Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

PHẦN MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương… chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng[173,174,175] Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [49,152,187,189] Việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ thực vật rất đa dạng Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với

1231 tên thương phẩm [61] Song việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái

Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn thất nặng nề đến năng suất cây trồng Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%[61] Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã sử dụng một số chế phẩm kháng sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin, blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại

Xuất phát từ những yêu cầu đó, xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước

ta, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ”Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất

kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam Đề tài tập trung nghiên

cứu các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất; đưa ra quy trình sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp.Việc tiến hành đề tài này

là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng

chống các bệnh thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xâydựng một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam

2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

• Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ xạ khuẩn của Việt Nam

• Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh nhất theo phương pháp sinh học phân tử

• Tách chiết và phân lập chất kháng sinh

• Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh

• Thăm dò khả năng ứng dụng

3 Những điểm mới và thành công của đề tài

• Đây là công trình đầu tiên về một chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có nguồn gốc từ xạ khuẩn được nghiên cứu đến mức độ cấu trúc phân tử

mốc trắng do Sclerotium rolfsii, khô vằn do Rhizoctonia solani gây ra có

được những kết quả rất khả quan

4 Bố cục luận án

Luận án gồm 149 trang, 23 bảng số liệu, 25 hình vẽ, 189 tài liệu tham khảo tiếng Việt và tiếng Anh Bố cục luận án gồm: mở đầu (2 trang), tổng quan (46 trang), phương pháp nghiên cứu (24 trang), kết quả và thảo luận (56 trang), kết luận (2 trang), tài liệu tham khảo (19 trang)

PHẦN NỘI DUNG CHÍNH Chương 1 Tổng quan 1.1.Giới thiệu về chất kháng sinh

Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26

tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008 Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân

Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt với “kỷ nguyên hậu kháng sinh” (post antibiotic era) Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn Công nghiệp CKS đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.[113]

Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn

đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu) Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129] Như vậy, sau hơn 70 năm kể

từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [46] Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học

1.2 Cơ chế tác dụng của chất kháng sinh

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những

vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu trúc hiển vi của tế bào Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có

cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có hoạt phổ tương tự như nhau

1.3 Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi và đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên [139] Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá hợp chất trong đất, trong nước Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất

có khả năng sinh chất kháng sinh

1.4 Sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp lên men chìm trong nồi lên men có khuấy liên tục và sục khí Có hai hình thức lên men theo mẻ và lên men liên tục, được mô tả trong tài liệu [46] Hai yếu tố quan trọng nhất trong quá trình xử lý sau lên men là: đặc tính hóa lý của phân tử cần được tách chiết và tinh sạch (đó là trọng lượng phân tử (MW), sự phân cực của phân tử, sự tích điện của các ion) và nồng độ của chất cần tinh sạch có trong dịch nuôi cấy Nhìn chung, đặc tính sinh lý của phân tử có thể xác định nhờ một số phương pháp sắc ký như: trao đổi ion, lọc gel, tách phân lớp hay phương pháp hấp phụ Nồng độ của phân tử cần xác định có trong dịch lên men thường rất ít, đối với một chủng hoang dại khi lên men thì nồng độ CKS thường từ 0,1-10μg/ml Còn đối với một quá trình lên men chuẩn thì nồng độ là 300-600μg/ml Tùy theo khả năng sinh kháng sinh của từng chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch lên men là có thể đủ cho việc xác định phổ hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các dữ liệu về cấu trúc phân tử trong database.[46,48]

1.5 Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh

Tinh sạch các chất trao đổi từ vi sinh vật là một quá trình phức tạp, đòi hỏi rất nhiều kỹ thuật, do các chất này rất đa dạng về cấu trúc hoá học nên trọng lượng phân tử rất khác nhau Chúng có thể tan trong nước hay tan trong các dung môi hữu cơ tuỳ theo đặc tính của từng chất Thường những chất tan trong dung môi hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước Những chất khó tinh sạch nhất là những chất dễ tan trong nước, trung tính hoặc lưỡng tính Phương pháp trao đổi ion rất hiệu quả đối với những chất tan trong axit hoặc kiềm và không hiệu quả đối với

những chất tan trong dung môi hữu cơ Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp rất hữu dụng trong việc tách chiết các chất trao đổi từ vi sinh vật

