hình thái, quá trình sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn

Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Tùy thuộc vào từng loài và hoàn cảnh, khuẩn lạc có kích thước khác nhau Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, dạng nhung tơ, dạng màng dẻo hay dạng vôi Ở môi trường lỏng, xạ khuẩn tạo thành hình bông, khi già sẽ tạo thành kết tủa lắng xuống [8]

Về cấu trúc, khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp Lớp ngoài có các sợi bện chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong, lớp trong cùng có dạng khá xốp Mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau Các sản phẩm trao đổi chất (chất kháng sinh, enzyme, vitamine,…) được tích lũy ở mỗi lớp cũng khác nhau Màu sắc khuẩn lạc (màu khuẩn ty khí sinh) của các loài xạ khuẩn cũng rất đa dạng Loài có khuẩn lạc màu đỏ, loài có khuẩn lạc màu da cam, lam, nâu, tím,… [6] Tuy nhiên, màu sắc khuẩn lạc phụ thuộc vào từng loài xạ khuẩn và điều kiện ngoại cảnh Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn có thể tiết ra môi trường các chất

có sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, vàng, nâu, đen Có loại sắc tố tan được trong nước, có loại tan được trong dung môi hữu cơ

Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong

và ngoài mặt môi trường thạch tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất ăn sâu vào môi trường để sử dụng nước và các chất dinh dưỡng để tồn tại và phát triển Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí, phần cuối các khuẩn ty này phát triển thành sợi bào tử Ở nhiều loài xạ khuẩn, khuẩn ty khí sinh phát triển tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm

Thành phần hóa học của khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh cũng không giống nhau Khuẩn ty cơ chÊt không chứa lipit, còn khuẩn ty khí sinh lại chứa lipit [8] Do đó, khuẩn ty khí sinh sẽ bắt màu khi bị nhuộm Trong khuẩn ty khí sinh, lượng axit nucleic nhiều hơn trong khuẩn ty cơ chất Đồng thời lượng enzyme trong khuẩn ty khí sinh cũng nhiều hơn, và hoạt tính của các enzyme này cũng mạnh hơn [8]

Trang 15

Khuẩn ty của xạ khuẩn có dạng hệ sợi như nấm mốc nhưng mảnh hơn, phân nhánh và không có vách ngăn [8]

Xạ khuẩn phát triển theo phương pháp mọc chồi phân nhánh, tế bào phân chia theo kiểu amitoz (phân bào kh«ng t¬) Lúc đầu, bề mặt sợi xuất hiện các mấu lồi, mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển thành sợi Từ sợi này, nhánh mới được hình thành Nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty Một đoạn khuẩn ty (mầm xạ khuẩn) hay một bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1-2 giờ sẽ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, các gen cần thiết sẽ được nhân lên, protein được tổng hợp và cứ như vậy, khuẩn ty được hình thành và phát triển [6]

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng Các loại đường, tinh bột, rượu, axít hữu cơ, lipit, axit amin, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng cho chúng Nguồn nitơ vô cơ th-êng là các muối nitrat, muối amôn,… nguồn nitơ hữu cơ là pepton, protein, cao ngô, cao nấm men,… Khả năng đồng hóa mỗi chất ở mỗi loại xạ khuẩn là khác nhau

Đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí và ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt [2] Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có độ pH trung tính hay hơi kiềm, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là trong khoảng 28o

C – 30oC Xạ khuẩn không có giới tính [8]

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật Gram dương Tỷ lệ nucleotide Guanine và Cytosine cao (>70%) [6] Cơ thể xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền, hay xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này đã tạo

ra tính đa dạng về hình thái của xạ khuẩn, tính kháng thuốc do xuất hiện các

dị vòng, sự tự nhân lên của các đoạn ADN

1.1.5 Sự hình thành bào tử

Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh (cuống sinh bào tử) Cuống sinh bào tử có thể có dạng thẳng, dạng hơi cong hay dạng lò xo Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hay ngắn với các

Trang 16

dạng lông cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài Bào tử xạ khuẩn hình thành trên suốt chiều dài của cuống sinh bào tử theo cách kết đoạn hay cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình oval, hình cầu, hình trụ Ở một số loài xạ khuẩn, bào tử của chúng hình thành các mấu lồi (dạng mụn cơm, dạng gai, dạng lông)[6]

Theo cách kết đoạn, ban đầu, các hạt crômatin trong tế bào chất được phân bố đều khắp cuống sinh bào tử theo một khoảng cách nhất định Sau đó, các tế bào chất co lại và bao quanh crômatin tạo thành một khối (tiền bào tử) Tiền bào tử được bọc theo màng riêng và biến thành bào tử Như vậy, mỗi bào tử chứa một crômatin [8]

Theo cách cắt khúc, cuống sinh bào tử hình thành các vách ngăn ngang Các chất nhân được phân chia tạo thành các hạt crômatin Các hạt crômatin phân bố dọc theo cuống sinh bào tử Tế bào chất bao quanh các hạt crômatin này để tạo thành tiền bào tử Sau đó, từ các tiền bào tử này, bào tử được hình thành [8]

Quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn cũng phụ thuộc vào nhiệt độ,

độ ẩm, môi trường dinh dưỡng

Chẳng hạn, khi Kalakoutski và Agre (1973) nghiên cứu 6 chủng S

griseus, họ đã nhận thấy: muốn kích thích tạo thành khuẩn ty khí sinh thì cần

bổ sung vào môi trường các chất pepton, glixerin và NaCl Một số nhà khoa học cũng cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trường nuôi cấy xạ khuẩn cũng sẽ kích thích sự hình thành bào tử của chúng Tuy nhiên, lượng các nguyên tố được bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng chỉ được trong một giới hạn nhất định Nếu môi trường quá giàu dinh dưỡng, quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn thường sẽ bị kìm hãm

Ở các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh thuộc chi

Streptomyces, khả năng sinh chất kháng sinh của chúng có mối quan hệ đến

sự hình thành bào tử Nhiều trường hợp, khi bị kích thích hình thành bào tử, hiệu suất sinh chất kháng sinh bị giảm đi Khi nghiên cứu đột biến và chọn chủng xạ khuẩn sản xuất oxytetraxiclin, streptomixin, người ta thấy nếu sự

Trang 17

hình thành bào tử kém thì khả năng tạo chất kháng sinh lại tăng lên Đặc điểm này của xạ khuẩn là rất quan trọng khi nghiên cứu chọn lọc chủng xạ khuẩn sản xuất chất kháng sinh [6].

1.2 Phân loại xạ khuẩn

1.2.1 Lịch sử phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn là những loại vi sinh vật có khả năng sản sinh ra nhiều chất

có hoạt tính sinh học như enzyme, vitamine, kháng sinh,…Những hoạt chất này có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đời sống xã hội cũng như trong nền kinh tế quốc dân Trong y học, chúng có thể dùng để chữa hay phòng chống bệnh cho con người; trong chăn nuôi, chúng cũng được sử dụng

để trị bệnh cho vật nuôi; trong trồng trọt, chúng là tác nhân phòng trừ và chống lại các dịch hại cho cây trồng; trong công nghiệp thực phẩm, chúng lại

là chất bảo quản, làm tăng thời hạn sử dụng lâu dài cho thực phẩm đóng hộp,…và chúng cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác Chính vì những tác dụng to lớn của xạ khuẩn và các hoạt chất do chúng sinh ra nên xạ khuẩn đã được nhiều nhà khoa học quan tâm, chú ý đến Họ là những nhà khoa học của nhiều lĩnh vực như vi sinh học, sinh hóa học, di truyền học,… Được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thông qua nhiều công trình nghiên cứu, nhiều thí nghiệm, nhiều chủng xạ khuẩn đã được phát hiện ra

Những loài xạ khuẩn được tìm ra sớm nhất là Actinomyces hart (1870), các loài xạ khuẩn kị khí Actinomyces israeli (1889) Tuy nhiên, khi đó chưa

có những phương pháp có thể bảo quản chủng giống lâu dài, nhiều chủng đã

bị thất lạc Do vậy, những chủng còn có thể lưu lại được biết sớm nhất là các chủng mà Waksman đã tìm ra