1.6.Các bệnh thực vật do vi nấm gây ra và các chất kháng sinh được sử dụng trong nông nghiệp

Hàng năm thế giới thiệt hại do bệnh cây khoảng 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu (chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp của thế giới), trong đó bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83% [15,105, 111,116,121,180]

Vi nấm là vi sinh vật có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do quá trình phát tán bào tử nhờ gió hoặc nước, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc hạt giống Ngoài ra nó còn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông qua bộ rễ Cây có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm, bao gồm cả những loại nấm ký sinh không gây hại đến cây, nhưng phần lớn là các loại nấm gây hại cho cây trồng Sự nhiễm bệnh do nấm có thể xẩy ra ở một giai đoạn phát triển nào đó của cây và tuỳ theo chủng nấm gây bệnh mà triệu chứng bệnh có thể được biểu hiện ở các mức độ khác nhau [18,51,66]

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn Thế giới đã bỏ ra nhiều năm để điều tra tình hình sử dụng chất kháng sinh trong việc ngăn chặn các bệnh ở thực vật Mặc dù rất nhiều chất được tìm kiếm và phát hiện ra nhưng chỉ một số ít được sử dụng trong thực tiễn

Những thành tựu to lớn thu được trong việc sử dụng CKS chống bệnh truyền nhiễm vào những năm 40 của thế kỷ 20 đã mở ra xu hướng đầy triển vọng trong sử dụng CKS bảo vệ thực vật CKS là một trong các hợp chất thiên nhiên lý tưởng có nhiều ưu việt trong việc phòng chống các bệnh cho cây trồng Vì vậy, việc phân lập xạ khuẩn để tìm kiếm các CKS mới trong bảo vệ thực vật đã, đang

và sẽ vẫn là một vấn đề thời sự hấp dẫn cho các nhà khoa học ở nhiều chuyên ngành khác nhau

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu

Các mẫu cây bị bệnh dùng để phân lập nấm gây bệnh, một số mẫu đất phân

bố ở một số vùng trên cả nước để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

™ Các phương pháp cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vật sinh kháng sinh

™ Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo Bergey và ISP

™ Phương pháp tách chiết ADN theo Saito và Mura

™ Phương pháp phân tích trình tự ADNr 16S theo Sanger

™ Lên men, tách chiết CKS theo Donald B Borders

™ Xác định cấu trúc hoá học của CKS Phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS)

Chương 3 Kết quả nghiên cứu 3.1 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

3.1.1 Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn

Từ 71 mẫu đất lấy ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 508 chủng xạ khuẩn Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất được trình bày ở bảng 3.1 Mặc dù ở đây chúng tôi không đi sâu vào nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn trong đất, tuy nhiên có thể thấy số lượng xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú Tuỳ thuộc vào tính chất đất và ở các

địa điểm khác nhau, số lượng xạ khuẩn (Streptomyces) có thể dao động từ 1,5.104

đến 5,6.108 CFU/ g đất

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân chia theo nhóm màu

của Shirling và Gottlieb (hình 3.1) Số lượng xạ khuẩn nhiều nhất vẫn là nhóm xám chiếm 39% tổng số các chủng phân lập, sau đó là đến nhóm trắng chiếm 22,8% và nhóm hồng 20,2%, nhóm xanh da trời 5,3% cuối cùng ít nhất vẫn là nhóm xanh lục chiếm 2,9% Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây

Tû lÖ x¹ khuÈn ph©n theo nhãm mµu

0 10 20 30 40 50

Nhãm mµu

Tr¾ng (W) X¸m (Gr) Đỏ (R) Vµng (Y) Lôc (Gn) Xanh da trêi (B)

[7] Ở đất than bùn, số lượng xạ khuẩn nhóm xám chiếm 61,8% trong tổng các nhóm, ở đất podsol (đất axit) chiếm 59,64% còn đất kiềm (carbonat) chiếm 35,4%