Tuy nhiên, cùng với thời gian, số lượng xạ khuẩn được phát hiện và phân lập ra ngày càng nhiều Tình trạng lẫn lộn giữa các loài mới được phát hiện với các loài đã phát hiện trước rất phức tạp Xuất phát từ tình hình thực

tế đó, các nhà khoa học, trong quá trình nghiên cứu của mình, đã cố gằng sắp xếp và tìm ra những khóa phân loại theo ý mình để tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu

Trang 18

Năm 1914, lần đầu tiên, Krainski đã đưa ra các chỉ tiêu cho việc phân loại các loài khác nhau Nguyên tắc phân loại của ông là coi trọng đặc điểm

sinh lý Từ đó, ông đã phân loại được 17 chủng thuộc chi Actinomyces

Waksman (1919) lại coi đặc điểm hình thái của bào tử là quan trọng của các

cá thể, và ông cũng đã đưa ra những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình Năm 1953, Baldacci và cộng sự công bố khóa phân loại chi

Streptomyces dựa trên mầu sắc khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, và một

số đặc điểm trung gian khác 1943, Waksman và Henrici đưa ra hệ thống phân loại mới, đến năm 1961 thì sửa đổi lại Trong hệ thống này, xạ khuẩn được chia thành 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi Krassinikov đã đưa ra hệ thống phân loại của mình vào năm 1970 Trong đó, xạ khuẩn được chia thành 6 họ, gồm

26 chi Năm 1957, Gauze cùng với các cộng sự của mình đã công bố một hệ thống phân loại mới Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn

ty cơ chất, hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử Nhờ sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp mới đã được øng dụng để tìm ra các loài xạ khuẩn mới nhằm phát triển công nghệ sản xuất chất kháng sinh Cùng với nó,

số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày càng nhiều lên: Praceser (1968), Arai (1969), Küster (1972), Pridham (1974), Nonomura (1974), Szabó (1975),…

Ngày nay, sự phát triển của sinh học phân tử cũng đã làm thay đổi về

cách phân loại Chẳng hạn, chi Norcadia được các nhà phân loại đánh giá là

dị nhân (heterogeneous) Do đó, về mặt di truyền, họ đã xếp loài Norcadia

mediterranci sinh rifamixin vào chi Streptomyces và có tên mới là S mediterranci Nhờ sự phát triển của khoa học máy tính, phương pháp phân

loại số được sử dụng để có khả năng phân loại nhanh và chính xác về di truyền phân tử, đồng thời cũng đưa thêm các đặc điểm phân loại và phát sinh chủng loại vào Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu dùng trong phân loại xạ khuẩn vẫn là dựa vào các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý-sinh hóa, miễn dịch, sinh học phân tử

Trước đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh

Trang 19

luận giữa các nhà vi sinh vật học, do nó vừa có những đặc điểm giống vi khuẩn vừa có những đặc điểm giống nấm Tuy nhiên, đến nay xạ khuẩn đã được chứng minh là vi khuẩn với những bằng chứng sau đây [2]:

1 Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Norcadia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacilus và Corynebacterium

2 Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa chất nhiễm sắc phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

3 Đường kính của khuẩn ty xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn Đồng thời khuẩn ty xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn

4 Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như ở vi khuẩn trong khi đó nấm không bị tấn công bởi các thực khuẩn thể

5 Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen

6 Xạ khuẩn không chứa chất chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều loài nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời, giống như ở phần lớn vi khuẩn,

xạ khuẩn không chứa cellulose

7 Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường, đặc điểm này không có ở nấm

8 Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes

cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

1.2.2 Theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Dựa vào đặc điểm hình thái, người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:

1 Nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt

Nhóm này có đặc trưng là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất

2 Nhóm xạ khuẩn có các bào tử nang

Đặc trưng của nhóm xạ khuẩn này là khuẩn ty phân chia theo các hướng vuông góc với nhau

Trang 20

3 Nhóm xạ khuẩn dạng Norcadia

Nhóm này sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ty

4 Nhóm xạ khuẩn tương tự Corynebacter và dạng cầu

Tế bào của nhóm xạ khuẩn này có dạng hình chữ V, T hay dạng cầu Thông thường, chúng không có khuẩn ty

Ngoài đặc điểm hình thái của xạ khuẩn, đặc tính nuôi cấy của xạ khuẩn cũng được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại Đó là màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn, màu sắc khuẩn ty, sự hình thành sắc tố tan trong quá trình nuôi cấy xạ khuẩn Gauze đã cho rằng, màu sắc của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất

có vai trò quan trọng để phân chia các loài của Actinomyces Sự tạo thành sắc

tố melanin cũng được coi là một trong các tiêu chuẩn phân loại xạ khuẩn

Waksman đã chia Actinomyces thành các nhóm melanin dương tính và

melanin âm tính [1]

Việc phân loại xạ khuẩn theo đặc điểm hình thái thường có hiệu quả không cao Bởi vì, cùng một loài xạ khuẩn có thể có các biểu hiện hình thái khác nhau do biến dị tự nhiên Những loài khác nhau cũng có thể có hình thái giống nhau Do vậy, để chính xác hơn trong việc phân loại xạ khuẩn, người ta

bổ sung thêm một số tính chất khác như đặc điểm sinh lý, sinh hóa,…

1.2.3 Theo đặc điểm hóa học

Phân loại theo đặc điểm hóa học là một phương pháp có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng các thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật, dựa vào các đặc điểm:

- Kiểu thành tế bào: dựa trên cơ sở phân tích axít amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Kiểu peptidoglycan: dựa vào thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của peptidoglycan , của cầu nối peptit và cách liên kết giữa các mắt xích của peptidoglycan

Steiner (1974) đã chia các peptidoglycan thành hai nhóm cơ bản A và

B Nhóm A gồm các peptidoglycan có liên kết chéo giữa hai mạch tetrapeptit

Trang 21

qua axit diaminopimelic ở vị trí thứ 3 và thứ 4 Nhóm B gồm các phân tử hình thành liên kết chéo qua nhóm cacboxyl của pentaglixin và alanin tại vị trí 2 và

4 Ngoài ra, sự khác nhau về axit ở vị trí 3 của chuỗi peptidoglycan có kí hiệu

A1, A2,…cũng được kể đến

- Axit mycolic: là các phân tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi

Norcadia, Rhodococus, Mycobacterium, Corynebacter Đặc điểm này là yếu

tố cơ bản cho việc phân loại xạ khuẩn thuộc các chi trên

- Axit béo: thường sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa mạch phân nhánh kiểu iso- và enteiso được metyl hóa

1.2.4 Theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Người ta phân loại xạ khuẩn theo đặc điểm này là dựa vào các tiêu chí như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme, mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu đựng đối với các điều kiện của môi trường: khả năng chịu muối,…; mối quan hệ đối với các chất kìm hãm sinh trưởng, phát triển khác nhau, tính đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn dễ bị biến động Do vậy, giá trị trong việc phân loại của nó

là không cao (Hopwood- 1975)

1.2.5 Theo phân loại số

Phương pháp này được sử dụng để khắc phục tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn Phân loại số đã được Williams và các cộng sự sử

dụng để phân loại chi Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi Cơ sở của

Trang 22

phương pháp này là dựa vào sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm như đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa,… của xạ khuẩn

Công thức tính hệ số giống nhau S giữa 2 chủng được Sneath đề xuất:

d s

s

N N

N

%

Ns: tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh

Nd: tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia

Tác giả Sokal và Mitchener lại đề nghị công thức sau:

Từ đó, nhờ thuật toán, các chủng xạ khuẩn chưa biết sẽ được xác định

1.2.6 Theo sự phát sinh chủng loại

Nhờ sự sắp xếp lại phát sinh chủng loại của sinh vật mà xác định được

hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn Các nghiên cứu ở mức độ di truyền học

và di truyền biểu sinh (epigenetic) nhằm mục đích xây dựng một cây phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN và protein Quan trọng nhất là thứ tự sắp xếp oligonucleotit của ARNr 16S 3 phương pháp thường dùng là lai ADN, lai ARN và phân tích ARNr 16S Lai axit nucleic là phương pháp xem xét sự đồng nhất chung về sự sắp xếp của chuỗi nucleotit Kết quả được biểu hiện bằng số phần trăm sự đồng nhất Phân

SA-B =

ns+ + n

s-ns+ +ns- + nd

Trang 23

tích ARNr 16S để liệt kê thứ tự các nucleotit đặc trưng của cá thể và so sánh với bảng liệt kê của cơ thể khác để xác định mức độ giống nhau giữa chúng