Hình 3.1 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu

Tỷ lệ kháng vi khuẩn Gram (+) bao giờ cũng cao nhất, chiếm 23,2%, sau đó mới đến vi khuẩn Gram (-) (8,0%) Dựa trên hoạt tính kháng nấm của các chủng, 3 chủng xạ khuẩn được chọn để tiếp tục nghiên cứu là chủng TC-54, D-41 và D-42

Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh

Mục tiêu của chúng tôi là tuyển chọn được chủng xạ khuẩn chống nấm gây

bệnh thực vật, trước hết là F oxysporum gây bệnh thối cổ rễ Bảy chủng có hoạt

tính chống nấm mạnh nhất đã được lựa chọn và được ký hiệu là 54, C-5,

TC-37, BC-54, BC-87, T-41, D-42 Các chủng này thuộc 5 nhóm màu khác nhau Chủng ký hiệu TC-54, T-41 và D-42 đều thuộc nhóm xám, chủng C-5 thuộc nhóm hồng, chủng TC-37 thuộc nhóm xanh da trời, chủng BC-86 thuộc nhóm trắng và

Tû lÖ ph©n tr¨m c¸c chñng cã ho¹t tÝnh kh¸ng sinh

0 5 10 15 20 25 30

chủng BC-87 thuộc nhóm vàng Dựa trên hoạt tính kháng nấm của các chủng, 3 chủng xạ khuẩn được chọn để tiếp tục nghiên cứu là chủng có ký hiệu TC-54, D-

41 và D-42 Chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm phân loại của 3 chủng này

Hình 3.3 Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của các chủng xạ khuẩn

Chủng T-41 có bề mặt bào tử có dạng xù xì (W) và cuống sinh bào tử xoắn (S),

số lượng bào tử trên một chuỗi từ 10-50

Hình 3 4 Bề mặt bào tử

chủng T-41(SEMx15.000)

Hình 3.5 Bề mặt bào tử chủng D-42 (SEMx10.000)

0 10 20 30 40 50 60 70

♦ Chủng D-42: có bề mặt bào tử nhẵn (Sm) và cuống sinh bào tử thẳng (RF) Số lượng bào tử trên một chuỗi từ 10 ÷ 50.

Hình 3.6 Bề mặt bào tử chủng TC-54

(SEMx15.000)

Hình 3.7 Cuống sinh bào tử chủng

TC-54 ( SEMx5000)

dạng xoắn kép (S) Số lượng bào tử trên một chuỗi 10-50

3.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

Chủng T-41 có thể sinh trưởng ở 370C, dải pH cho sinh trưởng có hể từ 5-9, không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt T-41 có khả năng tạo thành một số enzym ngoại bào như amylaza, proteaza và xenlulaza,

có khả năng chịu muối đến 5% Thành tế bào chứa LL-DAP nên thuộc typ I Chủng T-41 không có khả năng sử dụng lactoza, các nguồn đường khác đều có thể

sử dụng được tuy nhiên, mức độ sử dụng mỗi loại đường không giống nhau, trong

đó sử dụng tốt nhất là fructoza và mantoza

tối ưu cho sự sản sinh CKS là: 7,0 ÷7,5 và không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường thạch hữu cơ chứa sắt D-42 có khả năng hình thành một số enzim ngoại bào như amylaza, xenluloza, kitinaza và proteaza, có khả năng sinh trưởng được ở nồng độ muối 8% Chủng này cũng có thành tế bào thuộc typ I

♦ Chủng TC-54: sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - 300 và không sinh trưởng ở 450C Thành tế bào chứa LL-DAP thuộc typ I pH thích hợp cho sinh trưởng là 6-8 Chủng này không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường thạch hữu cơ có chứa sắt

3.2.4 Hoạt tính kháng sinh

kháng nấm mà còn có khả năng chống vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Tuy nhiên,

có thể thấy rằng chủng T41 chủ yếu chống lại được các vi nấm gây bệnh đặc biệt

là F.oxysporum với vòng ức chế là 50mm, còn Rhizoctonia solani là 42 mm,

Penicillium sp là 30mm.