1.2.7 Phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP)

Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) được bắt đầu từ năm 1963, quy tụ các nhà khoa học từ hơn 40 phòng thí nghiệm của 18 quốc gia trên thế giới Lần đầu tiên, một bộ các tiêu chuẩn phân loại xạ khuẩn đến loài được đưa ra Các tiêu chuẩn này được hiểu và giải thích như nhau ở các nhà nghiên cứu của các nước khác nhau trong cùng một điều kiện (đến một mức độ nào đó) Các tiêu chuẩn và phương pháp miêu tả loài theo ISP như sau:

- Mầu khuẩn ty khí sinh (sau khi sinh bào tử)

- Hình thái cuống sinh bào tử ,

- Sự hình thành melanin,

- Sự hình thành sắc tố hòa tan,

- Màu khuẩn ty cơ chất,

- Sử dụng các nguồn hydrat cacbon

Bốn tiêu chuẩn đầu được gọi là “nhóm thứ nhất”, còn sự tạo thành sắc

tố hòa tan và đồng hóa các loại đường là “nhóm thứ cấp”

1.3 Một số sản phẩm trao đổi chất quan trọng của xạ khuẩn

1.3.1 Kháng sinh và cơ chế hình thành chất kháng sinh của vi sinh vật

Trong tự nhiên (môi trường sống), sự sinh tồn và phát triển của các cá thể sống phụ thuộc rất chặt chẽ vào các nguồn thức ăn và mối quan hệ giữa chúng với nhau Các vi sinh vật cũng không nằm ngoài qui luật đó Do đó, để tồn tại được, chúng luôn luôn phải đấu tranh giành nguồn thức ăn, không gian phát triển, oxy,… và nói chung vì tất cả những gì cần thiết cho sự phát triển của chúng Pasteur đã khẳng định mối quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật

là hiện tượng phổ biến Trong tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ mới trong đấu tranh sinh tồn của vi sinh vật trong quần thể Hiện tượng đối kháng

là loại vi sinh vật này kiềm chế hoặc vô hiệu hóa khả năng sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật khác Nó liên quan chặt chẽ với đấu tranh sinh tồn, là

Trang 24

nhân tố giúp đỡ xác định khả năng biến dị và liên quan đến loài của vi sinh vật

Một trong những thể hiện của tính đối kháng là khả năng sinh chất kháng sinh của vi sinh vật Để có thể tồn tại, sinh trưởng và phát triển được thuận lợi hơn, một loại vi sinh vật nào đó sẽ đưa ra sản phẩm trao đổi chất của mình nhằm tạo ra điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của các loại sinh vật khác Các sản phẩm này được gọi chung là chất kháng sinh Chất kháng sinh có nhiều định nghĩa khác nhau Theo Semiakin và Khokhlov, chất kháng sinh là tất cả các sản phẩm trao đổi chất của cơ thể sống có tác dụng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi khuẩn, virut, protozoa, tế bào ung thư,…) một cách chọn lọc, ngay cả ở nồng độ thấp

Nhiều nhà khoa học đã đưa ra các giả thuyết về sự hình thành các chất kháng sinh từ vi sinh vật Có 2 giả thuyết về sự tạo thành chất kháng sinh

Theo giả thuyết thứ nhất, sự tạo thành chất kháng sinh như là một đặc tính đặc biệt trong sự trao đổi chất của vi sinh vật Nó gắn chặt và tồn tại trong suốt quá trình tiêu hóa Sự tạo thành và tách chất kháng sinh ra ngoài môi trường sống hoặc sau khi chúng bị chết có thể là một hiện tượng để tồn tại [3] Những nhà khoa học ủng hộ giả thuyết này là Красилников, Gauze, Grosdar

Theo giả thuyết thứ hai, các chất kháng sinh được tạo thành do vi sinh vật là một đặc tính ngẫu nhiên Nó hoàn toàn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Nó chỉ xảy ra trong những điều kiện nhất định và không liên quan gì đến tiêu hóa Cơ sở của giả thuyết này là không phải mọi vi sinh vật đều có thể sinh ra chất kháng sinh và các chất kháng sinh đều dễ bị phân hủy, đồng thời

bị mất khả năng đối kháng.Waksman là nhà khoa học đại diện cho giả thuyết

này [3]