F.oxysporum, Rhizoctonia solani, Penicillium, mà không có hoạt tính kháng các

vi khuẩn kiểm định khác

kháng nấm của chủng này khá mạnh Vòng kháng F oxysporum đạt đến 35mm, kháng T mentagrophytes đạt 44 mm.

Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

3.2.5 Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn

Để có thể phân loại chính xác đến loài, chúng tôi đã tiến hành xác định trình

tự ADNr 16S của 3 chủng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 thạch nghiêng, lấy hai vòng que cấy và tách chiết qua nhiều bước (theo phương pháp tách chiết ADN tổng số như đã nêu) Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agaroza 1% cho thấy trên bản gel thu được băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN

Trong ADN tổng số được tách chiết có gen mã hoá ARNr 16S của các chủng nghiên cứu ADN này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân gen ARNr 16S lên nhiều lần bằng các cặp mồi đã thiết kế Với cặp mồi được thiết

kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen ARNr 16S của E coli thì theo lý thuyết sản

phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500bp Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các băng có kích thước khoảng 1500bp đúng như lý thuyết Băng ADN rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit vivapure theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm PCR được kiểm tra hàm lượng ADN và độ tinh sạch Sau

đó sản phẩm này được khuếch đại tiếp với các mồi và các hóa chất của bộ kit Cycle sequencing để chuẩn bị xác định trình tự Sau đó mẫu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant

1 2 3 4

Trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá cho ARNr 16S được giải bằng máy giải trình tự tự động ABI 3100 Avant của hãng Perkin-Elmer (Mỹ) Sau đó chuỗi trình tự này được so sánh với tất cả các chuỗi nucleotit ADNr 16S đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) bằng chương trình BLAST

Việc phân loại chính xác cần phải xác định thêm một số đặc tính khác nữa như phân tích trình tự ADNr 16S, lai ADN-ADN, và xây dựng cây phát sinh chủng loại Dựa vào kết quả đã được giải trình tự ADNr 16S, vào phần mềm CLUSTAL

1.83 và vào các trình tự đã có sẵn thuộc chi Streptomyces trong ngân hàng gen

(GeneBank), chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại (Hình 3.10)

Nhìn vào cây phát sinh chủng loại, có thể thấy chủng T-41 rất gần gũi với

chủng Streptomyces antimycoticus AY99983 với độ tương đồng 99.9% Hơn nữa,

dựa vào các đặc điểm truyền thống đã được nghiên cứu ở trên, chủng này được

xác định là S antimycoticus và ký hiệu là S antimycoticus T41 Chủng này lần

đầu tiên được Waksman phát hiện vào năm 1957.[113]

Riêng đối với chủng D-42, dựa vào việc phân tích trình tự ADNr 16S thì

thấy: Chủng này giống với chủng Streptomyces diastatochromogenes D63867

nhưng khi phân tích các đặc điểm truyền thống thì chủng D-42 lại có nhiều đặc

điểm giống với chủng S.viridogenes tuy chỉ khác về khả năng đồng hoá đường

Điều này càng chứng tỏ tầm quan trọng của việc phân tích trình tự ADNr 16S, vì chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý sinh hoá thôi, chúng ta chưa thể khẳng định được chính xác tên của loài đó Nhờ vào kết quả phân tích này chúng tôi so sánh

ngược trở lại giữa chủng D-42 và S.diastatochromogenes cho thấy có các đặc

điểm giống và khác nhau như sau: [ 36,113]

Giống nhau: cả 2 chủng này đều thuộc nhóm xám (Gr), bề mặt bào tử nhẵn

(sm), cuống sinh bào tử dạng xoắn, đều có khả năng sử dụng các loại đường giống nhau và đều có khả năng chống nấm tốt

Khác nhau: chủng D-42 có hình thành sắc tố hòa tan, còn chủng

S.diastatochromogenes thì không hình thành, chủng D-42 không hình thành sắc tố