1.3.2 Phân lập xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ tự nhiên

Để phân lập được các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ tự nhiên,

ta cần tuân theo một qui trình tuyển chọn nhất định và có hệ thống Các bước cần thiết để phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh :

Trang 25

1) Thu các mẫu đất, bùn, nước,…từ các môi trường khác nhau Tách lấy các chủng xạ khuẩn thuần khiết

2) Thử khả năng ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định của các chủng thuần khiết

3) Chọn lấy các chủng có hoạt tính kháng khuẩn để nghiên cứu tiếp: lên men, tách chiết và thử hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng sinh

4) Thử độc tính và hoạt phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh

5) Nếu chất kháng sinh là loại cần tìm thì lên men với lượng lớn, tinh chế và thu hồi chúng

6) Xác định tính chất hóa lý và sinh học Làm lại các thí nghiệm nếu chất kháng sinh đạt yêu cầu

Các chất kháng sinh nhất thiết không độc với người và gia súc

1.3.3 Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn

Mỗi loại chất kháng sinh khác nhau thì phổ kháng khuẩn của chúng cũng khác nhau Loại ức chế được các vi khuẩn Gram(+), loại chỉ ức chế được

vi khuẩn ), có loại thì có thể ức chế được cả vi khuẩn Gram(+), ) và cả nấm men, nấm mốc Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh cũng được

Gram(-coi là một yếu tố dùng để phân loại xạ khuẩn

Phân loại các chất kháng sinh

- Monobactam: do loài vi khuẩn Chromobacterium violaceum thuộc

nhóm Gram(+) sinh ra Chất kháng sinh tiêu biểu là Aztreonom có khả năng ức chế vi khuẩn Gram(-)

- Xephalosporin: nhân cấu trúc là axit 7- aminoxephalosporanic, do các

loài thuộc chi Acremonium sinh ra

Trang 26

- Cacbapenem (thienamixin): loại chất kháng sinh có hoạt phổ kháng

khuẩn rộng do Streptomyces cattleyx sinh ra Nó có khả năng chống lại

cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-)

2 Nhóm polypeptit

Các chất kháng sinh thuộc nhóm này có thành phần hóa học bao gồm

chuỗi axit amin Đặc trưng là Baxitraxin và polymixin

3 Nhóm amino glucozit

Đặc điểm tiêu biểu của các chất kháng sinh thuộc nhóm này là có chứa aminosaccaroza và có cấu trúc vòng aminoxiclitol Hoạt phổ của nhóm chất kháng sinh này rộng, ức chế vi khuẩn Gram(-), một số ức chế được cả nấm

Chẳng hạn, chất kháng sinh Kasugamixin có thể ức chế nấm Piricularia và vi

khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa

4 Nhóm tetraxiclin

Đặc trưng về cấu tạo hóa học của nhóm này là chứa vòng naphtalen Mỗi một nhóm chất hóa học khác nhau đính vào vòng naphtalen sẽ tạo ra một chất kháng sinh mới Hoạt phổ kháng khuẩn của nhóm chất kháng sinh này rộng Tiêu biểu là Clotetraxiclin, oxytetraxiclin, tetraxiclin, doxixiclin, minoxiclin,…

5 Nhóm macrolit

Tiêu biểu là erythromixin Chất kháng sinh thuộc nhóm này chứa vòng lacton lớn nối với aminosaccaroza Chúng có hoạt phổ tương tự penixilin nhưng không bị penixilin phân hủy Do đó, trong công tác chữa bệnh, chúng

thường hay được sử dụng thế cho penixilin

6 Nhóm polien

Các chất kháng sinh nhóm này có 3 hay nhiều nối đôi hóa trị giữa các

nguyên tử cacbon Tiêu biểu là nistatin và amphoterixin

7 Các chất kháng sinh khác

Tiêu biểu là Cloramphenicol Chất kháng sinh này do loài S.venezuelac

sinh ra, hoạt phổ kháng khuẩn rộng Cấu trúc hóa học của nó đơn giản nên người ta có thể tổng hợp nó bằng phương pháp hóa học

Trang 27

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn

1 Thành phần môi trường

- Nguồn cacbon: với mỗi chủng xạ khuẩn khác nhau thì nhu cầu về nguồn cacbon là khác nhau Do đó, tùy thuộc vào từng chủng, ta cần chọn nguồn cacbon thích hợp cho chúng: các loại đường đơn (glucoza, fructoza,…), các loại đường kép như saccaroza, maltoza, lactoza, ; các loại tinh bột, các sản phẩm có thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch, Nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylaza cao thì nguồn cacbon thích hợp cho chúng là tinh bột Hostalek nhận thấy khi sản xuất oxytetraxiclin, hiệu suất thu kháng sinh giảm đi nếu có glucoza trong môi trường trong thời gian nhân giống Điều này xảy ra là do glucoza đã làm tăng lượng axit hữu cơ như axetat và piruvat, nó cũng làm tăng hàm lượng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty, làm thay đổi hoạt tính enzyme phân giải glucoza và pentoza

- Nguồn nitơ: trong quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh, xạ khuẩn luôn luôn cần đến cả hai nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ Nguồn nitơ thích hợp đối với xạ khuẩn là các hợp chất từ xạ khuẩn như bột đậu tương, bột hạt bông, bột đậu xanh Cùng với muối amôn, cao ngô là nguồn bổ sung cho cả nitơ amon và protein Tuy nhiên, lượng photphat vô cơ có trong cao ngô sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn

- Nguồn photphat vô cơ: Nếu nồng độ photphat ban đầu cao, nó sẽ làm tăng lượng axit nucleic trong khuẩn ty Do đó, pha sinh trưởng của khuẩn ty

sẽ bị kéo dài, pha tổng hợp kháng sinh rút ngắn lại, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh sẽ giảm hoặc ngừng lại Nếu photphat dư thừa, nó cũng sẽ gây ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp, làm giảm khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh Tuy nhiên, cũng có loài xạ khuẩn cần có lượng photphat

cao hơn như Nocardia uniormic, cần nồng độ photphat vô cơ từ 100 ÷ 200

mµ/ml để sinh nocardixin

2 Điều kiện nuôi cấy

Trang 28

- Thông khí: nhu cầu về oxy của xạ khuẩn cao hơn so với các vi sinh vật khác, nhất là ở giai đọan nhân giống Do vậy, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men các chất như benzilthioxianat,… để nâng cao lượng oxy hòa tan

- Nhiệt độ: phần lớn xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt ở 28÷30oC Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng 18÷28o

C

- pH môi trường: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh tổng hợp chất kháng sinh là rất lớn, pH thích hợp thường là trung tính Dải pH cho phép đối với chủng sinh trưởng lớn hơn pH tối ưu cho hoạt tính sinh tổng hợp chất

kháng sinh Chẳng hạn, đối với chủng S aureofaciens, pH từ 4,2÷8,0 (tối ưu

là 6,6÷6,8) cho sinh trưởng và 5,5÷6,5 (tối ưu là 5,8÷6,0) cho sinh tổng hợp kháng sinh

- Môi trường nhân giống: Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh không những phụ thuộc vào các điều kiện lên men mà nó còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử, giống sinh dưỡng

Môi trường nhân giống thường kém dinh dưỡng hơn môi trường lên men Tuy nhiên, cũng có trường hợp môi trường nhân giống giầu dinh dưỡng

hơn thì khả năng hình thành chất kháng sinh cao hơn Ví dụ, chủng S

anreofaciens LSB-2201 có khả năng sinh chất kháng sinh nhiều nhất là 24

giờ Thời gian nuôi còn phụ thuộc vào từng chủng và bào tử giống Lượng giống cấy truyền sang môi trường lên men phụ thuộc vào từng chủng xạ khuẩn và thành phần môi trường nhân giống

1.4 Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.4.1 Đặc điểm phân loại

Phân loại Staphylococcus theo khoa học

Trang 29

Giống: Staphylococcus

Loài: aureus

Tên khoa học: Staphylococcus aureus

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính : tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không có men coagulase

Tụ cầu không có men coagulase: do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà Trên lâm sàng

thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng (S epidermidis S

saprophyticus )

Tụ cầu có men coagulase: Nhờ có men coagulase mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn này

còn gọi là tụ cầu vàng Vi khuẩn quan trọng của nhóm này là Staphylococcus

aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng

1.4.2 Đặc điểm sinh vật học

1.4.2.1 Hình thái và tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,8 – 1, ở canh thang thường hợp thành từng cụm nhỏ như chùm nho, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian Trong bệnh phẩm vi khuẩn hợp thành từng đôi hoặc đám nhỏ Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ

Hình 1.1 Hình thể Staphylococcus aureus

Trang 30

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 –

450C và nồng độ muối cao tới 10% Thích hợp được ở điều kiện hiếu khí và

kỵ khí

Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính là 1 – 2mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 370C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh

Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysis) : α, β, δ, ε, γ Trên môi trường canh thang : Tụ cầu vàng làm đục, để lâu nó có thể lắng cặn

1.4.2.2 Đặc tính và yếu tố độc lực

Staphylococcus aureus có enzyme Coagulase Enzyme này có bản chất

là protein, gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hoá quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm (clumping factor), một enzyme vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó Tính chất này là yếu tố sinh bệnh cực kỳ quan trọng và yếu tố đó cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán

Coagulase tạo huyết cục trong tĩnh mạch và gây nhhiễm khuẩn huyết

Có hai loại Coagulase:

- Coagulase cố định trên thân vi khuẩn, phát hiện bằng phản ứng đông huyết tương trên lam kính, nhưng cho kết quả âm tính 10-15%

- Coagulase tự do, phát hiện bằng phản ứng đông huyết tương trên ống nghiệm Trường hợp phản ứng đông huyết tương trên lam kính âm tính phải làm lại trên ống nghiệm

Enzyme chuyển hóa đường manit : S aureus có khả năng chuyển hóa

đường manit, phát hiện trên môi trường schapman (môi trường gồm có đường manit, natriclorua nồng độ 6,5%, chỉ thị màu đỏ phenol), vi khuẩn lên men đường làm chuyển màu môi trường từ đỏ da cam sang màu vàng)

Catalase phân hủy hydrogen peroxide tạo bởi quá trình thực bào (H2O2→

H2O + O2) Tính chất này giúp phân biệt tụ cầu vàng với các cầu khuẩn Gram dương khác

Trang 31

Hyaluronidase : enzyme này có khả năng phá huỷ chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức

Hemolysine và leukocidine : phá huỷ hồng cầu (gây tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào

Exfoliatine : là các enzyme phá huỷ lớp thượng bì Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu

Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn

- Vỏ polysaccharide : một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide

Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

- Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với thành mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hoá : chúng là các receptor cho các đại thực bào Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào

Hình 1.2 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

- Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

Trang 32

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc : là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng

- Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase ( lactamase) Men này phá huỷ vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicillin G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

beta-1.4.2.3 Khả năng đề kháng

Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hoá chất cao hơn các

vi khuẩn không có nha bào khác Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường bị chết ở 600C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450

C) mà

vi khuẩn có thể phát triển Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường

1.4.2.4 Sự kháng kháng sinh

Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu

ý Đa số tụ cầu kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen R-plasmid Một số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin resistance S Aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay, một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với Cephalosporin các thế hệ Kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin

1.4.2.5 Khả năng gây bệnh

Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da Vi khuẩn này gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố độc lực

Tụ cầu vàng cư trú trên người lành (20-40%), gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi Bệnh do tụ cầu có thể lan truyền trực tiếp nhưng thường gián tiếp qua không khí, đồ dùng, dụng cụ, thức ăn Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau

Trang 33

- Các chủng vi sinh vật kiểm định: chủng vi khuẩn Staphilococcus

aureus, Bacillus subtillis và chủng nấm Fusarium oxysporum do Phòng Di

truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

- Hóa chất: Glucoza, arabinoza, saccaroza, manitol, fructoza,

xenluloza, thạch,

- Thiết bi : Máy lắc Vortex, cân phân tích 10-4g, kính hiểm vi quang học, máy lắc, tủ ấm ,

2.1.2 Môi trường ( g/l )

Tinh bột tan: 20g K2HPO4: 0,5g

3 Môi trường ISP- 1:

Cao thịt: 5 g Cao nấm men: 3g

Trang 34